Abstract

O crescimento e orientação de muitos axônios no sistema nervoso em desenvolvimento exigem a ativação de Deleted Netrin mediada em Câncer Colorretal ( DCC) e outros sinais de sinalização ainda desconhecidas. defeitos de orientação axônio comissurais são mais graves em

DCC

ratos mutantes que

Netrin-1

ratos mutantes, sugerindo sinais adicionais de activação DCC além Netrin-1 estão envolvidos no crescimento do axônio adequada. Aqui nós relatamos que as telas de interação em microarrays de proteínas extracelulares que representa mais de 1.000 proteínas identificadas exclusivamente Cerebellin 4 (CBLN4), um membro do fator de necrose C1q-tumoral (TNF) familiares e Netrin-1 como parceiros DCC-ligação extracelular. Os estudos de ligação de imunofluorescência e rádio-ligando demonstrar que Netrin-1 compete com a ligação CBLN4 em um site de sobreposição dentro dos domínios de fibronectina membrana proximal (FN) 4-6 de DCC e liga-se com ~ 5 vezes maior afinidade. CBLN4 também se liga ao homólogo de DCC, neogenin-1 (NEO1), mas com uma afinidade mais baixa em comparação com DCC.

camundongos -null CBLN4

não apresentou um defeito no axônios comissurais da medula espinhal em desenvolvimento, mas fez mostrar um aumento transitório do número de errantes axônios no plexo braquial, consistentes com um papel na orientação axônio. No geral, os dados solidifica CBLN4 como um ligando DCC boa fé e fortalece sua implicação na orientação axônio

Citation:. Haddick PCG, Tom I, Luis E, Quiñones G, Wranik BJ, Ramani SR, et al. (2014) Definição do Ligand Especificidade do excluída no câncer colorretal (DCC) Receptor. PLoS ONE 9 (1): e84823. doi: 10.1371 /journal.pone.0084823

editor: Brian Key, Faculdade de Ciências Biomédicas, da Universidade de Queensland, Austrália |

Recebido: 09 de julho de 2013; Aceito: 20 de novembro de 2013; Publicação: 06 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Haddick et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Todo o financiamento para esta pesquisa foi fornecido pela Genentech, um membro do grupo Roche. O financiador tinha papéis no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, e preparação do manuscrito

interesses concorrentes:. Os autores leram a política da revista e têm os seguintes conflitos: Todos os autores sejam ou tenham sido empregadas pela Genentech /Roche e podem possuir ações da empresa. Todo o financiamento para esta pesquisa foi fornecido pela Genentech /Roche. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Extensão de axônios em relação ao seu destino final é um requisito importante para o bom desenvolvimento do sistema nervoso. Axônios encontrar pistas de orientação ao longo de suas rotas de crescimento, incluindo quatro principais vias de sinalização canônicos: DCC-Unc5-Netrin-1, Slit-Roundabout (Robo), Semaforina-plexina-Neuropilin e Ephrin-Ef [1] – [3]. No entanto, existe uma crescente apreciação de que as moléculas adicionais contribuir para este processo bem como [4], [5]. A fim de melhor entender o crescimento e orientação do axônio, será importante para determinar o repertório de proteínas que se ligam e interagem com esses componentes-chave de sinalização.

Aqui vamos nos concentrar na identificação de proteínas interagem por DCC. DCC é um membro 175-190 kDa da superfamília das Ig que consiste de um domínio de transmembrana único e um grande domínio extracelular (ECD) contendo quatro domínios Ig C2-like e seis domínios FNIII [6] – [8]. DCC foi recentemente relatado para se ligar a Draxin ligando segregado na mediação da inibição do crescimento axonal [9]. No entanto, o ligando melhor caracterizado de DCC é Netrin-1, uma proteína segregada que consiste de um domínio globular VI, um domínio V com três repetições de EGF, e um domínio C-terminal de função desconhecida [10]. Embora o local preciso da Netrin-1 ligação a DCC não é conhecido, é necessário o quinto repetição FNIII de DCC [11], [12].

Drosophila

, mutantes do DCC homologue

chumbo frazzled a defeitos de orientação axônio da linha média mais graves do que

netrinAB

mutantes e isso é parcialmente resgatado pelo

commissureless

independente da netrin e sugestiva de um ligando frazzled adicional [13 ]. Da mesma forma, knock-out de qualquer um

DCC

ou

Netrin-1

em ratos resulta em uma falha de axônios comissurais para cruzar a linha média na medula espinhal, mas a gravidade dos defeitos commissural axônio no desenvolvimento medula espinhal são maiores em

DCC

knock-out ratinhos comparada com

ratos netrin-1 mutantes [14], [15]. Embora não haja um homólogo de mamífero de

commissureless

, estas descobertas apoiam a sugestão de que existem ligantes complementares que regulam a atividade DCC em vertebrados.

