Abstract

A cisplatina (

cis

-diamminedichloroplatinum, CDDP) é um agente quimioterápico bem conhecido para o tratamento de vários tipos de câncer. No entanto, o mecanismo subjacente a apoptose das células cancerosas precisa induzida pela CDDP ainda não está claro. Neste estudo, que mostram que a CDDP mecanicamente induz apoptose GM3-mediada de células HCT116 através da inibição da proliferação celular, e aumentando a fragmentação do ADN e sinais de apoptose dependente de mitocôndrias. CDDP apoptose induzida dentro das células através da geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), regulou a expressão de ROS-mediada de Bax, Bcl-2 e p53, e induziu a degradação da polimerase de poli (ADP-ribosil) (PARP). Verificou-se também níveis de diferentes gangliósidos expressão em células HCT116 na presença ou ausência de CDDP. Curiosamente, entre os gangliósidos, CDDP aumentada a expressão de apenas sintase GM3 GM3 e o seu produto. A redução do nível de GM3-sintase através da expressão ectópica de GM3 pequeno ARN interferente (siRNA) resgatado células HCT116 de apoptose induzida pela CDDP. Isto foi evidenciado pela inibição de sinais apoptóticos reduzindo a produção de ROS através da regulação da actividade de 12 lipoxigenase. Além disso, a sensibilidade apoptótica de CDDP foi notavelmente aumentada em células HCT116 transfectada-sintase GM3 comparada com a de controlos. Além disso, células transfectadas GM3-sintase tratados com CDDP apresentaram um aumento da acumulação intracelular de ROS. Estes resultados sugerem que a apoptose oxidativo induzidas pela CDDP de células HCT116 é mediada por GM3

citação:. Chung T-W, Choi H-J, Kim S-J, Kwak C-H, Song K-H, Jin L-H, et al. (2014) O gangli�idos GM3 está associado com apoptose Cisplatina-induzida em células cancerígenas do cólon humano. PLoS ONE 9 (5): e92786. doi: 10.1371 /journal.pone.0092786

editor: Rupesh Chaturvedi, da Escola de Medicina da Universidade de Vanderbilt, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de julho de 2013; Aceito: 25 de fevereiro de 2014; Publicado: 14 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O presente estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção financiada pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (MEST) da Coreia (NRF-2013R1A1A2005387) e Tumor personalizado Engineering Research Center concessão (2008- 0.062.611). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cisplatina (

cis

-diamminedichloroplatinum, CDDP) é um agente quimioterapêutico utilizada para o tratamento de vários tumores sólidos. CDDP liga-se ao ADN para gerar os aductos de ADN [1]. Estudos anteriores mostraram que a CDDP regula a actividade de certos canais iónicos, proteínas de transporte e várias enzimas de membrana de plasma [2], [3], e induz a espécies de oxigénio reactivas (ROS) durante a quimioterapia do cancro [4]. Por conseguinte, a CDDP regula a reparação do ADN, a inibição da transcrição, a paragem do ciclo celular e apoptose [5]. Tem sido relatado que as quinases reguladas extracelularmente-sinal (ERK), o c-Jun quinases N-terminais (JNK) /activado tensão-proteína-cinase (SAPK) e a quinase p38 mitogen-activated protein (MAPK) são activados em CDDP apoptose induzida de células cancerosas [6], [7]. Além disso, induz a CDDP Fas /apoptose mediada por FasL nas células epiteliais humanas [8] e o dano mitocondrial por regular os níveis de expressão da família Bcl-2, que possuem funções tanto pro- ou anti-apoptóticas. Ao afectar CDDP citotoxicidade em células cancerosas, a transactivação mediada por p53 da Bax pró-apoptótica, diminuição da Bcl-2 de expressão e clivagem de Bid leva a uma redução no potencial mitocondrial e aumenta a degradação de PARP mediada por caspase através da libertação de citocromo c das mitocôndrias [9] – [12]. Diversos estudos relataram que estes fenómenos apoptóticos são, devido à alteração da composição da membrana [13]. Entre os componentes da membrana, foi relatado que os níveis de expressão de gangliósidos são alteradas nas células cancerosas tratadas com a droga [14].

