Abstract

NPRL2, um dos genes supressores de tumor residente num 120 -kb região deleção homozigótica de banda de cromossoma humano 3p21.3, tem um elevado grau de homologia de sequência de aminoácidos com o regulador permease de azoto 2 (NPR2) do gene de levedura, e mutações de

NPRL2

em células de levedura estão associados com resistência a morte celular mediada pela cisplatina. Anteriormente, mostramos que a restauração da NPRL2 em células NPRL2-negativas e resistentes à cisplatina resensitize células de câncer de pulmão para tratamento com cisplatina

in vitro e in vivo

. Neste estudo, mostra-se que a sensibilização de células de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) a cisplatina por NPRL2 é realizado por meio da regulação de componentes-chave na via do ponto de verificação de DNA-danos. NPRL2 pode fosforilar ataxia telangiectasia mutado (ATM) quinase ativada por cisplatina e promover a formação de γ-H2AX jusante

in vitro

e

in vivo

, que ocorre durante a apoptose em simultâneo com o aparecimento inicial de alta Os fragmentos de ADN com o peso molecular. Além disso, este tratamento combinação resulta em maior atividade da quinase Chk1 e Chk2 do que o tratamento com cisplatina isolada e pode ativar Chk2 no pleural metástases xenotransplante tumoral em camundongos. Activado Chk1 e Chk2 aumentar a expressão de proteínas do checkpoint do ciclo celular, incluindo Cdc25A e Cdc25C, levando a níveis mais elevados de G2 /M de detenção em células tumorais tratadas com cisplatina e NPRL2 do que nas células tumorais tratadas apenas com cisplatina. Nossos resultados sugerem, portanto, que a expressão ectópica de NPRL2 ativa a via checkpoint danos no DNA em células resistentes à cisplatina e NPRL2-negativo; Assim, a combinação de cisplatina e NPRL2 pode resensitize não respondedores de cisplatina, para o tratamento com cisplatina, através da activação da via de checkpoint de dano do DNA, conduzindo à paragem celular na fase G2 /M e a indução de apoptose. A implicação directa deste estudo é que o tratamento combinado com NPRL2 e cisplatina pode superar a resistência a cisplatina e aumentar a eficácia terapêutica

Citation:. Jayachandran G, Ueda K, Wang B, Roth JA, Ji L (2010)

NPRL2

sensibiliza humano não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) as células à cisplatina Tratamento regulando componentes-chave na via DNA Repair. PLoS ONE 5 (8): e11994. doi: 10.1371 /journal.pone.0011994

editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Alemanha |

Recebido: 07 de dezembro de 2009; Aceito: 09 de julho de 2010; Publicação: 05 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Jayachandran et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações do National Cancer Institute, National Institutes of Health, SPORE P50CA70907, R01CA116322 e MMHCC U01CA10535201; doações do Departamento de Defesa Lung Cancer Programa PROSPECT (DAMD17-02-1-0706); A Universidade do Texas M. D. Anderson Cancer Center Suporte Núcleo Grant (CA-16672); e uma concessão dos fundos de liquidação do tabaco como apropriados pelo legislador estadual de Texas. As agências de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

NPRL2 /Gene 21

(Registo de GenBank # AF040707), que é 1351 pb de comprimento e codifica uma proteína de 380 resíduos de ácidos aminados, é um dos genes de supressão tumoral identificados em 120 -kb região deleção homozigótica em 3p21.3 banda cromossomo humano [1], [2]. A perda frequente e precoce de heterozigosidade e as deleções sobrepostas observado na região 3p21.3 em cancros do pulmão e da mama sugerem um papel crítico de um ou mais genes 3p21.3 na patogénese molecular destes cancros [1], [3] .

O regulador permease de azoto 2 (NPR2) gene de levedura (Registo de GenBank # P39923) foi identificado como um novo componente envolvido na morte celular desencadeada pela cisplatina. Por causa de perturbação NPR2 foi mostrado para conferir resistência a cisplatina, acredita-se que NPRL2 pode utilizar um mecanismo semelhante para mediar a citotoxicidade de drogas anticancro [4]. Descobrimos recentemente que a re-expressão em células de NPRL2 NPRL2-negativos e resistentes a cisplatina resensitized significativamente a resposta destas células para o tratamento com cisplatina, como evidenciado pela viabilidade celular reduzida e aumento da apoptose

In vitro

e

In vivo

[5]. No entanto, os eventos moleculares responsáveis ​​pelo re-sensibilização a cisplatina por

NPRL2

não foram identificados. Neste estudo, nós tentamos compreender a ligação molecular entre NPRL2 e cisplatina em superar a resistência aos medicamentos.

