Abstract

O câncer de próstata é uma doença clinicamente heterogêneo, variando de doença assintomática indolentes para metastático muito agressivo e uma ameaça à vida formas da doença. metástases à distância representa a principal causa letal de câncer de próstata. O desafio clínico mais crítico na gestão dos pacientes é identificar aqueles indivíduos em risco de desenvolver a doença metastática. Para entender os mecanismos moleculares da metástase do câncer de próstata e identificar marcadores com potencial metastático, analisamos a expressão da proteína em dois sing�icos câncer de próstata linhagens de células PC3-N2 e PC3-ML2 usando tags isobáricos de rotulagem e quantificação relativa e absoluta identificação de proteínas multi-dimensional tecnologia de matriz de cromatograf ia líquida de dessorção a laser assistida tandem com ionização por espectrometria de massa. PC3-N2 é metastático modesto enquanto PC3-ML2 altamente metastático. Um total de 1.756 proteínas foram identificados nas análises com 130 proteínas que mostram diferentes níveis de expressão (p 0,01) nas duas linhas celulares. Destes, 68 foram encontradas proteínas de ser significativamente regulada para cima enquanto 62 são significativamente regulada negativamente em células PC3-ML2 em comparação com células PC3-N2. A regulação positiva de plectina e vimentina, que foram os mais significativamente diferencialmente expressos foram validados por Western blot e sua relevância funcional com respeito à invasão e migração foi determinada pelo silenciamento do gene siRNA. Para nosso conhecimento, este estudo é o primeiro a demonstrar que a sobre-regulação de vimentina e expressão plectina correlaciona-se positivamente com a invasão e metástase de PCA andrógeno-independente

Citation:. Burch TC, Watson MT, Nyalwidhe JO ( 2013) variável metastático Potenciais correlacionam com plectina Diferencial e Vimentin Expressão em Singênico andrógeno-independente células cancerosas da próstata. PLoS ONE 8 (5): e65005. doi: 10.1371 /journal.pone.0065005

editor: Gnanasekar Munirathinam, da Universidade de Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de setembro de 2012; Aceito: 24 de abril de 2013; Publicado em: 22 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Burch et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos start-up da Eastern Virginia Medical School (EVMS) para Dr. Julius O. Nyalwidhe. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

na Europa e os EUA, o câncer de próstata (CaP) é o câncer mais prevalente entre os homens e a terceira causa mais comum de câncer relacionado ao mortes. Em 2011 havia uma estimativa de 240,890 novos casos e 33,720 mortes pela doença em os EUA [1]. Para as últimas 2 décadas, a detecção precoce e rastreio do CaP foi baseada principalmente na detecção de antígeno específico da próstata (PSA) no soro, além de exame de toque retal (DRE), ea avaliação histológica de ultra-sonografia transretal (USTR) guiado material de biópsia [2]. Embora a maioria dos casos são detectados numa fase precoce, a doença é clinicamente heterogénea, variando de doença assintomática indolentes para metastático muito agressivo e potencialmente fatais formas da doença. Mais de 7% dos casos detectados, eventualmente, desenvolver a doença metastática distante [3]. O prognóstico para esses homens é fraca e eles têm uma sobrevivência média de 24 a 48 meses [3]. O desafio clínico mais crítico para a gestão da doença PCA é para determinar qual destas duas formas diferentes da doença o paciente desenvolver. O local mais comum para CaP metástase é o osso; ~ 90% dos pacientes com CaP avançada têm metástases esqueléticas [4]. Osso metástase PCA é praticamente incurável e está associada com morbidade grave antes da morte, que incluem dor óssea, fraturas patológicas, síndromes de compressão do nervo, e hipercalcemia [4]. Atualmente, as opções de tratamento disponíveis para pacientes com doença metastática são paliativos. O prognóstico /diagnóstico de lesões metastáticas ósseas é actualmente determinada pela imagem usando isótopos de cintilografia óssea, tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (RM), ou biópsia óssea. A identificação de biópsia da próstata ou biomarcador com base de soro (s) para prever a susceptibilidade dos homens de desenvolver metástases potencialmente discriminar melhor as formas metastáticas mais agressivas da doença e, assim, proporcionar um melhor tratamento e de oportunidades de gestão clínica para a doença.