Aglomerados de glicoesfingolípidos contendo ácido siálico (GSL) são ubíquas na microdomínio membrana em todos células de mamíferos e estão implicados numa vasta gama de funções biológicas, incluindo as interacções célula-célula e na transdução de sinal [15]. Muitos estudos têm relatado que os gangliosidos específicos, tais como GM3, GD3, e GD1b induzir a apoptose em diversos tipos de células [16], [17]. GM3 no tratamento de proliferação glial imaturas e células neuronais resulta na supressão da proliferação celular e a indução de apoptose [18], [19]. Além disso, GM3 está envolvida na morte celular através da acumulação de ROS e influxo de cálcio intracelular de iões para dentro das células neuronais [20], [21]. Em células de cancro da bexiga de murino, GM3 superexpressão induz apoptose e reduz o potencial maligno [22]. No presente estudo, investigamos o significado funcional de gangliósido GM3 em células de câncer colorretal tratados com CDDP.

Materiais e Métodos

Cultura de células e reagentes

O câncer de cólon humano a linha de células HCT116 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; JBI, Daegu, Coreia), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina a 37 ° C sob 5% de CO

2. A cisplatina foi comprado de Dong-A CO farmacêutica., LTD (Seul, Coréia).

N-acetil-

L-cisteína (NAC) foi obtido a partir de Molecular Probes ™ (Invitogen, CA). Baicaleína era da Sigma-Aldrich. Os anticorpos foram obtidos como se segue: anti-poli (ADP-ribosil) polimerase (PARP), Bcl-2, Bax, e p53 foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). -Anti-gliceraldeído-3-phosphode hidrogenase (GAPDH) foi adquirido da Chemicon (Temecula, LA). Anti-GM3 (M2590) foi adquirido a partir de Biotest Laboratories (Japão).

Inverter reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR)

O ARN total a partir de cada célula foi isolado utilizando o reagente Trizol ( Invitrogen). Um micrograma de ARN foi submetido a transcrição reversa com os iniciadores oligo dT utilizando RT-AccuPower pré-mistura (Bioneer Co., Daejon, Coreia), de acordo com o protocolo do fabricante. O ADNc foi amplificado por PCR com os seguintes iniciadores, utilizando EF-polimerase Taq (SolGent, Seul, Coreia do Sul): GM3 sintase (413 pb), 5′-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3 ‘(sentido) e 5′-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3′ (anti-sentido ); GD3 sintase (460 pb), 5’-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3 ‘(sentido) e 5′-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3′ (anti-sentido) GalNAc-T (GM2 /GD2 sintase) (230 pb), 5’-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3 ‘( senso) e 5’-GATCATAACGGAGGAAGGTC-3 ‘(anti-sentido); β-actina (247 pb), 5’-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ‘(sentido) e 5′-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3’ (anti-sentido). A utilização de quantidades iguais de ARNm no ensaio de RT-PCR foi confirmada através da análise dos níveis de expressão β-actina. Os produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de 1,5% de brometo de etidio contendo agarose com 0,5 × Tris-acetato-EDTA tampão (TAE).

A viabilidade celular ensaio

A proliferação celular foi investigada usando um kit de proliferação disponível comercialmente II (XTT; Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). Resumidamente, as células foram sub-cultivadas em placas de cultura de 96 poços a uma densidade de 103 células /poço em 100 ul de DMEM /FBS a 10%. Após 24 h de incubação, o meio foi descartado e substituído por 100 ul de meio fresco contendo várias concentrações de CDDP. As placas foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO2 durante 12 h. No final da incubação, 50 uL da solução de ensaio XTT foi preparado por mistura de 5 ml de reagente XTT-rotulagem e 100 uL de reagente de acoplamento de electrões, que foi adicionada a cada poço. Após 4 h de incubação a 37 ° C e sob 5% de CO2 condições, a absorvância foi medida utilizando um leitor de ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a um comprimento de onda de teste de 490 nm.

fluxo de citometria de estimativa intracelulares

estado redox produção

ROS foi avaliada por coloração das células com diacetato dichlorodihydrofluorescein (H

2DCFDA; Molecular Probes, Carlsbad, CA). As células foram lavadas duas vezes com DMEM contendo FBS a 10%, incubou-se em 10 ^ M H

