Abstract

A transição epitelial-mesenquimal (EMT) induzida por EGF promove a progressão do cancro do colo do útero; No entanto, os mecanismos subjacentes ao EMT induzida por EGF permanecem obscuros. Neste estudo, nós relatamos que miR155 superexpressão suprimida EMT induzida por EGF, diminuição da capacidade de migração /invasão, proliferação celular inibida e aumentou a quimio-sensibilidade a DDP em células de câncer cervical Caski humanos. Além disso, a sobre-expressão de miR155 aumento da expressão do gene TP53, mas reduzida Smad2, e os níveis de expressão CCND1. Estes dados sugerem que regula negativamente miR155 EMT induzida por EGF. Concluímos que miR155 não actua como um oncogene, mas como um supressor de tumor em células Caski

citação:. Lei C, Wang Y, Huang Y, Yu H, Huang Y, Wu L, et ai. miR155 (2012) Up-regulada Inverte a transição epitelial-mesenquimal Induzida por EGF e aumenta Chemo-sensibilidade a cisplatina em células CaSki cancro do colo do humano. PLoS ONE 7 (12): e52310. doi: 10.1371 /journal.pone.0052310

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de agosto de 2012; Aceito: 16 de novembro de 2012; Publicação: 20 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro para este trabalho foi fornecida pelo Natural Science Foundation da província de Hubei (Grant não. 2011CDB181), Fundo de Investigação Independente, Universidade de Wuhan (no. 201130302020016). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não há interesses concorrentes exsit

Introdução

o câncer cervical é o segundo maior classe de tumores malignos para as mulheres, e isso põe em perigo a saúde das mulheres, especialmente nos países em desenvolvimento. Metástase e invasão são as principais razões para a morte em casos de câncer cervical, portanto, é importante para esclarecer os mecanismos moleculares destes fenómenos. Tem sido relatado que o epitelial para mesenquimal (EMT) é um processo importante envolvida na metástase e invasão do tumor [1]. As principais características de EMT incluem a dissolução de junções apertadas epiteliais, remodelação do citoesqueleto, a perda de polaridade apical-basal, e a aquisição de marcadores mesenquimais, tais como N-caderina e vimentina. EMT dota células tumorais com maiores capacidades invasivas /metastáticos, caule características semelhantes a células, resistência à apoptose, e a tolerância imunológica [2].

EGF (factor de crescimento epitelial) é um dos factores mais importantes reguladoras que EMT desencadeia EMT numa variedade de tumores sólidos, incluindo o cancro do colo do útero. Tem sido relatado que os tumores com expressão do receptor de EGF alta têm mau prognóstico clínico e EMT induzida por EGF pode ser uma razão para isto [3] – [5]. Assim, a prevenção de EMT induzida por EGF pode ser um método adequado para inibir a invasão e metástase.

Estudos recentes têm sugerido que miARNs desempenham um papel importante na regulação da EMT [6], [7]. miARNs são RNAs não codificantes de 18 a 25 nucleótidos de comprimento que podem regular a expressão do gene através da aceleração da degradação e inibir a tradução do ARNm alvo. Entre os miARNs identificados até à data, miR155 está associada com a proliferação do tumor e é sobre-expressa em muitos tumores humanos [8]. Um estudo ilustrado que a expressão anormal de miR155 foi um evento precoce no câncer de pâncreas e estreitamente relacionada com a baixa taxa de sobrevivência [9]. No cancro do endométrio, a ocorrência de EMT foi acompanhado por níveis elevados de expressão miR155 [10]. Ainda não está claro se miR155 está envolvido com a ocorrência de EMT em câncer cervical. Neste estudo, usando EGF como um factor de indução de EMT em células de cancro cervical humano, exploramos os papéis reguladores de miR155 no processo de TEM, a proliferação celular, a sensibilidade celular a fármacos quimioterapêuticos, e avaliado o valor potencial de miR155 como um alvo molecular para a prevenção precoce da invasão câncer cervical e metástases.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

células Caski foi comprado a partir do celular Bank of China (Wuhan) e foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO2 em meio RPMI-1640 contendo soro fetal bovino a 10% (FBS), 100 ug /ml de estreptomicina, e 100 unidades /ml de penicilina.

Isolamento de ARN e detecção de miARN

ARN a partir das células em cultura foi isolado com Trizol reagente (Invitrogen) e foi, em seguida, utilizado para sintetizar ADNc de primeira cadeia. A detecção dos miARNs maturados foi realizada com PCR, utilizando o TM SYBR Premix Ex Taq

(TAKARA). U6 foi usada como um controlo interno. Os iniciadores utilizados nesta experiência são apresentados na Tabela S1.