ao longo dos anos o utilitário de PSA como marcador para o cancro da próstata tem sido alvo de controvérsia no que diz respeito à sua incapacidade para distinguir indolente de formas agressivas da doença [5], [6]. PSA também está associada com altas taxas de resultados falso-positivos e falso-negativos, como os níveis podem ser elevados em condições não-cancerosas da próstata, incluindo hiperplasia benigna da próstata (HBP) e prostatite [7] – [10]. Recentemente, a Preventive Services Task Force EUA (USPSTF) recomendou contra a triagem com base no PSA para CaP em todos os grupos etários, afirmando que os benefícios não compensam os danos do rastreio e tratamento [11]. Esta incapacidade de prever com precisão a agressividade do câncer de próstata com base apenas nas características clínico-patológicas padrão ressalta claramente a necessidade de explorar a capacidade de biomarcadores baseada tumorais para aumentar a previsão de resultados na biópsia e compreender a base molecular da metástase do câncer de próstata. Portanto, os biomarcadores adicionais são urgentemente necessários para melhorar a especificidade do diagnóstico de PSA e prever o potencial de progressão da doença.

Para melhor compreender os mecanismos moleculares de metástases de cancro da próstata, é essencial identificar os marcadores que são associados com metástases. Proteomics provou ser uma abordagem útil e bem sucedido na triagem do tumor e metástases relacionados marcadores de proteína [12]. Existem várias tecnologias proteómica que foram aplicadas na triagem e identificação de marcadores de câncer em potencial. Os ‘isobáricas Tag para a quantificação relativa e absoluta’ plataforma (iTRAQ) tem as vantagens de ser relativamente alto rendimento e pode ser multiplexada para fornecer informações sobre o péptido quantificação /proteína e de identificação, como relatado em estudos anteriores [13], [14] . Nesta abordagem, várias amostras de diferentes proteomas são reduzidas, alquiladas e digeridas proteoliticamente para gerar péptidos. Os péptidos são marcados com um conjunto de reagentes iTRAQ (num formato 4 ou 8-Plex), reunidas e fraccionadas por permuta catiónica forte (SCX). As fracções são então analisadas por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS /MS), com os espectros de massa resultantes que fornecem informação sobre a sequência (a partir dos fragmentos peptídicos), e quantificação relativa (a partir dos iões grupo repórter).

Em um esforço para identificar novas proteínas que estão associados com a progressão do cancro metastático da próstata humana, que foi realizada uma análise iTRAQ 4-Plex utilizando duas células de cancro da próstata PC3 linhas singeneicas-N2 e PC3-ML2 que têm diferentes potenciais metastáticos. PC3-N2 é metastático modesto enquanto PC3-ML2 é altamente metastático. Após a análise de dados quantitativos comparativo, um número de candidatos foram encontrados para ser significativamente expresso diferencialmente em células PC3-ML2 em comparação com células PC3-N2. Dois dos candidatos identificados como sendo significativamente regulada para cima no PC3-ML2 são plectina e vimentina. Estas proteínas foram adicionalmente investigadas por Western blot e siRNA knockdown. Os níveis de expressão correlacionada à imuno-histoquímica imagens a partir de amostras de tecido normal e adenocarcinoma da próstata. As proteínas diferencialmente regulados identificadas no estudo, incluindo plectina e vimentina, são discutidos no contexto da sua importância para a progressão do câncer de próstata.