2DCFDA diluído em DMEM durante 20 min a 37 ° C, lavadas com PBS e tripsinizadas. As células dissociadas foram lavadas duas vezes com PBS gelado, ressuspensas em PBS e analisadas por citometria de fluxo utilizando FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

análise Western blot

Células foram homogeneizados num tampão contendo Tris-HCl 50 (pH 8,0), NaCl 150 mM, 0,02% NaN

3, 100 ug /ml de f luoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 ug /mL de aprotinina e 1% de Triton X- 100. As concentrações de proteínas foram medidas utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA). Trinta e microgramas de lisado celular total foi fraccionado por tamanho de dodecilo de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de nitrocelulose usando o sistema de electrotransferência Hoefer (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Para detectar as proteínas alvo, que as membranas incubadas com os respectivos anticorpos. A detecção foi realizada utilizando anticorpos de rábano secundário ligado a peroxidase anti-ratinho e anti-coelho (Santa Cruz), e sistema de quimioluminescência ECL (Amersham Biosciences).

A sobre-expressão de gangliósido GM3-sintase e o seu produto em células HCT116

Para construir o plasmídeo de expressão de sintase GM3, um fragmento de ADN de 1,1 kb incluindo a região de codificação humana sintase GM3 foi amplificado por PCR utilizando os oligonucleótidos 5′-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3 ‘(sentido), 5’-3-ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC ‘(anti-sentido) e ADNc de cérebro fetal humano como molde. Os iniciadores de sentido e anti-conter

Hind

III e

Eco

RI sítios de restrição (sublinhado), respectivamente. O fragmento foi purificado a partir de um gel de agarose a 1% utilizando o Assistente SV Gel de PCR e sistemas de purificação de (Promega) e digeridos com a enzima de restrição apropriada e ligados utilizando ligase de T4 (Takara Bio Inc., Shiga, Japão) para uma pcDNA3 vector, para gerar pcDNA-GM3. Para identificar a construção com um gene de sintase GM3, mapeamento de restrição e sequenciação de ADN foram realizadas. As células HCT-116 foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 10

5 células /poço e cultivadas durante a noite. As células foram transfectadas com 1 ug de plasmídeo pcDNA e pcDNA-GM3 pelo método WelFect-EX ™ PLUS (JBI). Após a incubação, as células transfectadas foram cultivadas na presença de 500 ug /ml de G418 (Life Technologies, Inc.). Após 21 dias em meio selectivo, as colónias individuais resistentes a G418 foram isoladas. Três clones positivos que expressam GM3 sintetase para níveis elevados, tal como determinado por RT-PCR, foram utilizados para análise posterior.

ensaio da luciferase

plasmídeos repórter, pGL3-1600 foram preparados através da inserção do

Sac I /

Bgl II

fragmentos a partir do cada um dos plasmídeos gerados anteriormente [23] nos locais correspondentes do vector de promotor de luciferase pGL3-menos-Basic (Promega). As células foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 10

5 células /poço e cultivadas durante a noite. As células foram co-transfectadas com 0,5 pmol de GM3-sintase construções repórter de promotor-luciferase e 0,5 ug de plasmídeo β-galactosidase pelo método WelFect-EX ™ PLUS (JBI). As células foram cultivadas em meio contendo 10% de FBS e incubadas com CDDP, durante 12 h. A actividade de luciferase e a actividade β-galactosidase foram ensaiadas utilizando o sistema de ensaio da enzima luciferase e β-galactosidase (Promega). A actividade de luciferase foi normalizada para a actividade β-galactosidase no lisado celular e a média foi calculada com base em três experiências independentes.