Construção de plasmídeo e Transfecção Estável /transiente de miR155

Um fragmento de DNA genómico humano de aproximadamente 400 pb contendo a sequência miR155 foi clonado no pcDNA3.1-GFP vector. O plasmídeo resultante pcDNA3.1-GFP-miARN-155 transporta uma sequência de ADN recombinante para GFP e o fragmento contendo miR155. Para gerar uma linha celular que expressa estavelmente miR155, células Caski foram transfectadas com pcDNA3.1-GFP-miR155 utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen). Após selecção com G418, o único clone que sobre-expressa miR155 foi identificado. Para miR155 superexpressão transitória, miR155 imita (RIBOBRO) foram utilizados para transfectar as células Caski.

In vitro

migração e invasão Ensaios

ensaio transpoço baseado em Matrigel A foi utilizada a migração de células de ensaio e invasão

in vitro

como descrito anteriormente [11]. Para a análise das propriedades invasivas, 2 × 10

4 células foram semeadas em cima das inserções de cultura de células revestidas Matrigel em 200 ul de meio RPMI-1640 sem FBS e incubadas durante 24 horas. As inserções foram em seguida lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixadas em paraformaldeído a 4%. Depois de ter sido manchado com hematina, as células invasivas foram contados sob o microscópio. O ensaio de migração foi realizada pela mesma maneira descrita acima, excepto que não foi revestida Matrigel nas inserções.

Western Blot (WB)

A proteína total foi extraído a partir de células utilizando tampão de lise celular (0,5 % de NP-40, 0,5% de SDS, 1,5 mM de Tris-HCl a pH 7,4, e NaCl 15 mM). As amostras de proteínas (20 ^ g /pista) foram sujeitas a electroforese, transferidos para membranas de PVDF e incubadas durante a noite com anticorpos primários contra a E-caderina (sc-7870, Santa Cruz Biotechnology), N-caderina (BA0637, BOSTER), MMP1 (130-1- 16, RayBiotech), e anexina A2 (A2485, Sigma). As membranas foram tratadas com anticorpos secundários conjugados com HRP de cabra anti-coelho (Invitrogen). As bandas de proteínas-alvo foram determinados utilizando os reagentes fornecidos no ECL + plus kit (cuidados de saúde GE, Piscataway, NJ, EUA).

Imuno fluorescência Análise

Immuno fl análise de fluorescência foi usado para testar os níveis de expressão de e-caderina com anticorpos contra a e-caderina (sc-7558, Santa Cruz Biotechnology), e a expressão de N-caderina com anticorpos contra N-caderina (BA0637, BOSTER) tal como descrito anteriormente [12].

Ensaio de Proliferação celular

e CaSki CaSki-miR155 foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e cultivadas a 70% de confluência. As células foram tratadas com DDP (cis-diaminodicloroplatina, DDP) para 0-3 dias em meio RPMI-1640. O meio em cada poço foi removido, e 100 ul (metil tiazolil tetrazólio, MTT) foi adicionada uma solução de (0,25 g /L em meio RPMI-1640). Após incubação a 37 ° C durante 4 horas, o meio foi removido e 200 ul de DMSO foi adicionado a cada poço. A absorvância (A) a 570 nm foi registada. A taxa de taxa de crescimento celular e inibidor foram calculados como segue:

citometria de fluxo

células Caski e CaSki-miR155 foram colhidas na fase logarítmica de crescimento e fixo durante a noite com 80% de etanol. As células foram então lavadas com PBS frio, coradas com iodeto de propídio (PI, 0,05 mg /mL) e RNase A (0,5 mg /ml). A análise de citometria de fluxo foi usada para determinar a distribuição das células no ciclo celular e sub-fases para medir o pico de apoptose induzida por DDP (10 umol /ml) durante 24 horas.