Os efeitos da cisplatina são mediadas através de altos níveis de danos no DNA, levando à morte celular programada ou interrupção do ciclo celular [6 ]. As rupturas de DNA de cadeia dupla induzida pela cisplatina são mediadas através de uma via de sinalização de danos-ADN central controlado pela cinase mutada (ATM), ataxia telangiectasia, bem como vários outros danos de ADN responsivo cinases [7], [8]. A fosforilação de ATM em serina-1981 tem sido demonstrado que fosforila a histona H2AX [9], e a fosforilação da H2AX histona na serina-139 (γ-H2AX) é essencial para o recrutamento de mediadores, tais como MDC1 (Mediador de checkpoint de dano do DNA proteína 1), 53BP1 (proteína de ligação de p53 1), BRCA1 (cancro da mama 1), e MRE11 (recombinação meiótica 11) -RAD50 (radiação sensível 50) -NBS1 (síndrome da quebra de Nijmegen 1) complexo de [10] – [13]. A fosfo-ATM facilita a fosforilação desses mediadores, e a formação de focos nuclear das moléculas activadas promove a transmissão do sinal de dano de DNA para alvos a jusante, tais como o Chk1 (veja ponto quinase 1), Chk2 (Check Point quinase 2), e SMC1 (manutenção estrutural de cromossomas 1) [14] – [16]. Chk1 e Chk2 estão envolvidos em várias respostas DNA-danos, incluindo checkpoint do ciclo celular, a manutenção do genoma, reparo do DNA e apoptose [17].

Portanto, a hipótese de que a sensibilização do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) células à cisplatina por NPRL2 pode ser devido à regulação directa dos componentes-chave na via checkpoint DNA-danos. Para testar esta hipótese, foram analisados ​​os efeitos da expressão ectópica de NPRL2 na presença ou na ausência de cisplatina agente danificador de ADN em crescimento de células tumorais e a apoptose em um painel de linhas celulares de NSCLC com o estado variada do gene NPRL2 endógena e a expressão de proteínas e sensibilidade cisplatina. Mostramos que reexpressão de NPRL2 em células NPRL2-negativas e resistentes à cisplatina ativa significativamente esses componentes-chave, incluindo ATM, Chk, e H2AX e resensitizes células de câncer de pulmão para tratamento com cisplatina

in vitro

e

In

vivo, levando à paragem do ciclo celular na fase G2 /M e a indução de apoptose. Os resultados do presente estudo também dão suporte experimental para a nossa hipótese de que NPRL2 pode funcionar não só como um biomarcador de prognóstico para a sensibilidade à cisplatina, mas também como um agente terapêutico para resensitizing células cancerosas não-responsivo à cisplatina.

Materiais e métodos

linhas de células e cultura de células

Os humanos NSCLC linhas celulares H1299 [5] e H322 [5], com vários 3p21.3 estatuto descrito anteriormente [18], [19], foram usado para

in vitro Comprar e

in vivo

experimentos. H1299 e H322 são resistente a cisplatina (concentração inibidora de 50% [IC

50] e IC

20 valores para a cisplatina em H1299 foram de 7,6 e 3,0 uM, respectivamente, e em H322 foram 13,1 e 5,0 uM, respectivamente, conforme avaliada por ensaio XTT) e não expressam proteínas NPRL2 (como avaliado por Western blotting) [5]. A linha de células sensíveis a cisplatina NSCLC H1437 e linha de células resistentes à cisplatina H1437R foram descritos anteriormente [5].

anticorpos, reagentes, e de dosagem

Anti-ATM (5C2), anti- Chk1 (G-4), anti-Chk2 (H-300), anti-Cdc25A (M-6), anti-ciclina B1 (GNS1), e anti-caspase-2 (H-19) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-fosfo-Chk1 (Ser345), anti-fosfo-Chk2 (Thr68), anti-fosfo-Chk1 (Ser345), anti-NBS1, anti-fosfo-NBS1 (Ser343), anti-SMC1, anti-fosfo-Cdc25C ( Ser216), anti-fosfo-Cdc2 (Tyr15), anti-caspase-3 e anti-caspase-9 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-ATM Proteína Quinase pS1981 era de Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA), anti-fosfo histona H2AX (Ser139) era de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY), anti-fosfo-SMC1 foi de Novus Biologicals (Littleton, CO) , e anti-caspase-8 e anti-poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) eram da BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA).