Microscopia de imunofluorescência

células de cancro do cólon HCT116 foram semeadas a uma sub-confluentes densidade em 12 mm- diâmetro lamínulas estéreis em seis placas de cultura de tecidos. As células foram fixadas em formaldeído a 3,7% /PBS e lavadas três vezes com PBS e depois permeabilizadas em 0,5% de Tween-20 /PBS durante 5 min à temperatura ambiente. Os locais não específicos foram depois bloqueadas com PBS contendo 1% de albumina de soro de bovino durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, uma solução de GM3 (M2590), GD3 ou anticorpos específicos de GM2-se inundado sobre as células a 4 ° C durante a noite. Após lavagem com PBS, as células foram ainda incubadas com FITC de murganho anti-IgM conjugado durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de lavagem com PBS, e finalmente montado no reagente anti-desvanecimento (Molecular Probes) contendo 4 ‘, 6-iamidino- 2-fenilindole (DAPI). As lâminas foram analisadas utilizando um microscópio de fluorescência Nikon (Nikon, Japão). O anticorpo secundário pré-absorvido sozinha também foi incluída como um controlo negativo para a experiência.

fragmentação do ADN de ensaio

As células em cultura foram colhidas, lavadas com PBS, lisadas em tampão (10 mM de Tris -HCl (pH 7,4), EDTA 10 mM, 0,5% de Triton X-100), e incubadas em gelo durante 10 min. As amostras foram centrif usadas a 4 ° C durante 10 min, e os sobrenadantes foram incubados com 200 ug /ml de RNase A a 37 ° C durante 1 h. Subsequentemente, as amostras foram incubadas com 200 ug /ml de protease K a 50 ° C durante 30 min. Após precipitação com isopropanol, o DNA foi ressuspenso numa solução de Tris-EDTA. As amostras foram resolvidas por electroforese num gel de agarose a 2% e visualizados por coloração com brometo de etídio e transiluminação UV.

análise de citometria de fluxo de células apoptóticas

para identificar células apoptóticas, pcDNA- ou pcDNA-GM3 As células HCT116 foram tratadas com -transfectaed CDDP, durante 24 h. As amostras foram lavadas com PBS, coradas com 1 ug /mL de FITC-anexina V (BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 10 min no escuro à temperatura ambiente e analisadas por citometria de fluxo utilizando um instrumento FACS Calibur (Becton-Dickinson )

análise HPTLC de gangliosídeos

gangliosídeos a partir de células cancerígenas do cólon humano tratados com ou sem CDDP (1,5 × 10

7 células) foram extraídas com clorofórmio:. metanol: água (2: 1:0.4, v /v /v), e foram fraccionadas e analisadas por HPTLC utilizando placas de gel de sílica 60 (Merck). As placas foram desenvolvidas com clorofórmio: metanol: 0,2% de CaCl aquosa

2 (55:45:10, v /v /v). Os gangliósidos foram visualizadas por pulverização a placa com o reagente de resorcinol cloridrato.

A preparação e transfecção de pequenos RNAs de interferência (ARNsi)

Um ARNic em cadeia dupla desenhado para atingir a sequência de codificação de ARNm de sintase humana e GM3 ARNm da proteína de planta da clorofila a /b de ligação como um controlo negativo foram sintetizados por Bioneer Corporation. As sequências alvo para ARNsi sintase GM3 são 5′-GUAUGUAACGAUGUUGUAU-3 ‘, 5′-CAUCAAAGAGACUGCCUUU-3′, 5’-e CAGGUAUAGCGUGGACUUA-3 ‘. células cancerígenas do cólon HCT116 foram transfectadas com ARNsi sintase GM3 e siRNA controlo negativo, respectivamente, usando WelFect-EX ™ PLUS (JBI), de acordo com as instruções do fabricante. Um dia após a transfecção, os complexos de transfecção foram removidos e substituídos com meio de cultura. Após incubação com CDDP em meio de cultura por 24 h, as células transfectadas foram utilizadas para análise posterior.

Resultados

CDDP induz a apoptose através da acumulação de ROS

Para determinar o capacidade de CDDP para induzir apoptose em células HCT116, as células foram tratadas com várias concentrações de CDDP, durante 24 h e o ADN isolado a partir de células HCT116 tratados com CDDP foram resolvidas por electroforese. Como mostrado na Fig. 1, a CDDP induzida fragmentação do ADN. Nós também examinou o efeito de CDDP em sinais de apoptose dependente da mitocôndria e a expressão da p53 durante a apoptose induzida por CDDP. O tratamento de células HCT116 com CDDP resultou no aumento da expressão de p53 e Bax, bem como a redução da expressão de Bcl-2. Além disso, o tratamento com CDDP resultou no aumento da clivagem da PARP, indicando activação de caspase através da libertação de citocromo c, através da redução do potencial de membrana mitocondrial (Fig. 1B). Como a geração de ROS foi reportado para desempenhar um papel importante na citotoxicidade induzida pela CDDP [24], foi avaliado o efeito de tratamento com CDDP no estado redox intracelular de células HCT116. Comparou-se a produção de ROS nas células tratadas com a CDDP em células que a CDDP não tratados por análise de citometria de fluxo utilizando H