Aqui nós relatamos, usando uma proteína-grande escala imparcial tela de microarray, que, além de Netrin-1, CBLN4 é um ligando altamente específico para a DCC. Os quatro membros da família CBLN, CBLN1-4, são secretadas, proteínas glicosiladas que contêm um domínio globular característica C1q C-terminal do TNF-a C1q superfamília [16], e que são expressos no cérebro em desenvolvimento e adulto [17] . CBLN1 e CBLN2 são os membros da família CBLN melhor compreendidas e têm sido encontrados para estabilizar sinapses, agindo como uma ligação trans-sináptica, ligação com Beta-neurexinas de neurónios granulares e delta 2 receptores de glutamato de células de Purkinje do cerebelo [18] – [21]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel funcional da CBLN4 e não há nenhum fenótipo comportamental obvert em um rato

CBLN4

knock-out [22]. Recentemente, um estudo independente também identificado DCC como uma proteína de ligação CBLN4 usando uma tela à base de candidato mais limitada [22]. Temos caracterizado ainda mais a interação DCC-CBLN4 e identificou um fenótipo vagando-Axon transitória no plexo braquial na murino

CBLN4

knock-out.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

Comissão

O animal Care Genentech Institucional e Use aprovado todos os estudos com animais.

Clonagem e expressão de proteína

As construções de expressão foram gerados por métodos convencionais de PCR utilizando um in-house recolha clone de ADNc ou comprado de Origene como molde e subclonado no vector pRK5 contendo o marcador de epitopo N-terminal ou C-terminal apropriado. Os mutantes para os estudos de mapeamento do domínio DCC foram feitas utilizando o kit Quick-Change II XL mutagénese dirigida (Stratagene). Todas as construções foram verificadas sequência antes da utilização. flag-marcado N-terminal (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKDYKDDDDKLE), full-length e eliminação construções para DCC humana são os seguintes: Flag-DCC full-length (H26-I1442); Bandeira-DCC Ig1-4 (H26-S425-BamH1-L1098 I1442); Bandeira-DCC FN1-6 (S426-I1442), Bandeira-DCC FN4-6 (E722-I1442). construções de expressão da proteína foram gerados para solúvel (domínio C-terminal suprimido) [7] humana Netrin-1 (G25-K453) com um gD-tag N-terminal (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLLE), CBLN4 humana (M1-L201) com um C-terminal Fc tag e o domínio extracelular de DCC humana (M1-N1097) com uma etiqueta C-terminal de Fc. sequências de aminoácidos completas são fornecidas na Tabela S1.

As proteínas foram expressas em células de ovário de hamster chinês (CHO) e purificada como descrito anteriormente [23]. Resumidamente, as proteínas foram purificadas a partir de meio de transfecção transitória por adsorção em lotes em anti-Flag ou a resina de agarose anti-gD seguido pelo empacotamento da resina em colunas de cromatografia padrão. proteínas marcadas-Fc foram purificadas por carregamento para uma proteína A-Sepharose (Amersham Biosciences). Após lavagem com tampão fosfato salino (PBS) a linha de base, as proteínas foram eluidas com 0,1 M de ácido acético de pH 3 e neutralizou-se imediatamente com 1,5 M de Tris pH 8,6. Uma coluna de filtração em gel secundário foi executado como um passo de polimento final. A pureza da proteína foi avaliada por SDS-PAGE corados com Azul de Coomassie e foram . 90% puro