Para todos transferência de Western, o anti-β-actina (Sigma , St. Louis, MO) foi utilizado como controlo de carga. A cisplatina foi adquirido da Bristol-Myers Squibb Company (Princeton, NJ). DOTAP foi utilizado para transfectar os vectores plasmídicos para células H1299 e H322. o tratamento com cisplatina foi sempre administrada às células no ic

20 de dosagem (5). DOTAP: colesterol (DOTAP: Chol). (20 mM) em 5% de dextrose em água, utilizado para

In vivo

experiências, foi sintetizado pelo nosso laboratório com o uso de procedimentos padrão descritos anteriormente [5]

Construção de vectores de plasmídeo que expressa NPRL2

NPRL2 ADNc foi excisado de NPRL2 pAd-RAP-ADNc do plasmídeo [2] contendo NPRL2 humano e foi ligado no local de multiclonagem de pdCpG-KGB2 vector de expressão. A estratégia de clonagem tem sido previamente descrito [5]. vector vazio (pdCpG-KGB2) e um vector de plasmídeo que expressa o gene LacZ foram utilizadas como controlos negativos. Anteriormente, confirmou que a transfecção por este vector NPRL2 poderia realmente expressar a proteína NPRL2 exógena

in vitro

e

in vivo

[5] usando anticorpo anti-NPRL2 comprado de Abcam (Cambridge, MA ).

imunofluorescência e citometria de fluxo análises para γ-H2AX

imunofluorescência foi realizada em células cultivadas em lâminas de câmara. Em pontos de tempo designados, as células H1299 tratadas com NPRL2 com ou sem cisplatina foram fixados em formalina a 10% e incubadas com anti-H2AX fosfo-histona (Ser139) (1:100) anticorpos em 5% de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com bovina albumina de soro durante 1 h à temperatura ambiente. Subsequentemente, as células foram incubadas com isotiocianato de burro anti-IgG de ratinho-fluoresceína (FITC) (Santa Cruz Biotechnology) diluída 1:100 em PBS durante 45 minutos, e as amostras foram montadas com meio de montagem Vectashield com 4 ‘, 6-diamidino- 2-fenilindole (DAPI) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) para contracoloração os núcleos. Imediatamente, as lâminas foram examinadas com o uso de um microscópio de fluorescência. Além disso, depois da incubação do anticorpo com FITC, as células foram recolhidas, e as células com FITC-positivos foram contadas por meio de análise de citometria de fluxo.

Chk1 e Chk2 actividade de quinase de ensaio

Chk1 e Chk2 actividade de cinase in células H1299 tratadas com NPRL2 com ou sem um IC

20 valor de cisplatina foi avaliada com o uso de um K-LISA ponto de verificação Actividade Kit (EMD Biosciences, San Diego, CA), que é uma enzima-linked immunosorbent assay (ELISA) ensaio de actividade com base na. Resumidamente, as células H1299 foram plaqueadas em placas de 60-mm a 4 × 10

5 células por prato e no dia seguinte foram tratados com 4 ug de vector vazio ou NPRL2 com ou sem 3,0 fiM cisplatina. Após 72 h de incubação, os lisados ​​celulares foram preparados utilizando o ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) /tampão PBS (1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de sulfato de dodecilo e sódio [SDS]). Os lisados ​​celulares (0,5 ml com a concentração total de proteína de 2 mg /ml) foram pré-apuradas pela adição de 15 ul de proteína A /G-Plus Protein esferas de agarose (Santa Cruz Biotechnology) e incubadas durante 15 min a 4 ° C. Após centrifugação, os lisados ​​pré-apagada foram transferidos para um tubo fresco com 20 ul de anticorpo de Chk1 ou Chk2 e rodado durante 1 h a 4 ° C. Em seguida, foram adicionados 50 ul de proteína A /G-Plus proteína esferas de agarose e girado durante 90 minutos a 4 ° C. As pérolas de agarose foram lavadas com tampão RIPA /PBS, e um K-LISA ponto de verificação Actividade Kit foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. A actividade foi determinada pela leitura da absorvância a dois comprimentos de onda de 450 e 570 nm com o uso de um leitor de placas ELISA convencional.