Análise estatística

Todos os dados foram apresentados como a média ± desvio padrão (SD). A análise estatística entre os grupos foram avaliadas pelo teste t e ANOVA bicaudal de Student. Os valores de p inferior a 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

Resultados

EGF induz EMT em células Caski

Tem sido relatado que o receptor EGF é altamente elevados no células de cancro cervical, o que sugere que a exposição EGF pode induzir EMT nas linhas de células cervicais [13], [14], [15]. Nesta experiência, as células Caski foram cultivadas em condições de rotina, com ou sem EGF (50 ng /mL) durante 1, 3 ou 5 dias, e as alterações relacionadas com o EMT foram determinados. A alteração morfológica foi visualizado pela primeira vez no presente processo. Após estimulação EGF, células Caski tornou-se mais fusiforme e a ligação entre as células diminuiu (Figura 1A). Quando a E-caderina (E-cad) expressão foi analisada por WB, os resultados ilustram que a exposição de EGF regulada negativamente a expressão de E-cad em comparação com as células de controlo (Figura 1B). A regulação negativa similar de expressão de E-cad foi verificada por um ensaio de SE em que as células Caski foram tratadas com EGF (50 ng /ml) durante 3 dias (Figura 1c). Ao mesmo ponto de tempo, que também detectada a expressão de outros factores relacionados com o EMT (N-caderina, MMP1 e A2 anexina) por WB e descobriu que todos os três factores foram regulados positivamente (Figura 1D). Estes dados indicam que o EGF pode induzir EMT nas células Caski.

células Caski foram cultivadas sob condições de rotina, com ou sem EGF (50 ng /ml) durante 1 a 5 dias. A. As alterações morfológicas causadas pela EGF foram observados por microscopia. B. Regulação a jusante de E-caderina através de tratamento com o EGF foi determinada por Western blot. A análise densitométrica de três manchas de Western em triplicado independentes. C. E-caderina regulação negativa em resposta a EGF (/50 ng ml) tratamento de 3 dias foi verificada por meio de IF. D. A sobre-regulação de N-CAD, MMP1 e A2 anexina no processo EMT investigado como por Western blot. A análise densitométrica de três manchas de Western em triplicado independentes. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro. * P 0,05, ** P . 0,01, comparado com o controlo

miR155 é regulada positivamente no EMT induzida por EGF

O ARN total foi purificado a partir do mesenchymal- induzida por EGF Caski como células e células Caski normais. Os níveis de miR155 ou miR200c de expressão foram detectados através da realização de PCR em tempo real sobre estes ARNs totais. Os resultados mostraram que, em comparação com as células Caski normais, miR155 foi grandemente regulados positivamente em células Caski mesenquimais, mas não foi observada nenhuma alteração do nível de expressão para miR200c, que se verificou ser regulada negativamente durante o processo de TEM em muitos tumores sólidos por outros estudos [ ,,,0],16], [17] (Figura 2).

A. Os níveis de expressão relativos de miR155 e miR200c foram detectadas por PCR em tempo real. miR155 foi regulada positivamente com 3 dias de tratamento com o EGF (50 ng /ml), e nenhuma alteração foi encontrada no nível de expressão miR200c sob estimulação EGF. O rácio de expressão miR155 relativa em EGF tratamento /controle é 12,21. As experiências foram repetidas 3 vezes. T-teste foi utilizado para a análise estatística; ** P 0,01. B. O nível de expressão regulada positivamente miR155 foi verificada por PCR de transcrição reversa. U6 foi usada como um controlo interno, a pista 1 e 2 são o tratamento EGF, pista 3 é o controle negativo, 4 lane é marcador, pista 5 e 6 são controle (sem EGF).

A sobre-expressão de miR155 Inibe EMT

Embora miR155 foi muito regulada no processo EMT induzida por EGF, é possível que este é apenas um evento compensatório ou um fenômeno relacionado. Para esclarecer melhor o papel de miRNA155 no processo EMT, uma linha celular CaSki com sobre-expressos miR155 (CaSki-miR155) foi criado por transfecção de plasmídeo pcDNA3.1-GFP-miR155 nas células Caski, com expressão miR155 ser verificada por meio de reais -tempo de PCR (Figura 3A). Utilizando esta linha de célula como um modelo, verificou-se que a sobre-expressão de miR155 inibiu o crescimento de células e interferência com o ciclo celular através da diminuição da proporção de células na fase S (17% em células de controlo Caski, 5,4% em CaSki-miR155) mas aumentando a proporção de células em fase G1 (63,7% em células de controlo Caski, 81,4% em CaSki-miR155), como mostrado na Figura 3B. A regulação negativa induzida pelo EGF da expressão de E-caderina foi parcialmente revertida por imita miR155 transitoriamente transfectadas (Figura 3C). Com miR155 sobre-expressão, a morfologia das células tornaram-se mais cubóide. Após 3 dias de tratamento com o EGF (50 ng /mL), apenas uma pequena porção de células CaSki-miR155 foram transformados em células fusiformes (Figura 3D). Estes resultados indicam que a sobre-expressão de miR155 inibiu EMT EGF-induzida.