2DCFDA. Como mostrado na Fig. produção 1C, ROS foi aumentada em CDDP- células tratadas, em comparação com células não tratadas CDDP-. No entanto, o tratamento concomitante com NAC, um inibidor de ROS, juntamente com CDDP reduz a acumulação intracelular de ROS (Fig. 1C). Correlacionada com a capacidade inibidora para induzir ROS, NAC também foi capaz de inibir significativamente a sinais de morte celular na presença de CDDP, como evidenciado por Western blotting. Como mostrado na Fig. 1D, CDDP induzida a expressão das proteínas de apoptose Bax e p53, bem como a clivagem de PARP e induzida a expressão reduzida de proteína anti-apoptótica de Bcl-2. Estes efeitos de CDDP em células cancerígenas do cólon humano foram bloqueados por NAC. Estes resultados indicam que a geração de ROS por CDDP é necessária para a apoptose de células HCT116.

(A) após um tratamento de CDDP nas concentrações indicadas, durante 24 h, o ADN genómico foi isolado e separado por electroforese sobre um 2% gel de agarose. O ADN foi corado com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV. (B) proteína total a partir de células HCT116 foi isolado, e análise de imunotransf erência foi realizada com os anticorpos indicados. As células HCT-116 (C) foram tratadas com ou sem 30 ug /ml de CDDP após pré-tratamento com NAC 10 nM, seguido pela substituição do meio de cultura com meio preparado de fresco contendo 10 uM DCFH-DA. Após 30 min de incubação a 37 ° C, a intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo. Os resultados representam o aumento para o dobro a partir de seus respectivos controlos (células não tratadas com a CDDP), considerado como 1. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 medições independentes.

*** P 0,001 vs. o controlo tratado com CDDP. (D) As células HCT116 foram tratadas com ou sem a CDDP (30 ug /ml) após pré-tratamento do NAC (10 nM). A proteína foi isolada a partir das células e analisados ​​por imunotransferência utilizando anticorpos indicados. GAPDH foi incluído como um controlo interno.