microarrays da proteína

microarrays da proteína foram construídos com lâminas de vidro revestidas epoxissilano (Schott) como anteriormente descrito [ ,,,0],24]. Foram utilizadas duas bibliotecas de proteína secretada. Biblioteca 1, constituído por 1.334 amostras purificadas, representando 686 domínios secretadas ou extracelulares de proteínas individuais transmembrana [25]. A segunda biblioteca de proteína segregada, Biblioteca 2, foi de 624 amostras, que representa 562 genes (92 genes estavam presentes em ambas as bibliotecas) (Tabela S2). Os detalhes dos métodos de rastreio tenham sido previamente descrito [24]. Resumidamente, microsferas de proteína A multivalentes (Miltenyi Biotech) foram preparados a partir de uma mistura 01:01 de DCC-Fc e marcada com Cy5-hlgG e incubadas com as lâminas de microarranjos utilizando uma estação automatizada de hibridação aHyb (Miltenyi Biotech). As lâminas foram lavadas com PBS-T (PBS + 0,1% Tween 20), e secou-se, em seguida, digitalizado por Cy5 fluorescência utilizando um digitalizador GenePix 4000B (Molecular Devices). As lâminas foram analisadas utilizando o software GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices). intensidades de sinal relatados foram normalizados pelo sinal de fluorescência média de todas as amostras na corrediça.

Binding Experiments

células COS-7 (ATCC) foram transfectadas com ADNc que codificam para DCC ou, como controlo, do receptor Nogo (NgR) usando Polyfect (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. Após incubação a 37 ° C durante 48 h, as células foram lavadas duas vezes em tampão de ligação (1% inactivado pelo calor soro de cabra normal (hings), 0,05% de azida de sódio, 2 ug /ml de heparina em PBS), e incubadas com 20 nM alcalina Phasphatase (AP), CBLN4-AP ou AP-Nogo 66 a partir de meios condicionados, durante 90 minutos em tampão de ligação à temperatura ambiente. As células foram então lavadas três vezes em tampão de ligação, fixado durante 7 minutos em paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS, lavou-se três vezes em solução tamponada HEPES (HBS HEPES -20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM), inactivado pelo calor durante 30 min a 65 ° C, e lavou-se três vezes em tampão de fosfatase alcalina (AP tampão Tris -100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl 50 mM

2). O sinal do AP foi desenvolvida com cloreto de nitro-azul de tetrazólio (NBT) /5-bromo-4-cloro-3′-p-toluidina indolyphosphate sal (BCIP) da solução (Roche), diluído 50 vezes em tampão de AP no escuro durante pelo menos 1 h até a formação dependente AP azul precipitado NBT /BCIP foi visualizado.

Superfície Plasmon Resonance

Superfície Plasmon Resonance (SPR) experimentos foram realizados em um Biacore 3000 (GE Healthcare) a 25 ° C, utilizando um chip sensor CM5, em 0,01 M de HEPES, pH 7,4, NaCl 0,15 M, 0,005% Surfactante P20 (HBS-P) tampão de corrida a uma velocidade de fluxo de 30 ul /min. Full-length N-terminalmente marcada com HA e CBLN1 CBLN2 foram adquiridos a partir de R D systems. A região extracelular de Robo3 fundido com Fc (Robo3-Fc) e de comprimento completo CBLN3-Fc e CBLN4 C-terminal de A foram produzidos de forma recombinante (Tabela S1) e purificado usando cromatograf ia de afinidade padrão tal como descrito acima. membros da família Cerebellin (CBLN1, CBLN2, CBLN3, CBLN4) foram injectados sequencialmente numa concentração de 10 ug /ml durante 3 minutos através de acoplamento de amina DCC-Fc ou Robo3-Fc no chip sensor. Dissociação foi permitido por 3 min em HBS-P.

Citometria de Fluxo

células HEK293T (ATCC) foram transitoriamente transfectadas com mutantes do domínio Bandeira-marcados humanos DCC ou DCC usando Fugene�-6 (Promega) de acordo com as recomendações do fabricante. As experiências de ligação de citometria de fluxo foram realizadas em PBS contendo 2% de FBS a 4 ° C. Expressão de DCC e de domínio mutantes marcado com FLAG na superfície de células HEK293T foi confirmada 48 h pós-transfecção quer com um anticorpo anti-Flag M2 (Sigma) ou anti DCC-anticorpo (Calbiochem), seguido de incubação com anti-IgG de coelho ou anti-IgG de ratinho com ficoeritrina (PE) – ou anti-IgG de ratinho aloficocianina (APC) marcado com anticorpo secundário. ligação a bandeira DCC-tagged, mutantes de domínio, ou células não transfectadas da proteína foi avaliada por incubação das células durante 30 minutos com recombinante CBLN4-Fc, UNC5C-Fc, gD-1-Netrin ou gD-BTLA a 10 ug /ml. As células foram então lavadas e a ligação foi detectada com anticorpo anti-IgG humana-PE- ou anticorpo secundário IgG-APC-anti-humano marcado ou anti-gD e anti-IgG de ratinho-PE- ou anti-IgG de ratinho-APC-secundário marcado anticorpo.