. Após pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 transfecção, o nível de expressão miR155 aumentou mais de 12 vezes, mas não houve diferença significativa para a expressão miR200c. A experiência foi repetida 3 vezes de forma independente. ** P 0,01 em comparação com as células de controlo. B. proliferação celular foi testada por MTT. Os resultados mostram que a sobre-expressão miR155 inibiram significativamente a taxa de crescimento celular. P 0,05 em comparação com as células de controlo. A citometria de fluxo foi usada para testar os efeitos da sobre-expressão miR155 sobre o ciclo celular. Os resultados mostram uma diminuição da proporção de células na fase S (17% em células de controlo Caski, 5,4% em CaSki-miR155), mas um aumento da proporção de células em fase G1 (63,7% em células de controlo Caski, 81,4% em CaSki-miR155). A experiência foi repetida 3 vezes de forma independente. P 0,01 em comparação com as células de controlo. expressão C. E-cad foi testada por western blot. nível de expressão de E-caderina foi grandemente diminuído de 3 dias de EGF (50 ng /ml) a exposição em células Caski. A análise densitométrica de três manchas de Western em triplicado independentes. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro. * P 0,05. Este efeito foi parcialmente prevenida por transfecção com imita miR155. D. As alterações morfológicas causadas por miR155 superexpressão. células CaSki-miR155 cúbica são mais do que as células normais Caski. Quando tratadas com EGF (50 ng /ml) durante 3 dias, apenas uma pequena fracção de células CaSki-miR155 foram transformados em células fusiformes semelhantes.

e TP53 Smad2 foram ligados ao EMT via regulamentar [18], [19]. Por rastreio TargetScan (https://www.targetscan.org), TCF4, CCND1 Smad2 e foram previstos para ser os genes alvo de miR155. Assim, investigou-TP53, Smad2, TCF4, cMyc e os níveis de expressão de mRNA em células Caski CCND1 tratados com EGF (50 ng /ml) durante 3 dias, com ou sem transfecção de imita miR155 (Figura 4). Os resultados mostraram que TP53 foi regulada negativamente no processo EMT induzida por EGF e regulada positivamente pela miR155 sobre-expressão, mas a expressão induzida por TP53 miR155 foi completamente revertido por tratamento com EGF. miR155 superexpressão diminuição da expressão Smad2. Embora TCF4 foi verificada como uma proteína alvo miR155 por outro grupo [20], não houve mudanças significativas foram observadas em nossos experimentos para a expressão de mRNA TCF4 nas células e miR155 imitam transfectadas induzida por EGF. Além disso, não se observaram alterações para cMyc, que é um alvo a jusante de e é regulada por TCF4. CCND1 (uma proteína reguladora do ciclo celular e um outro alvo a jusante de TCF4) nível de expressão de ARNm foi regulada negativamente por miR155 sobre-expressão e pode ser parcialmente revertida por tratamento com EGF. Assim, nós supor que miR155 revertida EMT EGF-induzida por upregulating TP53, downregulating níveis de expressão Smad2, e restringindo o crescimento celular através da inibição da expressão CCND1.

A. sites na 3’UTR de Smad2, TCF4 e CCND1 mRNAs previstos miR155 vinculativo. B. TP53, Smad2, TCF4, cMyc ARNm e CCND1 níveis de expressão foram testados por PCR em tempo real em células Caski tratados com EGF (50 ng /ml) durante 3 dias, com ou sem transfecção de imita miR155. TP53 foi regulada negativamente por tratamento com EGF mas significativamente regulada positivamente por miR155 superexpressão. Este aumento da expressão do gene TP53 foi revertido por tratamento com EGF. Smad2 foi regulada negativamente por tratamento com EGF e ambos miR155 superexpressão. células tratam miR155-superexpressão com EGF resultou em uma redução ainda maior da Smad2. Não foram observadas mudanças significativas no TCF4 ou mRNA cMyc entre as células EGF-tratados e miR155 mímica-transfectadas. expressão de mRNA CCND1 foi regulada negativamente por miR155 superexpressão, e essa regulação negativa foi parcialmente revertida pelo tratamento EGF.