Procedimentos Experimentais

Materiais

Dulbecco modificados meios de eagle (DMEM) e soro fetal de bovino (FBS), antibióticos e antimicóticos, 4-12% de gel NuPAGE® Bis-Tris e 2 × tampão de Laemmli eram de Invitrogen (Carlsbad, CA). inibidores de protease Complete ™ foram compradas a partir de Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN), a tripsina de grau de sequenciação foi de Promega (Madison, WI), e a membrana Immobilon-FL foi PDVF da Millipore (Billerica, MA). kit de ensaio de concentração de proteína BCA e o tampão de bloqueio sem proteína foram de Thermo Scientific (Rockford, IL). Os anticorpos primários para vimentina (ab20346), plectina (ab83497) eram de Abcam (Boston, MA), e plectina (sc-7572), GAPDH (SC-25778), pERK 1/2 (Thr 202 /Tyr 204) SC- 16982, ERK 1/2 (MK1) SC-135900, e CDC2 p34 (SC 53) eram de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). CDC2 (Cat # 9112) anticorpo foi de Cell Signaling Technology. anticorpos IRDye secundário conjugado (cabra anti-rato IR680 Cat. # 926-3220, Cabra anti Cat IR800CW coelho. # 926-32211, Cabra anti IR680 coelho (Cat. # 926-32221), Donkey anti-cabra IR680 (Cat. # 926-32224), cabra anti-rato IR800CW (Cat. # 926-3220) eram de Li-COR Biosciences (Lincoln, PA) e Alexa Fluor anticorpos secundários para microscopia confocal de imunofluorescência eram de Invitrogen (Carlsbad, CA). Controle siRNA- A (SC-37007), vimentina (h) (SC-29522) e plectina siRNA (h) (SC-29453) foram de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

Linhas Celulares e Cultura de células

PC3 parental foram originalmente obtidas a partir de uma metástase óssea em um paciente com adenocarcinoma de próstata primário. As duas sublinhas PC3-N2 e PC3-ML2 foram gentilmente doados a nós pelo grupo do Dr. Stearns na Universidade de Drexel e foram desenvolvidos como descrito por Wang e Stearn [15]. as linhas celulares foram desenvolvidos com base em sua capacidade de invasão

in vitro Comprar e potencial metastático

in vivo

. Ambas as células foram tumorigênico por via subcutânea quando injectado em ratinhos SCID. No entanto, as células N2 foram incapazes de migrar através de uma membrana revestida de matrigel

in vitro

, bem como induzir a metástases em ratinhos SCID, enquanto que as células ML2 foram altamente invasivo

in vitro

e induziu metástases ósseas em mais de 80% dos casos [15] – [17]. células PC3-N2 e PC3-ML2 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos, a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram dissociadas, em seguida, a partir da superfície de plástico utilizando EDTA 5 mM em PBS. O tampão de dissociação não enzima preserva moléculas da superfície celular e viabilidade celular.

Extração de Proteínas A digestão e iTRAQ Labeling

Para o total dos experimentos de lisados ​​de células PC3-N2 e células PC3-ML2 foram cultivadas em completa meio de crescimento até 80% de confluência. As células isoladas utilizando EDTA 5 mM em PBS e lavadas com PBS e o sedimento ressuspenso em tampão de dissolução de 160 ul contendo 100 mM de NH

4HC0

3 e TFE (01:01 v /v). As amostras foram sonicadas durante 20 segundos por três vezes e incubaram-se a 60 ° C durante 1 h. Os lisados ​​foram centrifugados para remover detritos celulares e as células não rompidas, antes de recolher o sobrenadante. A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA e normalizada para cada amostra. 100 ug de aliquotas das amostras foram secos num SpeedVac e submetido a digestão com tripsina e rotulagem péptido com reagentes iTRAQ de acordo com as instruções do fabricante (Kit de iTRAQ Reagentes Multiplex; ABSciex, Foster City, CA). Resumidamente, 100 ug de proteínas foram e ressuspenso em 20 ul de tampão de dissolução e 1 ul de desnaturante, à TA seco sob vácuo. As amostras foram reduzidas, alquiladas e tripsinizadas com 5 ug de tripsina modificada de grau de sequenciação (Promega, Madison, WI, EUA) durante 18 h a 37 ° C. amostras digeridas com tripsina foram marcadas com quatro diferentes reagentes iTRAQ dissolvido em 70 uL de etanol à temperatura ambiente durante 1 h. As reacções foram extinta com glicina 10 mM. As amostras foram como se segue: amostras de células PC3-N2 com 114 e 115 amostras de etiquetas e PC3-ML2 com 116 e 117 as etiquetas. Esta estratégia fornece técnicas repetições internas para os dois tipos de amostras. Todas as quatro amostras marcadas foram recolhidas, a coluna seca por vácuo e fraccionada utilizando um permuta catiónica forte (SCX).