celular baseado em placa de ligação e mapeamento de domínio

estudos de mapeamento de domínio DCC foram realizadas em imagens de 384 poços e placas de ensaio (Aurora Biotecnologias). Para COS-7 transfections, DNA para o domínio DCC construções mutantes e controle negativo foram dispensadas em poços a 60 ng por poço. Fugene 6 reagente (Promega) de transfecção foi preparado numa proporção de 3 ul de Fugene com 1 ug de ADN em Opti-MEM (Invitrogen), incubou-se durante 5 minutos, e misturado com ADN na placa de 384 poços e incubou-se durante 15- 45 min para permitir a formação do complexo. células COS-7 foram dispensadas a uma densidade de 3000 células por poço em placas de 384 poços e incubou-se durante 48 h. As células transfectadas foram lavadas três vezes e bloqueadas com PBS contendo 1% de BSA durante 1 h antes da incubação com a proteína CBLN4-Fc ou anticorpo anti-Flag M2 (Sigma) durante 1 h em gelo. Após lavagem, as células foram fixadas em 4% de PFA durante 30 minutos à temperatura ambiente e a ligação da proteína foi detectada com Alexa Fluor-488 marcado com IgG anti-humano (Invitrogen) ou expressão foi detectada com IgG anti-ratinho de Alex Fluor-647 marcado (Invitrogen ) durante 1 h. sinal fluorescente por toda a placa foi obtida e analisada em uma imagem expresso Velos (Molecular Devices). A análise das imagens foi realizada utilizando o software de análise para a imagem expressa Velos. Positivamente células coradas foram contados como aqueles acima de um limiar de intensidade de fluorescência de fundo e dentro dos parâmetros de filtro de partícula para a área e intensidade média do sinal. Imagens para efeitos de publicação foram coletados no mesmo prato usando um Incell Analyzer 2000 (GE Healthcare). A tela interacção candidato também foi realizada utilizando o protocolo de coloração acima.

celular Radio-Ligando de ligação de Ensaio

os ensaios de ligação de rádio-ligando foram realizados com CBLN4 recombinante-gD-Fc e uma proteína-Netrin com DCC expressando células HEK293T em 96 poços com fundo em U em placas de meio DMEM contendo FBS a 2%, HEPES 50 mM, pH 7,2 e 0,1% de azida de sódio. CBLN4-Fc e gD-Netrin-1 foram iodados com

125 I-Na usando o método Iodogen. reacções de competição foram definir-se em triplicado com uma concentração fixa de ligando iodado pré-misturados com diluições em série de 3 vezes de ligando não marcado a partir de 500 nm, seguido de adição de suspensão de células de DCC a uma densidade de 250.000 células por 200 ul para dar uma reacção final volume de 250 ul. As reacções foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente antes da separação do ligando livre do ligado iodado utilizando placas de filtro Millipore multi-screen (Billerica, MA). filtros de ar seco foram contadas utilizando um contador gama 1470 Assistente Wallac (PerkinElmer Life Sciences). Os dados de ligação foram avaliados utilizando o software NewLigand (Genentech), que utiliza o algoritmo de ajuste de Munson e Rodbard para determinar a afinidade de ligação [26]. Para estudos de competição, os ensaios foram conduzidos como descrito acima, excepto que o ligando não marcado foi substituído com competidor não marcado. Para estudos de bloqueio, as células HEK293T controlo ou células HEK293T que expressam DCC foram pré-bloqueadas com não marcado gD-Netrin-1 (1 | iM) ou CBLN4-Fc (2 ^ M) durante 1,5 h em gelo. Então

125I CBLN4-Fc (300 pM) ou

125I-gD Netrin-1 (52 pM), respectivamente, foi adicionado e deixado a ligar durante 1 hora a 4 ° C antes de lavar e contar.

