Abstract
Klotho foi identificado pela primeira vez em 1997 e tem sido considerado como um gene de anti-envelhecimento. Novas evidências demonstra que Klotho tem uma relação estreita com câncer, incluindo câncer de pulmão, câncer de mama, etc, inibindo a proliferação e promover a apoptose das células cancerosas. A cisplatina tem sido o fármaco mais utilizado na quimioterapia de primeira linha. No entanto, o aumento em células cancerosas resistentes à cisplatina tornou-se um grande obstáculo no manejo clínico dos casos de câncer. No nosso estudo, pela primeira vez demonstrado que Klotho poderia atenuar a resistência de cancro do pulmão de cisplatina com base quimioterapia e a apoptose das células resistentes com superexpressão Klotho foi marcadamente aumentada. No entanto, as células Klotho knockdown mostrou resistência à quimioterapia reforçada. Outras análises mostraram que a inibição da via PI3K /Akt com inibidor específico (LY294002) atenuou os efeitos sobre o crescimento do cancro PROMOTIVE seguinte interferir com Klotho shRNA. Além disso, foi demonstrado que Klotho modulada a resistência à cisplatina em um modelo de xenoenxerto de murganhos nus. Estas observações sugerem que Klotho poderia melhorar a resistência das células de cancro do pulmão para quimioterapia e pode servir como um alvo potencial para a terapia genética de cancros do pulmão resistente a quimioterapia com cisplatina
citação:. Wang Y, Chen L, Huang G, ele D, J Ele, Xu W, et al. (2013) Linha celular Klotho sensibiliza Câncer de Pulmão Humano à cisplatina via via PI3K /Akt. PLoS ONE 8 (2): e57391. doi: 10.1371 /journal.pone.0057391
editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de junho de 2012; Aceito: 24 de janeiro de 2013; Publicação: 21 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (No. 30.971.320). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por 75-85% dos casos de câncer de pulmão e quimioterapia desempenha um papel importante no tratamento de câncer de pulmão [1]. A cisplatina tem sido o fármaco mais utilizado na quimioterapia de primeira linha. Cisplatina pode ativar várias vias de sinalização, incluindo as que envolvem ATR, p53, p73, e MAPK, e ativar a apoptose [2], [3]. A sua citotoxicidade é atribuído à formação de aductos de ADN, que causam a reticulação inter- e intra-cadeia, que inibe a replicação do ADN. No entanto, a resistência de cancro do pulmão para a quimioterapia tem sido um dos principais factores que afectam a eficácia terapêutica no tratamento de cancro do pulmão. Assim, é imperativo desenvolver estratégias para melhorar a resistência do cancro do pulmão humano a platina quimioterapia à base. O mecanismo subjacente a resistência das células cancerosas à quimioterapia é complicada e envolve a activação da via PI3K /Akt (também conhecido como PI3K /PKB) via, a perda da função de p53, a sobre-expressão de HER-2 /neu e anti-apoptótico Bcl -2, e a activação de caspase comprometida [2], [3]. Assim, para investigar profundamente o mecanismo subjacente a resistência das células cancerosas à quimioterapia tem grande importância clínica no tratamento de cancros.
Klotho é um anti-envelhecimento gene recém-descoberto e foi originalmente identificado em ratos mutantes homozigotos Klotho ( kl – /-), que mostrou um síndroma relacionado com o envelhecimento do tipo humano e desenvolver vários distúrbios, tais como hipogonadismo, calcificação ectópica, a osteoporose, a atrofia da pele, e enfisema pulmonar [4]. No entanto, os ratos com Klotho sobre-expressão têm uma vida útil estendida que é 30% maior no sexo masculino e 20% maior em mulheres [5]. gene Klotho codifica um single-pass tipo 1 transmembranares ou forma segregada de proteína Klotho através de splicing de RNA alternativo [6]. Klotho foi mostrado exercer um efeito inibidor sobre o factor de crescimento 1 (IGF-1) via semelhante à insulina tanto em células cancerosas animais humanos e células cancerígenas pancreáticas [7], [8]. O nosso estudo anterior, também este fenómeno encontrado em células de cancro do pulmão humano (células A549) e nos quais também conferidos Klotho um efeito pró-apoptótico através da Bax /Bcl-2 via [9]. PI3K /Akt é um dos importantes down-fluxos de IGF-1 via, e numerosos estudos têm confirmado o seu papel na apoptose de células cancerosas [10] – [12]., E pode sensitisize estas células cancerosas à cisplatina
neste estudo, a hipótese Klotho poderia inibir a via PI3K /Akt e mais para aliviar a resistência das células de câncer de pulmão a cisplatina e pode servir um candidato forte para a terapia genética de câncer de pulmão.
materiais e Métodos
Ética declaração
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal de Nanjing Medical University (número de autorização: 2.120.474). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia com pentobarbital de sódio, e todos foram feitos esforços para minimizar o sofrimento.