2D-LC separações

Na primeira dimensão, separações SCX foram realizadas num sistema de HPLC Waters 600E passivado, utilizando uma coluna mm polysulfoethyl aspartamida 4. × 250 (PolyLC, Columbia, MD) a uma taxa de fluxo de 1 ml /min. O tampão A continha formato de amónio 10 mM, pH 2,7, em 20% de acetonitrilo /80% de água. Tampão B continha formato de amónio 666 mM, pH 2,7, em 20% de acetonitrilo /80% de água. O gradiente foi de tampão A a 100% (0-22 minutos após a injecção da amostra), 0% → 40% de tampão B (16-48 min), 40% → 100% de tampão B (48-49 min), em seguida, isocrático 100% tampão B (49-56 min), em seguida, a 56 min comutada de volta a 100% de a para voltar a equilibrar durante a injecção seguinte. Os primeiros 26 ml de eluente (contendo todos os flow-through frações) foi combinado em uma fração, e, em seguida, 14 frações adicionais de 2 ml foram coletadas. Todos os 15 destas fracções SCX foram secos completamente para baixo para reduzir o volume e remover os sais de formato de amónio voláteis, em seguida, ressuspensas em 9 ul de 2% (v /v) de acetonitrilo, 0,1% (v /v) de ácido trifluoroacético e filtrado antes de ser separação de fase inversa C18 nanofluxo-LC. Para a segunda separação dimensão por LC nanofluxo fase inversa, cada fracção SCX foi injectada automaticamente numa coluna de Chromolith CapRod (150 x 0,1 mm, de Merck) usando um loop injector de 5 ul em um sistema de MALDI mancha Tempo LC (ABI-MDS /Sciex) . Tampão C foi de 2% de acetonitrilo, 0,1% ácido trifluoroacético, e Tampão D foi de 98% de acetonitrilo, 0,1% ácido trifluoroacético. O gradiente de eluição foi de 95% C /5% de D (2 ul por minuto taxa de fluxo de 0-3 min, depois 2,5 mL por minuto 3-8,1 min), 5% de D → 38% D (8,1-40 minutos), 38% D → 80% D (41-44 min), 80% de D → 5% D (44-49 min) (condições iniciais). taxa de fluxo foi de 2,5 mL /min durante o gradiente, e um fluxo igual de solução de matriz MALDI foi adicionado pós-coluna (7 mg /ml de CHCA recristalizado (α-ciano-hidroxicinâmico), 2 mg /fosfato de amónio ml, 0,1% de trifluoroacético ácido, 80% de acetonitrilo). O eluente combinado foi descoberto automaticamente em um aço MALDI placa alvo inoxidável cada 6 segundos (0,6 ul por ponto), para um total de 370 pontos por fracção SCX originais.

Análise Espectrometria de Massa

A manchas amostra foram secos e pontos de calibração (ABI 4700 Mix) são adicionados a cada placa manualmente. As placas alvo MALDI (15) foram analisadas de um modo dependente de dados num ABI 5800 TOF MALDI-TOF após a calibração. Espectrometria de massa (MS) Os espectros foram adquiridos a partir de cada ponto de amostra utilizando a calibração padrão recentemente actualizada, utilizando 500 disparos de laser por mancha. Uma interpretação ampla de placas foi realizada automaticamente escolher o pico mais alto de cada valor de m /z observado para subsequente análise em tandem MS /MS. Até 2500 disparos de laser na potência do laser 4200, com ar induzida por colisão de dissociação (CID) de gás em 1,2 a 1,3 × 10