Beta-galactosidase de coloração

embrião inteiro (E11.5) ou 200 micra secções vibratome (E13.5) que foram fixas em 4% de PFA em PBS foram lavadas três vezes (20 minutos cada) em lavar tampão (MgCl2 mM

2, 5 mM de EGTA, 0,02% de Nonidet P-40, e 0,01% de desoxicolato de sódio em PBS) e a actividade β-galactosidase coloração foi desenvolvido em tampão de lavagem com ferrocianeto de potássio 5 mM, e 1 mg /ml de X-gal em dimetilformamida (DMF) a 37 ° C no escuro.

a imunocoloração

imunocoloração TAG-1 de secções da espinal medula foi realizada como descrito [27] utilizando o clone 4D7 ( developmental Studies Hybridoma banco) em 1:200 e Alexa Fluor 594 conjugado com anti-IgM de ratinho (Invitrogen) em 1:500. As imagens foram adquiridas em um Zeiss Axioplan 2 microscópio. Para a imunocoloração de montagem plana, embriões E11.5 evisceradas foram fixadas em 4% de PFA em PBS durante 2 h, lavou-se três vezes em PBS, bloqueadas em 2,5% e 0,2 hings% de Triton X-100 em PBS, e incubou-se em 1:2000 neurofilamento (NF-M) de anticorpo (Covance) diluído em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C. Os embriões foram lavados seis vezes (1 h cada) em solução a 4 ° C e incubadas durante a noite bloqueando ao abrigo da luz a 4 ° C em 1:200 Alexa anti-IgG de coelho-Fluor 594 conjugado (Invitrogen) diluiu-se em solução de bloqueio. Os embriões foram então lavadas seis vezes (1 h cada) em 0,2% de Triton em PBS a 4 ° C e, em seguida, foi afastada numa série de 30%, 50%, e 80% de glicerol em lavagens com PBS durante pelo menos 6 h cada. O embrião foi então achatada entre duas lamelas de vidro e fotografada usando um microscópio confocal Zeiss LSM510.

Mouse Cepas

Netrin-1

[15] e

CBLN4

[28] camundongos knock-out foram mantidos em um fundo CD-1 e genotipados como descrito.

Resultados

identificar DCC encadernação parceiros

Para identificar a ligação candidatos parceiros de DCC, um microarray da proteína extracelular [24], [25] foi rastreada com um complexo proteína-a micropérola multivalente gerado a partir de uma mistura 01:01 de fluorescentemente marcado (Cy5) de IgG humana e o domínio extracelular de DCC (aminoácidos 1- 1097) fundido com a porção Fe de IgG humana. Das amostras de proteína 1,334, representando 686 genes, no micro-arranjo, apenas os pontos correspondentes aos CBLN4-Fc e CBLN4-His fortes sinais fluorescentes mostraram (Figura 1A). Uma segunda biblioteca de proteína que consiste em 624 amostras de proteína (Tabela S2), o que representa 562 genes identificados gD-Netrin-1 e Netrin-1-His, como os melhores sucessos, embora com rácios mais baixos de sinal-para-ruído em comparação com CBLN4 (Figura 1B) . Netrina-1 foi apenas presente na segunda biblioteca, enquanto CBLN4 só estava presente na primeira biblioteca. membros da família relacionados, CBLN2 e CBLN3, foram representadas, mas não mostrou nenhuma ligação a DCC. Além disso, três lotes de Draxin (C1orf187) foram incluídos dentro da primeira biblioteca, mas não foram identificadas como sucessos. Em estudos de acompanhamento, testou-se DCC-Fc para se ligar a estas três amostras de proteína Draxin juntamente com uma amostra comercial (R D Systems) por SPR. Não fomos capazes de detectar a ligação direta do ECD recombinante da Draxin para DCC-Fc com qualquer uma dessas amostras (dados não mostrados).

As parcelas de intersecção mostrar dados de duas telas replicadas (Matriz 1 e Matriz 2) de DCC-Fc contra duas bibliotecas proteína microarray extracelulares, representando 686 genes em Biblioteca 1 (a) e 562 genes na biblioteca 2 (B). Cada ponto representa uma amostra de proteína eo oval representa o ponto de corte para positiva seleccionados. CBLN4-Fc, CBLN4-His, Netrin-1-His e gD-Netrin-1 proteínas foram os hits pontuação em cada biblioteca.

Para confirmar a interacção DCC-CBLN4 na superfície da célula, uma fosfatase alcalina (AP) ensaio de ligação foi realizada. Os resultados mostram que CBLN4-PA liga-se a células COS-7 transfectadas transientemente com DCC, mas não a células transf ectadas transitoriamente com NgR que se ligam a AP-Nogo66 (Figura 2A). Além disso, citometria de fluxo confirmou que a ligação de CBLN4-Fc a células que expressam HEK293T DCC em relação às células de controlo HEK293T (Figuras 2b, S1).