Cultura de células e transfecção
linha de células de cancro do pulmão humano (células A549) foi obtida a partir da American Type Culture coleção (ATCC). As células H460 e cisplatina-resistente A549 e H460 células (H460DDP A549DDP e) foram gentilmente cedidas pelo Prof. Zhou em Xangai Pulmonar Hospital. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS) (Life Technologies, Inc.), 100 U /mL de penicilina, 100 U /ml de estreptomicina, 2 mM glutamina numa atmosfera humidificada com 5% de CO
2 a 37 ° C. Para manter a resistência à droga, as células A549 /DDP e H460 /DDP foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 2 ug /ml e, em seguida, DDP em DDP RPMI 1640 isento de dois dias antes de experiências. células A549DDP atingindo 80% de confluência foram transfectados com pCMV6-MYC-KL e seus shRNAs específicas na presença de lipofectamina 2000 (Invitrogen). O shRNAs foram os seguintes:
sh-1: CCTAAGCTCTCACTGGATCAATCCTCGAA;
sh-2: CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT;
sh-3: GGTCACTCACTACCGCTTCTCCATCTCGT;
sh- 4:. GTTACAGCATCAGGCGTGGACTCTTCTAT;
Todos os plasmídeos foram adquiridos a partir da OriGene (Rockville, MD, EUA)
Ensaio MTT
a metade da concentração máxima inibitória (IC50) e A549DDP as células A549 foram determinadas pelo ensaio de MTT (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio) (Sigma). As células cancerígenas foram inoculadas em placas de 96 poços (1 × 10
4 células por poço), e tratadas com cisplatina a diferentes concentrações durante 48 h. Após a incubação, o meio foi substituído com 50 mL de reagente MTT (brometo de 2 mg /mL), seguido por outra incubação numa atmosfera com 5% de CO
2 a 37 ° C durante 2 h. Então, os meios foram removidos e dimetilsulf óxido (DMSO) (150 mL) foi adicionado a cada poço. A densidade óptica (DO) de cada poço foi medido utilizando um leitor de microplacas a 560 nm.
morfológica exame
Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com 80 uM (IC50 para A549DDP) cisplatina durante 8 h, e 60 uM para H460DDP, e, em seguida, lavada uma vez em tampão fosfato salino (PBS), seguido por fixação em methonal frio: acetona (1: 1) durante 5 min. Após lavagem três vezes em PBS durante 5 min, estas células foram tratadas com 4 ug /ml de 4 ‘, 6-diamidinas-2’-fenilindole dicloridrato (DAPI) (Sigma) durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram então examinadas por microscopia de fluorescência. As células foram selecionados aleatoriamente para o exame com grande ampliação (× 400) e fotografadas. Ambas as células normais (grande nucleares, dispersão e fluorescência homogênea) e as células em apoptose (encolhimento nuclear e núcleos hipercromáticos) foram contadas sob cada campo.
A citometria de fluxo
As células foram colhidas e suavemente desagregado para uma suspensão de célula única. A coloração foi feita de acordo com o protocolo do fabricante. A taxa de apoptose induzida por regimes anticancro foi analisada por citometria de fluxo utilizando um kit /PI anexina V-FITC (BD Biosciences, San Diego, CA) seguindo as instruções do fabricante.