Geração de clones estáveis ​​de linhas celulares de cancro do pulmão com interferência curto silenciamento de genes Chk2 mediada por RNA

Para gerar linhas de células com knockdown estáveis ​​de expressão Chk2, inicialmente selecionados quatro RNAs de interferência (siRNAs curtas) clonados em duplas vetores (U6-H1) expressão promotor comprados a partir de Sistema de Biociências (mountain View, CA). Resumidamente, o vector foi digerido com Bbsl e ligado com o recozido Chk2 siRNA concebido com base em ferramentas baseadas na web. Todos os oligos de sentido teve AAAG na extremidade 5 ‘e todos os oligos anti-sentido teve sequência AAAA na extremidade 5’. Também incluído um mutante como o controlo. As sequências foram as seguintes: CHK2Si1: 5’aaagGAACCTGAGGACCAAG3 ‘; CHK2ASi1: 5’aaaaCTTGGTCC TCAGGTTC3 ‘; CHK2Si2: 5’aaagCGCCGTCCTTTGAATA 3 ‘; CHK2ASi2: 5’aaaaTATTC AAAGGACGGCG3 ‘; CHK2Si3: 5’aaagAACGGTATTATACAC CHK2ASi3: 5’aaaaGTG TATAATACCGTT 3 ‘; CHK2Si4: 5’aaagAGTTTCAAGATCTTCTGTC 3 ‘; CHK2ASi4: 5’a aaaGACAGAAGATCTTGAAACT 3 ‘; CHK2Simta: 5’aaagGCTAGCTAGTCGATC 3 ‘; CHK2Simtb: 5’aaaaGATCGACTAGCTAGC3 ‘. Os clones estáveis ​​foram seleccionados com o uso de puromicina (1 jag /mL); e depois de terem sido estabelecidas, elas foram rastreados para níveis de expressão de proteína Chk2 em relação ao controlo. O clone com o melhor efeito de silenciamento (CHK2Si1 e CHK2ASi1) foi escolhido para os estudos funcionais.

silenciamento transiente da expressão do gene NPRL2 em linhas celulares de cancro do pulmão.

Para knockdown transitória de expressão NPRL2, utilizou-se ARNic em cadeia dupla sintéticos para atingir o NPRL2 sequência codificante de ARNm e as correspondentes siRNAs mexidos foram usadas como controlos não-específicos. A SMART-pool de quatro On-alvo siRNAs específicos de NPRL2 foram utilizados para este estudo: as sequências alvo eram 5’GCAUCGAACACAAGAAGUA 3 ‘, 5’GCAAGACAGGCAUGAGCUA 3’, 5’GUACUACGGCGUUGUGACA 3 ‘, e 5’GAC CCAAGAUCACCUAUCA 3’. Estes ARNsi foram adquiridos da Dharmacon (Lafayette, CO). células H1299 foram co-transfectadas com o plasmídeo que expressa e NPRL2 NPRL2-siRNAs, e vazio vector plasmídico e mexidos siRNAs foram utilizados como controlos, respectivamente. As células foram primeiro transfectados com o vector plasmídeo NPRL2 utilizando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) com 2,5 ug de ADN por 2 × 10

5 células por poço numa placa de 6 poços. Seis horas após a transfecção do plasmídeo, o meio de cultura celular foi substituído com meio fresco sem antibióticos e, em seguida, as células foram transfectadas com ARNsi, utilizando o reagente de transfecção DharmaFECT com 50 uM de SiRNA complexado com 5 ul de DharmaFECTper poço na placa de 6 poços acima. As células foram coletadas 24, 48 e 72 horas após a transfecção para a preparação de lisados ​​de proteína bruta para análise de Western blot

analisa

. Blot Immunoprecipitation-ocidental

H1299 células foram tratadas com 4 ug de vector vazio ou NPRL2 com ou sem 3,0 fiM cisplatina. Após 72 h de incubação, os lisados ​​celulares foram preparados usando tampão RIPA /PBS (1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS). Depois de bloquear com 1 ug de IgG normal e 20 ul de proteína A /proteína G-Plus esferas de agarose (Santa Cruz Biotechnology), proteínas foi imunoprecipitada a partir de 500 ug extractos utilizando 2 ug de anti-Cdc2 ou anticorpo B1 anti-ciclina (Santa Cruz Biotechnology) e 30 ul de proteína a /G agarose esferas de proteína-Plus durante 5 h a 4 ° C. A agarose foi recolhido por centrifugação e depois lavadas quatro vezes com tampão de PBS gelado. A seguir, os imunoprecipitados foram ressuspensos em 1 × tampão de amostra de SDS e aquecido com DTT 50 mM a 95 ° C durante 5 min; Western blot foi realizada tal como descrito previamente [20].