A superexpressão do miR155 inibe a Capacidades de migração e invasão das células Caski

Para elucidar a efeitos da miR155 sobre migração e invasão em células Caski

in vitro

, transpoço invasão /ensaios de migração foram realizadas (Figura 5). células Caski normais CaSki-miR155 e foram semeadas nas inserções. Após 24 horas, foi calculado o número de células que tinham sido transferidas para o lado inferior da membrana para quantificar a capacidade de invasão e de migração. O número de células que passou através da membrana foi significativamente inferior nas células CaSki-miR155 do que nas células normais Caski. Assim, nós supor que miR155 impede as capacidades invasivas e migração em células Caski

in vitro

.

Células

CaSki-miR155 e Caski foram semeadas em Transwell insere com ou sem Matrigel. As inserções foram fixadas e coradas após 24 horas, e em seguida, as células invasoras /migratórias foram contadas sob um microscópio. O número de células CaSki-miR155 que passam através da membrana foi significativamente menor do que nas células Caski normais, se detectada por ensaios de migração ou invasão. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro. * P . 0,05

miR155 Aumentou o Chemo-sensibilidade das células Caski para DDP

O método MTT foi utilizado para detectar o efeito de miR155 superexpressão na quimio-sensibilidade do CaSki células para DDP. Os resultados indicaram que a taxa de inibição de CaSki-miR155 quando tratados por DDP eram muito maiores do que o das células normais Caski de uma forma dependente da dose. A taxa de proliferação de células CaSki-miR155 quando tratados por DDP foi muito mais lenta do que a das células normais Caski de uma forma dependente do tempo (Figura 6 A, B). O tratamento com DDP (10 umol /L) durante 24 horas resultou numa proporção muito mais elevada de células apoptóticas em células CaSki-miR155 do que nas células normais Caski (Figura 6c). O nível de anexina A2, com uma proteína envolvida na resistência à apoptose, expressão foi determinada através de WB. Estes resultados não mostram que a anexina A2 foi regulada negativamente por miR155 superexpressão (Figura 6D).

A. células CaSki CaSki e-miR155 foram tratados com diferentes doses de DDP durante 24 horas, e a taxa de inibição foi avaliada por um ensaio MTT. Média ± DP, n = 4, P 0,05 por ANOVA. B. proliferação celular foi avaliada com um ensaio MTT. células CaSki CaSki e-miR155 foram tratados com DDP (10 umol /L) durante 0-3 dias. Média ± DP, n = 4, P 0,05 por ANOVA. C. Microscopia foi usado para observar a apoptose de células Caski e CaSki-miR155 induzidas por DDP (10 umol /L) durante 1 dia. As células foram recolhidas, e FCM foi utilizado para ensaiar a apoptose. As setas indicam a localização do pico de apoptose. D. expressão anexina A2 foi determinada por Western blot. A expressão anexina A2 não foi regulamentada pelo miR155 superexpressão e poderia ser regulada por tratamento com EGF. A análise densitométrica de três triplicado independente Ocidental blots.P 0,05, em comparação com miR155- miR155 +, * P 0,05, EGF em comparação com EGF +

Discussão

EMT é um. processo dinâmico, que pode ser regulado e invertido por muitos factores, incluindo miARNs. Neste estudo, foi utilizada a linha de células de cancro humano CaSki cervical como o modelo para investigar o papel da miR155 na EMT induzida por EGF e tentou responder à questão de saber se miR155 regula EMT e tem um papel na metástase e quimio-sensibilidade.

Nós utilizado pela primeira vez EGF para induzir EMT nas células Caski, que foi verificado por e-caderina, N-caderina, expressão e morfologia celular. O nível de expressão miR155 foi determinada por RT-PCR. Um aumento de 12 vezes do nível de expressão miR155 foi observado após tratamento com o EGF, mas nenhuma alteração foi encontrado para miR200c, que tinha sido relatado para ser regulada negativamente em cancro do pâncreas e outros tumores sólidos [16], [17]. Assim, concluímos que miR155, mas não miR200c, está envolvido em EMT induzida por EGF em células Caski. Dados semelhantes publicados por um outro grupo também indicam que é regulada positivamente em miR155 EMT observado em carcinossarcoma do endométrio [10].

Para elucidar o papel do miR155 em EMT, as linhas celulares que sobre-expressam Caski miR155 sobre-expressão foram construídos por transfecções transientes e estáveis . Curiosamente, a sobre-expressão aberrante de proliferação celular drasticamente inibida miR155, inibiu a migração /invasão, e promoveu a quimio-sensibilidade das células Caski para DDP

in vitro

. Ao mesmo tempo, verificou-se que as células que sobre-expressam miR155 tornou-se mais cúbica, e apenas uma pequena porção das células tinha transformado em células fusiformes após 3 dias de tratamento com o EGF. A regulação negativa da E-caderina causada por tratamento com EGF também foi parcialmente revertida por imita miR155 em células Caski.