A) Imagens representativas de proteína CBLN4-AP se ligam a células COS-7 transfectadas com DCC, mas não a expressão NgR constrói (painéis superiores). proteína Nogo-66 AP ligado a NgR, mas não para células transfectadas DCC (painéis meio). AP não interagir tanto com DCC ou NgR (painéis inferiores). B) Fluxo de análise de citometria confirmou a expressão de superfície celular de DCC transitoriamente transfectadas Bandeira-marcado em células HEK239T (painéis superiores). O CBLN4-Fc e gD-1-Netrin proteínas ligadas a células que expressam DCC como demonstrado pela mudança na intensidade de fluorescência em comparação com as células não transfectadas (painéis inferiores).

Para determinar se DCC liga-se exclusivamente ao CBLN4 , foi avaliada a capacidade de DCC para interagir com outros membros da família CBLN por SPR. Os sensograms para os membros da família CBLN injectados através da DCC imobilizada ou um controlo negativo, Robo3, são mostrados na Figura 3A. Um aumento acentuado em unidades de resposta (RU), seguido por uma lenta dissociação foi observado para-CBLN4 sua ligação a DCC, mas não para Robo3. Por outro lado, CBLN1, CBLN2 e CBLN3 não interagir tanto com DCC ou Robo3, demonstrando a interação seletiva de DCC com CBLN4. As afinidades de ligação relativas dos CBLN4 e Netrin-1 de células HEK293T transientemente transfectadas que expressam DCC foram determinados a partir de um ensaio de ligação celular de rádio-ligando utilizando

marcado com 125I CLBN4-Fc e gD-Netrin-1. A dissociação constante de equilíbrio,

K

D

, para CBLN4 foi calculada como sendo de 117 ± 34 nM, em comparação com uma constante de dissociação de 22 ± 6 nM para Netrin-1 (Figura 3B).

a) Sensograms são mostrados a partir da análise SPR de imobilizado DCC-Fc (esquerda; 15,082 unidades de resposta) e controle negativo Robo3-Fc (direita; 9.833 unidades de resposta) com CBLN1, CBLN2, CBLN3 e CBLN4 injectado como analitos a 10 ug /ml. A ligação robusta foi detectada a CBLN4 (traço preto), enquanto nenhum sinal de ligação foi detectada para os outros membros da família Cerebellin (Vestígios de cinza). B) Um ensaio de radio-lignad foi utilizado para determinar a afinidade de CBLN4-Fc (esquerda) e Gd-Netrin-1 (à direita) de DCC transientemente transfectados em células HEK293T. ligando

marcado com 125I foi deixada ligar-se as células transfectadas na presença de quantidades crescentes de ligando não marcado. Calculado

K

D

valores são indicados nos gráficos e são representativos de 3 experiências independentes.

Identificar CBLN4 Encadernação Partners

Para determinar se houve outros receptores CBLN4 além DCC, uma tela de proteína-micromatriz foi realizada em sentido inverso, onde CBLN4-Fc foi utilizado como isco, no entanto, não há visitas foram verificadas (dados não mostrados). Curiosamente, a própria DCC não foi identificada como uma batida. Estudos anteriores indicam que as proteínas são em grande parte activa no substrato de microarray [24], embora haja a possibilidade de que o DCC é sensível a este tipo de imobilização. Em seguida, quatorze proteínas neuronais, conhecidos para coordenar caminho axonal neurônio encontrar semelhante à função de DCC, foram rastreados usando um ensaio de ligação celular. A ligação de CBLN4-Fc foi avaliada contra células COS-7 transfectadas com os clones correspondentes a genes candidatos de comprimento completo não marcados. Note-se que um resultado negativo não exclui necessariamente a interação candidato desde expressões de proteínas foram confirmados. A quantificação da intensidade de fluorescência para CBLN4-Fc coloração para estes clones transfectados identificados DCC e dois outros ligandos potenciais, Netrin-1 e NEO1 (Figura 4A). O sinal observado para Netrin-1 de ligação, no entanto, manteve-se constante independentemente de variações na concentração CBLN4 e também com o anticorpo de detecção secundário sozinho (dados não mostrados), indicativo de um falso positivo no ecrã. NEO1, de forma interessante, é um parálogo DCC e também funciona como um receptor de Netrin -1 [29]. Ambos DCC e NEO1 têm estruturas de domínio semelhantes e compartilhar 54% de identidade sobre a região do ECD. Para avaliar qualitativamente as forças que se ligam a Netrin-1 e NEO1, DCC-expressando células COS-7 foram avaliadas individualmente com uma série de titulação de diminuir CBLN4-Fc. A interacção entre CBLN4 e NEO1 poderia ser detectado em concentrações CBLN4-Fc de 25 ug /ml (280 nm) ou superior. Em contraste, CBLN4-Fc se ligar a células que expressam DCC-mostraram sinais fortes, com concentrações tão baixas como 0,78 ug /ml (8,7 nM) (Figura 4B). Estes dados sugerem que a ligação de NEO1 para CBLN4 representa uma interacção muito menor afinidade de ligação em comparação com CBLN4 DCC. Para caracterizar ainda mais a interacção CBLN4-NEO1, células HEK293T que expressam transientes NEO1 foram analisadas quanto à ligação à proteína CBLN4-Fc por citometria de fluxo e ensaio de ligação de rádio-ligando utilizando