Análise da cinética do ciclo celular

Alterações na cinética do ciclo celular em células tumorais tratadas com NPRL2 com ou sem cisplatina foram analisadas por citometria de fluxo (com utilização de um separador de células activado por fluorescência [FACS]) usando um kit de APO-BrdU (BD Biosciences Pharmingen). Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 60-mm a 4 × 10

5 células por placa; no dia seguinte, as células foram tratadas com 4 ug de vector vazio ou um vector expressando NPRL2 com ou sem cisplatina. Em pontos de tempo designados, as células foram colhidas e fixadas em paraformaldeído a 1%. Após a incorporação de 5-bromo-2′-desoxiuridina 5′-trifosfatos (BrdUTPs), as células foram visualizadas com o uso do anticorpo anti-BrdU marcado com FITC. A quantidade de ADN celular total foi obtido por coloração das células com tampão de PI /RNase. As células foram processadas para análise FACS pelo terminal de desoxiuridina mediada por desoxinucleotidiltransferase 5-trifosfato de rotulagem (dUTP) nick-end (TUNEL coloração) para determinar a cinética do ciclo celular, como descrito anteriormente [20].

Os estudos em animais

Todos os animais foram mantidos e experimentos realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde e as diretrizes institucionais estabelecidas para o Biotério Núcleo da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center. Os animais utilizados neste estudo eram fêmeas

nu /nu

ratinhos (4-6 semanas de idade) que foram adquiridos a partir de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Antes da inoculação de células tumorais, os ratos foram submetidos a 3,5 Gy de irradiação de corpo inteiro a partir de uma fonte de radiação de césio-137 para processar completamente o sistema imune de ratinhos nus de rejeição de xeno-enxerto de tumor. Para avaliar a eficácia da administração sistémica de NPRL2 e cisplatina num modelo ortotópico de difusão pleural, os ratinhos receberam uma injecção intratorácica (agulha de calibre 27) de uma suspensão de células H322 a uma densidade de 2 × 10

6 células por 100 ul. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: A, tratou-se com LacZ; B, tratou-se com LacZ e cisplatina; C, tratada com NPRL2; e D, tratado com NPRL2 e cisplatina. . Cada grupo de tratamento consistiu em 2 murganhos

No dia 26, administrou-se diversas nanopartículas (DOTAP: complexo de ADN-Chol) intravenosamente nas veias da cauda de todos os ratinhos a uma dose de 25 ug de DNA de plasmídeo (LacZ ou NPRL2 plasmídeo) e 10 nmol de DOTAP: Chol cada em 100 ul de 5% de dextrose em água por ratinho. Nos grupos B e D, que injectado cisplatina (2,5 mg /kg de peso corporal) por via intraperitoneal, juntamente com as nanopartículas. Para estimar γ-H2AX e fosfo-Chk2 (Thr68) expressão em tumores, os ratinhos foram sscrificed 48 h mais tarde, os tumores e pleurais (maior do que 5 mm) de cada grupo foram aleatoriamente colhidas e rapidamente congelados. γ-H2AX expressão foi estimada por anti-fosfo histona H2AX (Ser139) anticorpo (1:100) e de burro anti-IgG de ratinho-FITC. As amostras foram, então, montadas com Vectashield com DAPI para contracoloração os núcleos. Imediatamente, as lâminas foram examinadas com o uso de um microscópio de fluorescência. Além disso, a expressão de fosfo-Chk2 foi analisado por anticorpos anti-fosfo-Chk2 anticorpo (Thr68) (1:100) usando um kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) e, em seguida, foi examinada microscopicamente.

Análise estatística

Todas as experiências foram repetidas pelo menos duas vezes com amostras em duplicado ou em triplicado. Análise de variância e teste de Fisher foram usados ​​para comparar os valores das amostras de teste e de controlo.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. StatView 5.0 software (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) foi utilizado para todas as análises estatísticas.