CDDP aumenta gangliosídeo GM3 em células de cancro do cólon

Estudos anteriores relataram que a apoptose celular é causada pela alteração da composição da membrana [13], [14] .que examinado se a CDDP em células HCT116 regula os níveis de expressão de genes da sintase de GM2 e GD3 e os gangliósidos GD3 e de GM2, mas não se verificaram alterações, tanto nos parâmetros de expressão de genes (dados não mostrados) e a produção de gangliósido (Fig . 2D). CDDP aumentou a expressão de GM3-sintase apenas nas células HCT116 induzida pela CDDP (Fig. 2a). Além disso, também foi investigado se a CDDP induz a expressão de GM3-sintase utilizando outras células de cancro do cólon tais como, DLD-1, LoVo e WiDr. tratamento com CDDP resultou em aumento da expressão de sintase de GM3 em outras linhas de células de cancro do cólon humano (dados não mostrados). Nós investigado se a expressão de GM3-sintase, no presente modelo de células de cancro do cólon HCT116 humano é induzida pela utilização de outros agentes quimioterapêuticos (5-fluorouracilo e doxorrubicina), que são bem conhecidos para induzir a apoptose de várias células de cancro humano, bem como células cancerígenas do cólon. A expressão de GM3-sintase não foi induzida por ambos os agentes anti-cancro (dados não mostrados). Como mostrado na Fig. 2A, os níveis de ARNm de GM3-sintase foram aumentados em células HCT116 induzidas pela CDDP, como evidenciado por RT-PCR. Além disso, foi investigado se a actividade do promotor do gene da sintase GM3 é estimulada em células HCT116 induzidas pela CDDP. Recentemente, relataram a regulação da transcrição mediada por CREB do gene humano sintase GM3 [23]. Assim, para determinar a actividade do promotor do gene da sintetase de GM3 por CDDP, GM3 promotor do gene da sintetase (pGL3-1600), mutação do promotor de CREB GM3 sintase (pGL3-1600 CREB Mu) e plasmídeos pGL3-Basic foram transfectados em células HCT116 com, ou sem CDDP , respectivamente, seguido por medição da actividade da luciferase utilizando um ensaio de repórter. Como mostrado na Fig. 1B, a actividade de transcrição em células de pGL3-1600 HCT116 tratados com CDDP foi significativamente mais elevada do que nas células de controlo não tratadas e nas células HCT116 transfectada pGL3-Basic-com ou sem tratamento com CDDP. Como esperado, a actividade de transcrição do mutante de CREB marcadamente diminuída em cerca de duas vezes em comparação com o promotor pGL3-1600 em células HCT116 tratados com CDDP. Além disso, como mostrado na Fig. 2C, um aumento na produção de gangliósido GM3 foi observada em células induzidas por HCT1116 CDDP, como evidenciado pelo ensaio de imunofluorescência. Imunofluorescência actividade de GM3 em células tratadas com CDDP tornou-se altamente detectável de uma maneira dependente da dose, enquanto que nas células não tratadas não foi detectado, utilizando M2590 como um anticorpo monoclonal específico de GM3 e anticorpo secundário como um controlo negativo, respectivamente. Além disso, nós investigamos padrões de gangliósidos em células HCT116 tratados com e sem a CDDP usando análise HPTLC. Curiosamente, entre os gangliósidos, o gangliósido GM3 foi significativamente aumentada em células HCT116 tratados com CDDP comparado a qualquer controlo CDDP (Fig. 2D). Estes resultados mostram claramente que tanto a expressão da sintase do gangliósido GM3 e produção GM3 estão aumentadas em células HCT116 tratados com CDDP.

(A) RNA total a partir de células HCT116 foi isolado após o tratamento com as concentrações indicadas de tratamento com CDDP para 12 h e GM3 sintase ARNm foi detectada por RT-PCR. (B) As células HCT116 foram transfectadas transientemente com o promotor do gene sintase GM3 (pGL3-1600) e a mutação de CREB promotor sintase GM3 (pGL3-1600 CREB Mu), e depois cultivadas com ou sem a CDDP, durante 12 h. A actividade de luciferase foi determinada a partir de lisados ​​de células, como descrito nos Materiais e Métodos. Os resultados mostrados são médias ± DP de três experiências independentes com medição triplicado.

*** P 0,001 vs. o controlo tratado com CDDP. (C) As células HCT116 foram cultivadas e, em seguida, incubadas com a concentração indicada de tratamento com CDDP, durante 12 h. A imunorreactividade contra gangliósido GM3 foi detectada utilizando um isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-ratinho caprino conjugado IgM-sem ou com o anticorpo M2590. (D) Os gangliósidos isolados a partir das células HCT-116 tratados com CDDP (0, 10, e 30 ug /ml) foram analisados ​​por HPTLC.

A regulação negativa do gangliósido GM3 GM3 por siRNA alvejando sintase protege apoptose celular por CDDP

Os nossos dados anteriores mostraram que CDDP induzida eventos de sinal apoptóticos através da produção de ROS, e expressão de gangliósido GM3 sintase e seu produto GM3 reforçada. Assim, para determinar se o aumento do gangliósido GM3 em células HCT116 tratados com CDDP foi associada com apoptose mediada CDDP, nós concebemos três siRNAs dirigidos especificamente contra GM3 sintase (siGM3). No. 2 e 3, mas não de três No. 1 siGM3 claramente expressão de GM3-sintase regulada negativamente em células HCT116 tratados com CDDP, como determinado por análise de RT-PCR (Fig. 3A). Além disso, siGM3 2 e 3, mas não 1 (Fig. 3B) restaurado padrões de Bax, Bcl-2 e p53 expressão em células tratadas com CDDP para aqueles em células não induzidas CDDP. Estes resultados sugerem que a sobre-regulação de GM3 é necessária para a apoptose de células HCT116 induzidas pela CDDP.

células HCT116 foram transfectadas com ARNsi de segmentação três GM3 e siRNA controlo negativo. As células foram então cultivadas durante 12 (30 ug /mL). Total de RNA e de proteína de lisados ​​de células foram preparados como descrito em Materiais e Métodos. (A) Os níveis de ARNm de sintase GM3 no ARN total obtido a partir de cada célula foi detectada por RT-PCR. (B) proteína total foi preparado a partir das células e analisado por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados.