Estudos anteriores tinham sugerido que o miR-155 era um onco-miR e que sobre-expresso num certo número de doenças malignas humanas , incluindo o linfoma de células B e de carcinomas da mama, cólon, pulmão, ovário e [8], [9]. Tem sido relatado que o miR-155 reprimido proteína nuclear induzida por p53 1 (TP53NP1) e levou ao desenvolvimento do tumor pancreático [21]. No cancro da mama, miR155 reforçada as JAK2 /ESTATÍSTICAS via e transfecção de imita miR155 sinalização promovido MDA-MB-231 e a proliferação de células MCF-7 [22]. Os nossos dados, no entanto, indicam que a sobre-expressão miR155 inibe a proliferação celular em células Caski e impede EMT. atitude semelhante na função miR155 foi aprovado por um outro grupo [20], eles provaram que miR155 impedido EMT, diminuindo TCF-4 nível de expressão no 4T1 células tumorais de mama.

Para elucidar o mecanismo exato de miR155 na proliferação celular e EMT em células Caski, que ensaiou-se os níveis de alguns factores relacionados com o crescimento celular e EMT (Figura 7) de expressão. Os resultados mostraram que a expressão TP53 foi regulada por miR155 superexpressão e reprimidos pela EGF. Curiosamente, induzida por EGF regulação negativa da E-caderina foi completamente revertido por transfecção com imita miR155. estudo recente sugeriu que selvagem TP53 controlada a eficiência pelo qual as células epiteliais mamárias submetidos a EMT em resposta a TGF [23]. Assim devemos miR155 revertida EMT através upregulating expressão TP53.

A via de sinalização Smad2 está envolvido na regulação da proliferação, diferenciação, apoptose e EMT [23]. Neste estudo, verificou-se que, com miR155 superexpressão, expressão Smad2 foi reprimidos. Porque há dois miR155 locais dentro da 3’UTR do mRNA Smad2 ligação, sugerimos que miR155 regula negativamente EMT através da inibição da expressão Smad2.

Nossos resultados indicam que miR155 suprimida a capacidade de migração e invasão de CaSki células

em

vitro

. Um resultado semelhante foi relatado noutro estudo com células de tumor da mama 4T1, em que miR155 foi encontrado para suprimir directamente a expressão do TCF4 e regular negativamente EMT [20]. No nosso estudo, não houve mudanças estatisticamente significativas nos níveis de expressão TCF4 foram observadas nas células Caski tratadas com ou sem EGF e miR155 imita. estudo recente sugeriu que CCND1 aumentou a capacidade migratória e causar EMT no cancro da mama [24]. CMyc e CCND1 são genes a jusante regulados pelo factor de transcrição TCF4. Ao contrário cMyc, há um local de ligação no miR155 CCND1 3’UTR. Consistente com este achado, miR155 superexpressão obviamente subregulado nível CCND1 mas não teve efeito sobre a expressão cMyc. Esta descoberta indicou que, para além da via TCF4, CCND1 pode também ser directamente regulada pela miR155.

anexina A2, foi considerado ser um factor potencial para a regulação do crescimento celular, invasão e quimio-resistência [25 ]. Os nossos dados mostraram que o EGF chumbo tratamento a um aumento na expressão de anexina A2. E não há nenhuma mudança na expressão A2 anexina sob miR155 superexpressão. Mais estudos são necessários para esclarecer o mecanismo de regulação da anexina A2 pela EGF.

Em resumo, nós demonstramos que, em células Caski, miR155 não agiu como um oncogene, mas como um supressor de tumor. miR155 regulada negativamente EMT induzida por EGF, diminuição da proliferação, inibiu a migração /invasão e aumento da quimio-sensibilidade em células Caski in vitro. Em EMT induzida pelo EGF, a regulação positiva de miR155 é um evento que as células podem compensar. Nosso estudo mostra um novo aspecto da miR155 e seus papéis na proliferação de tumores e metástases em câncer cervical.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Primers para PCR em tempo real.

doi: 10.1371 /journal.pone.0052310.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Changbai Liu e Zhaoqi Liu para a sua assessoria técnica e assistência técnica em realizando-PCR em tempo real. Agradecemos também Ms. Ma Jielan por sua assistência na execução de transfecções de plasmídeos e fornecendo o fragmento de DNA GFP. Agradecemos ao pessoal do Instituto de Biologia Molecular da Universidade de Três Gargantas.