Resultados

Indução de actividades de caspase em resposta ao tratamento com NPRL2 e cisplatina

NPRL2 sensibiliza células resistentes à cisplatina (H1437R) para a apoptose induzida por cisplatina (Figura 1A). O aumento da apoptose foi detectada em todas as três linhas de células, resistentes à cisplatina NPRL2-negativo tratados com a expressão forçada de NPRL2 e cisplatina. Como mostrado na Figura 1A, a apoptose foi induzida em 33,4%, 42,0%, e 21,8% de H1437R, H1299, H322 e células, respectivamente, após tratamentos combinados. Também Western blotting usado para determinar a activação de caspases em células H1299 tratadas com vector vazio, vector vazio mais cisplatina, NPRL2, ou NPRL2 mais cisplatina (Figura 1B). Caspase-3, -8, -9 e foram activados apenas em células H1299 tratadas com NPRL2 e cisplatina, tal como mostrado pelos produtos de clivagem. Activação de caspase-2 foi detectada em células tratadas com cisplatina ou NPRL2 sozinho, bem como a combinação.

(A) indução de apoptose em células H1299 tratadas NPRL2 na presença ou na ausência de cisplatina (CDDP) por fluxo análise de citometria com coloração TUNEL. O PBS tratados e de vector vazio (EV) células tratadas foram usadas como controlos simulados e negativos, respectivamente. As barras de erro indicam SDs da média em três experimentos individuais (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,0005). (B), a activação de cascatas de caspase em células H1299 por análise de Western blot. Vários caspases em células H1299 foram analisados ​​por Western blotting 72 h após o tratamento com o vector vazio (VE) (com ou sem cisplatina) ou com NPRL2 (com ou sem cisplatina). Em células tratadas com NPRL2 e cisplatina, as caspases-3, -2, -8, -9 e polimerase e poli (ADP-ribose) (PARP) foram clivados. Além disso, caspase-2 foi activado por tratamento com apenas NPRL2.

Ativação da ATM e NBS1 por NPRL2

Nós utilizamos a análise de Western blot para avaliar a ativação de ATM em H1299 células resposta à activação ectópica de NPRL2 na presença ou na ausência de cisplatina (Figura 2A). Em H1299 células transfectadas com NPRL2, detectamos um baixo nível de fósforo-ATM (Ser1981) que tinha sido ativado por ATM quinase; após tratamento com NPRL2 e cisplatina, o nível de fósforo-ATM marcadamente aumentada de uma maneira dependente do tempo. Em células H1299 tratadas com controlo de vector vazio e cisplatina, foi detectada nenhuma alteração na expressão de fósforo-ATM em comparação com o controlo não tratado. Também examinámos a expressão de fosfo-NBS1 (Ser343) (Figura 2A), que é fosforilada pela activado ATM e recrutadas para os locais de danos no ADN para promover a transmissão de uma série de sinais de danos de ADN para alvos a jusante. Embora fosfo-NBS1 não foi detectada em células H1299 tratadas com vector vazio e cisplatina, foi detectada em células H1299 tratadas com NPRL2, e substancialmente aumentada de uma maneira dependente do tempo após o tratamento com cisplatina e NPRL2.

( A), Efeitos da expressão ectópica de NPRL2 na expressão e fosforilação de células ATM e NBS1 proteins.H1229 tratados com um vector vector vazio (EV) e IC

20 dose de cisplatina (3,0 M), NPRL2 ou NPRL2 e IC

20 dose de cisplatina foram colhidas aos 24, 48, e 72 h após o tratamento e analisadas quanto à expressão de ataxia telangiectasia mutada (ATM) quinase, fosfo-ATM (Ser1981), NBS1, e fosfo-NBS1 (Ser343). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Aumentos na fosfo-ATM e fosfo-NBS1 foram observadas em células tratadas com NPRL2 ou NPRL2 e cisplatina de uma forma dependente do tempo, mas não em células tratadas com o vector vazio de controlo e cisplatina. (B) Efeitos de siRNA-específica NPRL2 (Si) sobre a expressão de proteínas NPRL2 e ATM na presença e na ausência de cisplatina (CDDP). O siARN mexidos (Sc) foi usada como um controlo não específico.