-6 Torr foram acumulados para cada MS /MS espectro. Após a aquisição de MS e MS /MS, os espectros de todas as placas 15 da amostra foram utilizadas para a identificação e quantificação de proteínas usando o algoritmo Paragon como implementado no software de Proteína piloto 4,0 (ABI-Sciex) [18]. Os espectros foram comparados com o subconjunto humana (mais contaminantes comuns) do banco de dados NCBI não redundante concatenado com uma invertida “chamariz” versão do mesmo banco de dados usando a mais recente desses bancos de dados FASTA, obtidos a partir de http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=Taxonomy cmd = Pesquisa term =. . (banco de dados Ref Seq Humano 20120204 sequências contendo 29766 sequências de proteínas, além de 389 contaminantes comuns de laboratório Os parâmetros de busca Pilot Protein foram: Metil metanotiosulfonato (MMTS) resíduos de cisteína alquilados, modificação iTRAQ 4-plex de lisina e N-terminal com uma identificação foco em modificações biológicas e substituições de aminoácidos usando o esforço busca minuciosa. a descoberta Rate (FDR) estimativa False foi determinada pela procura, simultaneamente, o banco de dados chamariz concatenadas [19].

Análise Caminho

os dados gerados a partir de a análise por espectrometria de massa proteômica foram analisados ​​utilizando Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Sistema Ingenuity, cidade de Redwood, CA, www.ingenuity.com) ferramenta Ingenuity Knowledge base foi usado para identificar a função biológica e as vias canônicas que incluem e envolvem as proteínas diferencialmente regulados.. IPA é um banco de dados atualizado regularmente, que utiliza o conhecimento atual disponível em genes, proteínas, processos celulares e patológicas normais, sinalização e vias metabólicas, necessários para a construção via.

preparação de proteína de Validação

a células PC3-N2 e PC3-ML2 foram cultivadas a 80% de confluência e destacado usando EDTA 5 mM em PBS. Para a extracção de proteínas, as células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas em modificado tampão RIPA [Tris-HCl 50 (pH 7,4), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,25% de desoxicolato de sódio] contendo uma protease cocktail inibidor (completo, mini, Roche) a 4 ° C durante 15 min. As amostras foram sonicadas durante 1 min e centrifugou-se a 14000 g durante 15 min a 4 ° C, e o sobrenadante foi recolhido. Quantidades iguais de proteína (BCA Protein Assay Kit, Pierce) a partir de cada amostra foram separadas num gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio 4-12% Tris-glicina por electroforese (SDS-PAGE), seguida por transferência de Western blot para PVDF. Para a análise de Western, electroforese de proteínas foram transferidas para membrana de PVDF, bloqueadas com tampão de bloqueio Odyssey (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA), sondados com os anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com o respectivo conjugado com IRDye anticorpos secundários e visualizados usando um sistema de imageamento infravermelho Odyssey (Li-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska).

a transfecção e silenciamento de plectina e Vimentin por siRNA

ARNic em cadeia dupla foram usadas para silenciar plectina e A expressão de vimentina. Um não-direccionamento 20-25 duplex siARN foi utilizado como controlo negativo. ARNic em cadeia dupla foram transf ectados para as linhas celulares PC3 com reagente de transfecção siRNA de acordo com as instruções do fabricante Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Depois de transfecção durante 72 h, as células foram submetidas a transferência de Western e análise de imunofluorescência para detectar a eficácia de vimentina e knockdown plectina e para determinar os efeitos do knockdown sobre a migração e propriedades invasivas das células.

Microscopia Confocal análise

células PC3-N2 e PC3-ML2 foram semeadas em placas de 6 poços contendo lamelas de vidro e cultivadas em 10% de FBS /DMEM durante 2 dias. As células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, fixadas com metanol gelado durante 5 minutos. Subsequentemente, as células fixadas foram lavadas com PBS e coradas com anticorpos primários contra plectina, vimentina, e CDK2 durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários foram removidos e as células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo antes da coloração com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor durante 1 hora à temperatura ambiente. mancha TOPRO foi incluído com os anticorpos secundários para coloração nuclear. Os anticorpos secundários e manchas nucleares foram lavados e as lamelas montadas as lâminas com meio Escudo Vector contendo mancha DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA), e selado com unha polonês. As imagens fluorescentes foram capturadas e examinadas utilizando um microscópio confocal (Carl Zeiss, Thornwood, NY).