O acessório de gangliósido GM3 em células HCT116 tratados com CDDP regula 12-lipoxigenase (12-LOX) activação para a produção de ROS

morte das células nervosas induzida por glutamato em resultado a produção de ROS através da activação 12-LOX, e localização induzida de 12-LOX para a membrana, que está relacionada com a activação de 12-LOX [25]. Os nossos colegas relataram que 12-LOX é recrutado para glicoesfingolipídio enriquecidas microdomínios (GEM) na forma de um gangliósido GM3-dependente durante a toxicidade do glutamato oxidativo [21]. Os nossos dados mostram que a CDDP induzida sinais de apoptose dependente de mitocôndrias através da geração de ROS gangliósido GM3-mediada em células HCT116 (Fig. 3 e Fig. 4A). Assim, investigou-se um inibidor específico de 12-LOX, baicaleína inibe a actividade 12-LOX para a produção de ROS em células HCT116 que expressam o gangliósido GM3 induzida pela CDDP. Como mostrado na Fig. 4B, CDDP induzida expressão sintase GM3 e produção de ROS. No entanto, baicaleína suprimiu a produção de ROS CDDP estimulada, embora a expressão GM3 sintase induzida pela CDDP não foi regulamentada pelo baicaleína. Além disso, o limpador NAC ROS, inibiu a produção de ROS, mas não sintase GM3 em células HCT116 tratados com CDDP. Estes resultados sugerem que gangliosídios induzida CDDP expressão GM3 pode regular a actividade de 12-LOX para a produção de ROS através de recrutamento 12-LOX a GEM.

Células HCT116

(A) foram transfectadas com siRNA segmentação GM3 e controle negativo siRNA. As células foram então cultivadas durante 12 h na presença ou ausência de CDDP (30 ug /mL). O meio de cultura foi substituído por meio preparado de fresco contendo 10 uM DCFH-DA. Após 30 min de incubação a 37 ° C, a intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 medições independentes.

** P 0,01 e

*** P 0,001 vs. o controlo tratado com CDDP. ns: nenhum significado. Para RT-PCR, preparou-se ARN total e lisados ​​de proteína das células tal como descrito em Materiais e Métodos. Os níveis de ARNm de sintase GM3 no ARN total obtido a partir de cada célula foram detectados por RT-PCR. (B) As células HCT116 foram tratadas com ou sem 30 ug /ml de CDDP após pré-tratamento de 10 nM ou 1 fiM NAC baicaleína, e, em seguida, o meio de cultura foi substituído por meio preparado de fresco contendo 10 uM DCFH-DA. Após 30 min de incubação a 37 ° C, a intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 medições independentes.

*** P 0,001 vs. o controlo tratado com CDDP. Para RT-PCR, preparou-se ARN total e lisados ​​de proteína das células tal como descrito em Materiais e Métodos. Os níveis de ARNm de sintase GM3 no ARN total obtido a partir de cada célula foram detectados por RT-PCR.

apoptose induzida pela CDDP é aumentada em células HCT116 que expressam em excesso GM3 sintase