A especificidade da activação mediada por NPRL2 da via de sinalização de ATM foi ainda confirmada através de experiências com siRNAs específicos do gene para knockdown NPRL2 expressão na presença e na ausência de cisplatina nestas células H1299 (Figura 2B). activação ectópica de células H1299 em NPRL2 NPRL2 deficientes em ATM activado, conforme indicado pela expressão de fosfo-ATM regulada positivamente às 24 h e 48 h após a transfecção em ambos na presença e ausência de cisplatina. Knockdown de expressão NPRL2 por siRNAs específicos de NPRL2 reduzida ou diminuiu a regulação positiva mediada por NPRL2 de expressão de fosfo-ATM, em comparação com aqueles tratados mexidos siRNAs controla nos mesmos pontos de tempo.

NPRL2 aumenta a expressão de γH2AX

in vitro

e

in vivo

Nós usamos Western blot para uma avaliação do curso do tempo da expressão da proteína γ-H2AX (Figura 3A). Em células H1299 tratadas com vector vazio e cisplatina ou NPRL2, os níveis de proteína γ-H2AX aumentado e eram as mesmas por 24 e 48 h após o tratamento. No entanto, às 72 h, os níveis de proteína γ-H2AX nas células tratadas com o vector vazio e cisplatina diminuiu acentuadamente, ao passo que os níveis em células tratadas com NPRL2 manteve-se praticamente os mesmos que os para as 24 h e 48-h de tempo de pontos. Em células tratadas com uma combinação de cisplatina e NPRL2, os níveis de proteína γ-H2AX aumentou de uma forma dependente do tempo.

H1229 células tratadas com um vector vazio e IC

20 dose de cisplatina (3,0 uM) , NPRL2, ou NPRL2 e IC

20 dose de cisplatina foram colhidas às 24, 48, e 72 h após o tratamento. (A) Western blot mostra notavelmente aumentada expressão de γ-H2AX em células tratadas com NPRL2 e cisplatina em comparação com as células tratadas com o vector vazio e cisplatina. expressão (B) γ-H2AX foi examinada às 48 h após o tratamento por coloração de imunofluorescência e análise de citometria de fluxo. γ-H2AX foi detectada expressão em células tratadas com o vector vazio e cisplatina ou NPRL2 mas não em células tratadas apenas com vector vazio, e esta expressão foi drasticamente aumentada em células tratadas com NPRL2 e cisplatina. Ampliação: × 800. Significa isotiocianato de fluoresceína (FITC) Intensidade também foi examinada a 24, 48, e 72 h após o tratamento. Nestes três pontos de tempo, expressão γ-H2AX em células tratadas com cisplatina NPRL2 e foi significativamente mais elevada do que nas células em todos os outros tratamentos (

P

0,02 ou

P

0,0005 ). Bares, SDs da média em dois experimentos individuais. expressão (C) γ-H2AX foi analisado por coloração por imunofluorescência, num modelo ortotópico de H322 difusão pleural, como descrito na secção Materiais e Métodos. As células de tumor pleural de ratos tratados com cisplatina ou LacZ e NPRL2 foram fracamente coradas; Em contraste, γ-H2AX foi hiperexpressa em células tratadas com NPRL2 + cisplatina. Ampliação:. × 400

Em seguida, imunofluorescência e análise de fluxo de citometria de expressão γ-H2AX às 48 h após o tratamento foi realizada (Figura 3B). Expressão da expressão da proteína γ-H2AX nos núcleos de células tratadas com ambos NPRL2 e cisplatina foi melhorada em comparação com o que em todos os outros grupos. Além disso, a intensidade média de FITC NPRL2 e tratamento com cisplatina foi significativamente elevado em comparação com a de todos os outros tratamentos (

P

0,02). Durante o curso de tempo

expressão da proteína

γ-H2AX foi em seguida, medido em um xenoenxerto de tumor humano NSCLC H322 ortotópico pleural em ratos. A linhagem celular H322 é NPRL2-negativo e cisplatina-resistente. No dia 26 após a injecção de células H322 intratorácica, administrou NPRL2 ou LacZ nanopartículas na veia da cauda, ​​com ou sem injecção de cisplatina intraperitoneal. Os tumores pleurais dos murganhos tratados com LacZ juntamente com cisplatina ou NPRL2 fracamente coradas para γ-H2AX (Figura 3C). Os tumores tratados com NPRL2 e cisplatina apresentaram altos níveis de γ-H2AX (Figura 3C).