Ensaio de Proliferação Celular

células PC3-N2 e PC3-ML2 em pratos de 24 poços a uma densidade de 2 × 10

4 células e transfectadas com não-segmentação e plectina /siRNA específico vimentina a uma concentração final de 20 nM. Ambos ligados e as células flutuantes foram recolhidas após centrifugação a baixa velocidade e trypsination. As células foram coradas com Trypan azul, e o número de células com Trypan Blue-positivas foram contadas nos dias 2, 4, 6 pós transfecção.

Risco Ensaio /Cicatrização Invasion Ensaio

A migração capacidade das duas linhas de células foi avaliada por um ensaio de cicatrização da ferida. Resumidamente, as células PC3-N2 e PC3-ML2 foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10

5 células e transfectadas com não-direccionamento e plectina /siRNA específico vimentina a uma concentração final de 20 nM para 72 horas. Uma ferida artificial foi cuidadosamente criado em 0 h usando uma ponteira 200 mL de arranhar a monocamada de células confluentes em triplicado para cada condição. As células foram lavadas com PBS e cultivadas em 10% de FBS-DMEM a 5% de CO2 e 37 ° C. Uma fotomicrograf ia foi feita imediatamente depois de coçar (tempo 0 h) e 24 h mais tarde, sob 10 × lente objectiva usando um invertido Zeiss AxioObserver.A1-microscópio de contraste de fase (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). As distâncias de migração nos poços em triplicado foram medidos e os valores médios e erro padrão de comparação entre o controle eo plectina e células vimentina knockdown.

Trans-bem Ensaios de Migração

Para investigar a invasão de as duas linhas celulares, um sistema de cultura de invasão da membrana foi utilizado como se segue. As células pré-tratadas com que siRNA de controlo ou ARNsi e vimentina plectina foram deixados em jejum durante a noite em meio DMEM com 0,5% de FBS, em seguida foram tratadas com tripsina e ressuspensas em DMEM contendo 0,5% de albumina de soro bovino. As células (1 x 10

5) foram adicionados à parte superior das câmaras de placas de 24 poços Transwell (Corning, 8 um de tamanho de poro), e DMEM com FBS a 10% e LPS foi adicionado às câmaras inferiores. câmaras inferiores foram cheias com meio de cultura contendo FBS a 0,5% como controlo ou LPS contendo 10% como um atractivo. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 24 horas. No final do período de incubação, a superfície superior da membrana foi limpa com um aplicador de algodão-ponta para remover as células não migratórias. As células que migraram para o lado inferior da membrana foram fixadas e coradas com hematoxilina de visualizar núcleos. As células foram quantificados por contagem de cinco campos elevados com motor em 100 vezes, e os meios para cada câmara foram determinados em triplicado. invasão por cento foi representado como o número médio de células que migram através da membrana para o plectina e células vimentina silenciado em relação ao siRNA não-alvo.

Correlação de plectina e Vimentin Expressão Usando Proteome Atlas Human

a proteína de banco de dados Atlas Human exibe expressão e localização padrões de proteínas em grande parte dos tecidos e órgãos humanos com ênfase em estratégias para validar padrões de expressão de proteína de imunohistoquímica base para projectos de investigação do cancro. Os objectivos finais para o projeto incluem a criação de um banco de dados informações de perfis de expressão de proteína em tecidos humanos normais, nas células e no cancro, e utilizando anticorpos gerados e dados de expressão de proteínas como ferramentas para identificar biomarcadores clinicamente úteis [20], [21] .O banco de dados contém imagens de alta resolução anotadas por uma patologistas certificados. A Proteína Humana Atlas foi utilizado para pesquisar a expressão de vimentina plectina e concentrando-se em imuno-histoquímica de tecidos normais e cancerosos da próstata. Essas análises comparativas em combinação com os dados gerados no presente estudo fornecerá a base de futuras investigações impulsionado hipótese do papel destas proteínas na progressão da doença do cancro da próstata.