Para examinar a sensibilidade da apoptose CDDP mediada entre as células HCT116 e células HCT116 com superexpressão GM3 sintase, geramos transfectantes estáveis ​​que expressam GM3. O vector de expressão pcDNA3-GM3 ancorando o ADNc humano sintase GM3 (HCT116 /GM3) e pcDNA3 vector vazio (falsa) foram transfectados em células HCT116. Após selecção das colónias resistentes a G418, que confirmou que a expressão de GM3 ARNm de sintase e gangliósido GM3 foram altamente expresso em células HCT116 /GM3 em comparação com células transfectadas por simulação, tal como evidenciado por RT-PCR e ensaio de imunofluorescência (Fig. 5A). Estes resultados mostram que a sintase GM3 enzimaticamente activa é sintetizada em células HCT116 /GM3. Sob condições de cultura normais (10% de FBS), a taxa de crescimento de HCT116 /células GM3 não era diferente em comparação com células de controlo, e alterações nos sinais apoptóticos não foram observadas nestas células, como evidenciado por análise de Western blot (dados não mostrados). No entanto, quando esses transfectantes foram tratados com CDDP de um modo dependente da dose, os números mais elevados de células dissociadas da placa em HCT116 /GM3 em comparação com células falsamente tratadas com 30 ug /ml de CDDP. Com efeito, as células HCT116 /GM3 mostraram-se mais sensíveis do que a CDDP em células pseudo inibição do crescimento celular, tal como evidenciado pelo ensaio de XTT (Fig. 5B). Além disso, foi observado um aumento nos danos do ADN após a exposição a CDDP em HCT116 /células GM3 em comparação com células falsamente tratados utilizando um ensaio de fragmentação de DNA (Fig. 5C). Uma vez que a Anexina V a fosfatidilserina manchas virado para fora do lado exterior da membrana plasmática, lançando fora da fosfatidilserina a partir do lado interno para o lado externo da membrana plasmática é conhecido por ser uma das características de células apoptóticas. No presente estudo, como mostrado na Fig. 5D, células positivas para anexina V, medida por citometria de fluxo, também foram significativamente aumentados em células HCT116 /GM3 tratados com CDDP comparação com células falsamente. Para investigar o mecanismo molecular subjacente ao efeito sensibilizador de GM3 em citotoxicidade induzidas pela CDDP, a degradação de PARP mediada por caspase por redução de potencial mitocondrial foi avaliada após o tratamento de CDDP a várias concentrações (Fig. 5E). A análise Western blot mostrou que em células /GM3 HCT116 o nível de clivagem de PARP foi aumentada em comparação com células falsamente. Estes resultados sugerem que GM3 sensibiliza células HCT116 a apoptose induzida por CDDP. Os nossos resultados mostraram que as ROS desempenha um papel central em células HCT116 induzidas pela CDDP, levando a célula a apoptose. Comparou-se a produção de ROS em células HCT116 /GM3 para que, em células simuladas por análise de citometria de fluxo utilizando H

2DCFDA. Como mostrado na Fig. 5F, a produção de ROS induzidas pela CDDP foi aumentada em HCT116 /células GM3 em comparação com células falsamente, mas não em células de NAC-pré-tratados, indicando que o aumento nos níveis de GM3 é necessário para a produção de ROS em apoptose induzidas pela CDDP de células HCT116. Estes dados indicam que a produção de ROS é dependente dos níveis de GM3 em células HCT116 induzidas pela CDDP.

(A) RT-PCR e ensaio de imunofluorescência confirmaram a expressão da sintase GM3 GM3 e o seu produto em um transfectante estável da pcDNA- GM3 em células HCT116. Como controle, vector sozinho (pcDNA) HCT116 -transfected não expressa GM3. , vector (pcDNA3) HCT116 células -transfected /células GM3, pcDNA3-GM3-transfectadas em falso. viabilidade (B) celular foi avaliada 24 horas após o tratamento com CDDP nas concentrações indicadas, utilizando ensaio de XTT em HCT116 /células GM3 em comparação com células falsamente tratados. Os dados são médias ± DP de três experiências independentes. (C) Após o tratamento de CDDP nas concentrações indicadas, durante 24 h, o ADN genómico foi analisado num gel de agarose a 2%. (D) as populações de células apoptóticas foram medidos por análise de FACS Calibur utilizando Anexina V-coloração tal como descrito nos Materiais e Métodos. As setas indicam populações apoptóticos em células simuladas e HCT116 /GM3, respectivamente. (E) HCT116 /GM3 ou células falsamente foram tratados com indicados as concentrações de CDDP, durante 12 h. Os lisados ​​de células inteiras e meios de sobrenadante foram preparados e analisados ​​por imunotransferência como descrito em Materiais e Métodos, utilizando os anticorpos indicados. (F) O efeito do tratamento com CDDP foi medida na distribuição da fluorescência de oxidação DCFH em HCT116 /GM3 ou células falsamente. Como mostrado na Fig. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.