marcado com 125I CBLN4. No entanto, CBLN4 não interagem com as células que expressam NEO1 com qualquer uma destas abordagens, provavelmente por causa de uma afinidade muito baixo (dados não mostrados).

A) de quantificação CBLN4-Fc se ligar a células COS-7 transfectadas com as proteínas de orientação de axónios indicados. Os dados representam três placas independentes, contendo cada uma poços em triplicado e as barras de erro representam o erro padrão da média. B) Bandeira-DCC e Flag-NEO1 foram transitoriamente expressos na superfície de células COS-7 tal como detectado por coloração com anti-Flag (painel superior). O painel inferior mostra uma série de titulação de CBLN4-Fc ligação a DCC ou NEO1. Triplicado experimentos independentes foram realizados e barras de erro representam o erro padrão da média.

CBLN4 Vinculado à Região FN4-6 de DCC

DCC é uma única proteína transmembranar contendo quatro Ig repetições e seis repetições FNIII na ECD. Para avaliar quais os domínios em DCC são necessários para a ligação CBLN4, construções de deleção de DCC foram gerados e transfectado para células COS-7 para análise de ligação. Quatro construções de DCC foram testados, constituindo quer todo o ECD (DCC.FL), o Ig1-4 repete (DCC.Ig), o FN1-6 repete (DCC.FN1-6), ou apenas o C-terminal FN4-6 repetições (DCC.FN4-6). O Ig1-4 repete (DCC.Ig) não mostrou ligação a CBLN4-Fc, o que sugere que a ligação principal é dependente dos domínios FN (Figuras 5A-B). Consistente com esta interpretação, expressão de apenas o FN repete (DCC.FN1-6) ou apenas os últimos três domínios FN (DCC.FN4-6) manteve ligação forte CBLN4-Fc. Estes resultados demonstram que o DCC-FN4-6 é suficiente para mediar a ligação a CBLN4.

A) uma representação esquemática de DCC é mostrado com os domínios de Ig de preto e os domínios FN em verde. imagens fluorescentes representativos são mostrados para a ligação CBLN4-Fc a células COS-7 que expressam de comprimento completo DCC, DCC Ig1-4, DCC FN1-6, DCC FN4-6, e APP de controlo negativo. A detecção da ligação CBLN4-Fc foi por meio de anti-humano-Alexa Fluor 488 (verde). A detecção da expressão na superfície celular de todos os mutantes de deleção DCC marcado com FLAG foi confirmada com um Alex Fluor-647 marcado com IgG anti-rato (vermelho). B) quantificação de CBLN4-Fc ligação às construções de deleção de domínio DCC. Triplicado experimentos independentes foram realizados e barras de erro representam o erro padrão da média.

Netrin-1 Compete com CBLN4 Encadernação

relatórios anteriormente publicados implicam região FN4-6 de DCC em netrin-1 vinculativo [11], [12]. A nossa observação de que a ligação CBLN4 mapeada para a mesma região em DCC levou-nos a examinar se Netrin-1 e competem para a ligação CBLN4 DCC ou se todas as três proteínas podia formar um complexo ternário. Utilizando estudos de co-imunoprecipitação, foi recentemente relatado que CBLN4 ligação a DCC pode ser competiram por Netrin-1 [22]. Para verificar estes resultados, utilizamos uma abordagem baseada radio-ligando sensível. Os dados mostram que

marcado com 125I CBLN4-Fc (300 pM) ligou-se especificamente a DCC expressando células HEK293T e que a ligação foi bloqueada por pré-incubação das células com Netrin-1 (1 pM) em comparação com nenhum tratamento de controlo ( Figura 6A). bloqueio incompleto de

marcado com 125I Netrin-1 (52 pM) com CBLN4-Fc (2 uM) foi observado na experiência inversa e, provavelmente, pode ser atribuída à diferença de ~ 5 vezes na afinidade de CBLN4 e Netrin- 1 para DCC. Uma titulação com concentrações crescentes de Netrin-1 mostrou clara deslocamento de uma concentração fixa de

125I CBLN4-Fc a células que expressam HEK293T DCC (Figura 6B). Nossos dados demonstram que os locais de ligação CBLN4 e Netrin-1 mapear a mesma região do FN em DCC e sobreposição estericamente.