Ativação de Chk1 e Chk2 por NPRL2 e cisplatina

in vitro

e

in vivo

Foi examinada a fosforilação de Chk1 na Ser-345 e Chk2 em Thr-68 por transferência de Western (Figura 4A). Em células H1299 tratadas com vector vazio e cisplatina ou NPRL2, Chk1 fosforilada aumentou de uma forma dependente do tempo. Em células tratadas com NPRL2 e cisplatina, expressão Chk1 foi bastante reforçada. Embora fosforilada Chk2 não foi detectada em células H1299 tratadas com vector vazio e cisplatina, é evidente que aumentou de forma dependente do tempo nas células tratadas com NPRL2 NPRL2 ou com cisplatina. Foram avaliadas a expressão da proteína fosfo-Chk2 nos xenoenxertos de tumores ortotópicos por coloração imuno-histoquímica de células de tumor de cada grupo (Figura 4B). As células tumorais dos ratos tratados com LacZ ou LacZ e cisplatina tinha coloração muito baixo nível. Para os tumores tratados com NPRL2, a expressão de fosfo-Chk2 foi detectada a um nível baixo (Figura 4B). O tratamento com a combinação NPRL2 e cisplatina induzida elevada expressão de fosfo-Chk2.

(A) H1229 células tratadas com vector vazio e IC

20 de cisplatina (3,0 M), NPRL2 ou NPRL2 + com IC

20 dose de cisplatina foram colhidas aos 24, 48, e 72 h após o tratamento e analisadas quanto à expressão de Chk1, P-Chk1 (Ser345), Chk2, e P-Chk2 (Thr68). Em células tratadas com o vector vazio e IC

20 dose de cisplatina ou NPRL2, P-Chk1 aumentou de uma forma dependente do tempo. Em contraste, no grupo tratado com NPRL2 e IC

20 dose de cisplatina, P-Chk1 foi drasticamente melhorada. Embora P-Chk2 não foi detectada em células H1299 tratadas com vector vazio e IC

20 dose de cisplatina, foi claramente aumentada de uma maneira dependente do tempo em que os tratados com NPRL2 ou NPRL2 + CI

20 dose de cisplatina. (B) A expressão da P-Chk2 foi analisada por imunohistoquímica, num modelo ortotópico de H322 difusão pleural, como descrito na secção Materiais e Métodos. A expressão da P-Chk2 foi ligeiramente detectado em células tumorais pleural a partir de ratinhos tratados com nanopartículas NPRL2, mas não nos tratados com LacZ ou LacZ + cisplatina. Em contraste, o tratamento por nanopartículas NPRL2 e cisplatina induzida a expressão elevada fosfo-Chk2 em células tumorais. Ampliação: × 400. (C) A actividade de quinase de Chk1 e Chk2 em células H1299 tratadas com vector vazio + CI

20 dose de cisplatina, NPRL2 ou NPRL2 + CI

20 dose de cisplatina foi analisado com a utilização de um K-LISA Kit ponto de verificação Atividade , um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio de actividade com base na. a actividade de cinase Chk1 foi maior em células tratadas com NPRL2 + cisplatina do que nas células tratadas com um vector vazio ou vector vazio + cisplatina (

P

0,003). actividade cinase Chk2 foi mais fortemente melhorada em células tratadas com NPRL2 ou NPRL2 + cisplatina do que nas células tratadas com um vector vazio ou vector vazio + cisplatina (

P

0,0001). Bares, SDs da média em quatro experimentos individuais.

Nós também mediram a atividade de cinase de Chk2 e Chk1 em H1299 células tratadas com NPRL2 com ou sem cisplatina com o uso do Kit K-LISA Checkpoint Atividade , um ensaio de actividade de quinase baseado em ELISA. a actividade de cinase Chk2 em células tratadas com NPRL2 ou NPRL2 e cisplatina foi fortemente melhorados em relação com a actividade em células tratadas com o vector vazio com ou sem cisplatina (

P

0,0001) (Figura 4C). a actividade de cinase Chk1 em células tratadas com NPRL2 e cisplatina foi mais forte do que nas células tratadas com o vector vazio com ou sem cisplatina (

P

0,003). (Figura 4C)

Para definir melhor o natureza da interacção com NPRL2 Chk2, analisamos o efeito de expressão NPRL2 Chk2 e na apoptose, utilizando-specific siRNA Chk2 (Figura 5A) para derrubar Chk2 expressão em células resistentes a cisplatina (H1437 H1437R) (Figura 5B).