Análise Estatística

Cada um dos destas experiências foi realizada em triplicado. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (S.E.M.). A análise estatística foi realizada usando SPSS 13.0 software estatístico (SPSS, Inc. Chicago, IL, EUA).

P

. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Identificação da diferencialmente expressos proteínas no PC3-N2 e PC3-ML2 linhas celulares utilizando iTRAQ Labeling e 2D LC-MS /MS

Analisamos o proteoma de células de câncer de próstata singênica PC3-N2 e PC3-ML2 por 2D LC-MS /MS usando iTRAQ, para gerar dados de proteínas diferencialmente expressos. O fluxo de trabalho experimental geral é mostrada na Figura Suplementar S1. Um total de 1756 proteínas não redundantes foram repetidamente identificada por rotulagem iTRAQ duplicado e analisa 2D LC-MS /MS, 95% dos quais foram identificados com 2 jogos de péptidos. A taxa de falsos descoberta (FDR) para a identificação de proteínas baseados na busca contra uma base de dados invertido foi de 1%. A informação detalhada incluindo informação de sequências peptídicas, data de quantificação de proteínas, proporção média iTRAQ, e péptidos distintos e comuns com um grupo de proteínas para estas proteínas identificados é mostrado na Tabela S1. Para identificar proteínas expressas diferencialmente em PC3-N2 e PC3-ML2 que pode estar relacionado com a metástase e invasão, os perfis de expressão de proteínas entre as duas linhas celulares foram comparadas. As proteínas que preencheram os seguintes critérios foram confiante considerado como proteínas diferencialmente expressos: (i) as proteínas foram repetidamente identificada pelas experiências duplicadas; (Ii) as proteínas foram identificadas com base on≥2 péptidos; (Iii) proteínas mostrou uma proporção or≤0.667 change≥1.5 vezes em média nas experiências duplicadas entre as duas linhas de células (

t

teste,

P

0,05). Usando esses critérios, 130 proteínas foram encontrados para ser diferencialmente expressos em células PC3-ML2 PC3-N2 e. Destas proteínas, 62 verificou-se ser regulada para cima enquanto 68 foram regulados negativamente. Os nomes destes 130 proteínas e os seus níveis de expressão são mostrados na Tabela S1. Alguns dos espectros MS /MS utilizado para a identificação e quantificação de PLEC1 e VIM com alterações significativamente alta relação de vezes em células PC3-ML2 em comparação com linhas PC3-N2 são mostrados na Figuras 2A S e S 2B. O espectro MS /MS para GAPDH que não têm alterações de dobragem nas duas linhas de células é mostrada na Figura 2C S. EphA2 é um exemplo de uma proteína que é regulada negativamente em PC3-ML2 vs PC3-N2 e isso é mostrado na Figura S 2D. Foi observada uma alta concordância entre as duas intensidades repórter íon para um determinado peptídeo para praticamente todos os peptídeos identificados. A dobra-variação média para uma proteína foi obtido por utilização de todos os péptidos de identificação que a proteína. Portanto, nossas identificações de proteína e quantificação são consistentes e de alta confiança. Este subconjunto de 130 proteínas diferencialmente regulados foi utilizado para todas as análises de bioinformática subsequente, anotações biológicas e interpretação.

Análise Caminho

Usando o software Ingenuity as proteínas diferencialmente regulados foram atribuídos a localização subcelular, molecular e funções celulares, e seu possível envolvimento em doenças e transtornos. As Figuras 1A, B e C exibem a sua localização sub-celular, as suas funções celulares e moleculares, bem como os principais doenças e distúrbios que representam, respectivamente. Tabelas S2 e S3 resumir as diferentes categorias funcionais e seus valores p. Os nossos resultados indicam que as proteínas diferencialmente regulada entre as duas linhas celulares de cancro da próstata singeneicas são principalmente envolvidos no cancro, doenças dermatológicas, doenças genéticas, doenças gastrointestinais, e doenças imunológicas. Usando a ferramenta de base de conhecimento IPA, identificamos as principais redes e caminhos canônicos que sugerem as principais funções possíveis de proteínas que são diferencialmente expressos nas duas linhas celulares. Tal como indicado na Tabela S4 e S3 Figura, a rede é superior a morfologia das células, desenvolvimento de tecido conjuntivo e função, e o movimento celular.