A) quantificação da quantidade de

125I-radiomarcado CBLN4-Fc ou gD-Netrin- 1 ligada a células que expressam DCC HEK293T, ou células de controlo não transfectadas, previamente incubadas com não marcado gD-Netrin-1 ou CBLN4-Fc, respectivamente. Os dados de quatro experiências independentes são apresentados. Cada barra representa 3 repetições técnicas expressas como média ± SD.

t

teste de uma cauda Student foram aplicados: *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001. B) plotagem de deslocamento, representante de experiências independentes em triplicado, é mostrado para gD-Netrin-1 competindo com a ligação de

125I-radiomarcado CBLN4-Fc para DCC expressando células HEK293T.

Caracterização de CBLN4 função durante o desenvolvimento embrionário

foi previamente mostrado que a DCC e Netrin-1 são necessários para a orientação adequada e crescimento dos axónios durante o desenvolvimento embrionário [7], [15]. A fim de examinar a contribuição CBLN4 pode ter em DCC-Netrin-1 de sinalização, foram estudadas as projeções neuronais de

CBLN4

knock-out ratinhos. Geração do

CBLN4

knock-out do mouse incluiu uma batida na de uma cassete de expressão LacZ que permite coloração β-galactosidase de

CBLN4

+/-

ratos para visualizar a localização de CBLN4 expressão. O padrão de expressão β-galactosidase em

CBLN4

+/-

ratos é distinta, incluindo a expressão nos brotos dorsal da perna nos E11.5 e a coluna do motor da medula espinhal em E13.5 (Figura 7A ). Uma das principais funções de DCC e Netrin-1 é assegurar a passagem adequada linha média de axónios comissurais na medula espinal em desenvolvimento. Para examinar se CBLN4 desempenha um papel na orientação da linha média, pré-cruzando axônios comissurais foram visualizados por TAG-1 imunocoloração em seções transversais de E11.5 ratos (Figura 7B

)

. Considerando que os axônios comissurais pode ser visto chegando e cruzando a placa de piso em ratinhos de tipo selvagem, muito poucos, se houver, os axônios comissurais alcançar e atravessar a placa de piso em

Netrin-1

– /-

ratos. TAG-1 imunocoramento axônios comissurais de

CBLN4

– /-

ratos mostram que eles chegam e cruzar os axônios semelhante à do tipo selvagem e não há nenhuma diferença notável na imunocoloração entre

Netrin-1

– /-

;

CBLN4

+ /+ Comprar e

Netrin-1

– /-

;

CBLN4

– /-

camundongos ou

Netrin-1

+/-

;

CBLN4

+ /+ Comprar e

Netrin-1

+/-

;

CBLN4

– /-.

Ratos

A) expressão repórter Lac-Z de CBLN4 em E11.5

CBLN4

+/-

ratos (top painéis) que mostram expressão distintiva nos membros, incluindo expressão dorsal do membro. Lac-Z repórter coloração de CBLN4 em E13.5

CBLN4

+/-

ratos (painéis inferiores) que mostra a expressão na coluna do motor da medula espinhal. B) axônios comissurais de E11.5 medula espinhal visualizado com TAG-1 imuno em combinações de

CBLN4 Comprar e

Netrin-1 | genótipos. C) Imagens representativas e quantificação de vagando axônios (setas brancas) no plexo braquial de E11.5

CBLN4

– /-

ratos. Tukey contrasta; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001; n é de esquerda e membro anterior direito aninhado em rato; n = 4

CBLN4

+ /+

; n = 5

CBLN4

+/-

; n = 6

CBLN4

– /-

A expressão de CBLN4 no desenvolvimento de brotos dos membros nos levou a avaliar a trajetória do neurônio motor axônios nesta fase.. Estes axónios expressar DCC [7] e navegar a partir da coluna do motor da medula espinal para os seus objectivos finais que enervam os músculos do membro em [30] e são conhecidos como sendo responsivos a Netrin-1 [31], [32].