funções análise base de conhecimento Engenho foi usada para determinar a localização sub-celular, moleculares e biológicas e processos de doença que estão associadas com as proteínas que são diferencialmente regulados entre células PC3-ML2 PC3-N2 e. Os números de proteínas são mostrados no eixo-x e nas Tabelas S2 e S3.

Validação de expresso diferencialmente proteínas identificadas por Proteomics

Entre as 130 proteínas com expressão alterada, nós incidiu sobre duas proteínas plectina e vimentina, que foram muito significativamente upregulated no PC3-ML2 vs PC3-N2. Além disso, seus níveis de expressão ainda não foram bem estudados em câncer de próstata. Western blotting foi realizado para detectar os níveis de Expressional as duas proteínas em experiências em triplicado. Como mostrado na Figura 2, PLEC1 e os níveis de expressão do VIM está significativamente aumentada em PC3-ML2 vs PC3-N2, o que é consistente com os dados de análise por MS. Os níveis de expressão relativos de plectina normalizada e vimentina com nível de GAPDH são indicados ao lado da imagem de Western blotting. Em análises complementares, ensaios de imunofluorescência verificar eficiente derrubar do plectina e ainda validar os dados de espectrometria de massa como se mostra na Figura 3, painel A, onde a intensidade de coloração plectina é mostrado para ser significativamente altamente expresso em PC3-ML2 comparação com PC3-N2. O mesmo foi observado para as células vimentina knockdown (Figura S4)

lisados ​​celulares totais (40 ug) de células N2 e ML2 foram submetidas a SDS-PAGE. As proteínas separadas foram analisados ​​por análise de Western blot para detectar plectina e vimentina como descrito. detecção de GAPDH foi incluída como um controlo de carga.

As células foram tratadas com ARNsi de controlo ou ARNsi específico para o gene plectina durante 3 dias e, em seguida, fixo, incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-plectina e monoclonal de ratinho anti-CDK2 primária anticorpos antes da “coloração” com anticorpos de burro Alexa Fluor conjugado anti-coelho secundário (verde), de cabra anti-rato anticorpos secundários (vermelho) e a mancha nuclear TOPRO (azul). O painel A mostra as imagens de células transfectadas de controle de siRNA e Painel B mostra as células transfectadas plectina siRNA.

plectina e Vimentin Knockdown inibe a proliferação de linhas de células PC3-ML2

Nós examinou se plectina vimentina e contribuir para a proliferação celular no cancro da próstata usando a técnica de RNAi. Após a introdução de plectina e vimentina siRNA em células PC3-ML2 durante 72 h, a supressão de plectina e vimentina foram confirmados por transferência de Western, enquanto que o siARN de controlo não segmentação não teve nenhum efeito significativo sobre plectina endógena e expressão de vimentina (Figura 4). A expressão de plectina e vimentina foram reduzidos em 72% e 99,9% respectivamente, em comparação com os controlos (

P

0,05). A expressão relativa da GAPDH nos controlos e plectina /vimentina alvo knockdowns siRNA são idênticos. A proliferação de células PC3-ML2 foi examinada por contagem de células após 2-6 dias de tratamento siARN. Os nossos dados mostram que a proliferação celular foi significativamente reduzido em ambos plectina knockdown e vimentina (Figura 5). Os dados de ensaios complementares, não apresentam diferenças significativas na viabilidade de ambas as linhas celulares (Figura S5).

As células foram tratadas com ARNsi de controlo, ou o gene plectina vimentina siRNA específico. Os lisados ​​celulares totais (40 ug) de células ML2 foram sujeitos a SDS-PAGE.