em tempo real de RT-PCR
o ARN total foi extraído a partir de células com o reagente TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante, e quantificado por medição da absorvância a 260 nm. expressões de genes foram detectados por quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR) usando o kit de SYBR verde de RT-PCR padrão (Takara, Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado utilizando o kit de RevertAid da primeira cadeia de síntese de ADNc (Fermentas, Vilnius) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências dos iniciadores foram projetados com Origene Technologies, Inc. Os iniciadores utilizados foram os seguintes:
Klotho
sentido: 5′-GCTCTCAAAGCCCACATACTG -3 ‘;
antisense: 5′ -GCAGCATAACGATAGAGGCC -3 ‘;
β-actina
sentido: 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′;
antisense: 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ‘;
condições de PCR consistiram em pré-desnaturação a 94 ° C durante 5 min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a a 94 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 30 seg e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min.
ensaio Western blot
24 h e 48 h após a transfecção, as células foram lavadas duas vezes em PBS e proteínas geladas foram extraídos a partir de células por lise em tampão RIPA (NaCl 150 mM, 1% [v /v] de NP-40, 0,5% [W /v], desoxicolato de sódio, 0,1% [W /v] de dodecilsulfato de sódio (SDS), Tris HCl 50 mM [ ,,,0],pH 8], EDTA 10 mM e PMSF 1 mM [Sigma]) durante 30 min a 4 ° C e centrifugação subsequente durante 15 minutos a 12.000 g. A concentração de proteína foi determinada com um kit BCA (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 60 ug de proteína foi carregada a 10% (w /v) em gel de SDS-poliacrilamida, a electroforese e transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore Corporation Billerica, MA 01821), que foi então bloqueada durante 2 horas à temperatura ambiente com bloqueando (tampão TBS contendo 0,1% [v /v] de Tween 20 [Sigma] e 5% [W /v] de leite em pó). Os anticorpos primários (aplicado durante 1 h à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C) foram: anti-fosfo-Akt, Akt anti-, (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), anti-Bax, anti-Klotho , e anti-GAPDH (Santa Cruz). Os anticorpos foram diluídos a 1: 1000, excepto para o anticorpo anti-GAPDH (1: 500). Em seguida, as membranas foram incubadas durante 2 h com anticorpos secundários conjugados com HRP (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) (cavalo anti-ratinho ou anti-coelho de cabra; 1: 20000). A visualização foi realizada utilizando um kit ECL, e os sinais foram quantificadas por densitometria de varrimento.
Transdução de Lentivirus
Os vectores lentivirais que expressam hairpin RNAs curtos (shRNAs) foram construídas com sucesso por OriGene (Rockville , MD, EUA) como previamente descrito. As sequências de oligonucleótidos Klotho-shRNA eficazmente construídos eram como se segue, sentido: 5′-
CGCGTCCCC
CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT
TCAAGAGAGGTCAATCCAGGAAAGCAGTTGCCTCAGTTTTTGGAAAT
-3′.
The sequências foram inseridos no
mul
I e
cla
Eu enzima locais de pLVTHM vetor, respectivamente. Para a reacção de recombinação utilizando vectores pCMV-VSV-G e pCMV-dR8.74 (
Addgene
, Cambridge, MA), os ADN vector lentiviral e vectores de embalagem foram então transfectados para células 293T. Após 48 horas da transfecção, os sobrenadantes contendo os lentivírus foram colhidas, centrifugado a 1800 g durante 10 min, e filtrada através de um 0,45 um poli (difluoreto de vinilideno) membrana Durapore (Millipore, Billerica, MA, EUA) para remover quaisquer células não aderentes de embalagem. linha de células de câncer de pulmão resistente (A549DDP) estava infectado com o lentivírus. Em seguida, as células infectadas foram seleccionadas por puromicina (0,4 ug /ml) durante 14 dias. células A549DDP infectado com shRNA alvo Klotho (sh-Klotho) ou mediada por lentivírus shRNA (corrida) mediada por lentivírus foram nomeados A549DDP-lenti-sh-2 ou A549DDP-lenti-corrida, respectivamente.
Em experimentos in vivo em ratinhos nus
Para os experimentos in vivo, foram utilizados ratos atímicos Masculino (BALB /c nu /nu, quatro semanas de idade). Eles foram injectados subcutaneamente com células A549DDP-SH-embaralhamentos A549DDP-lenti-SH-2 ou. Quando os tumores medido um volume médio de 100 mm3, os ratinhos (6 por grupo) foram tratados com cisplatina (3,5 mg /kg, 2 vezes por semana) ou PBS durante 21 dias. Os tumores foram medidos com compassos de calibre. Os volumes dos tumores foram calculados pela seguinte fórmula: Volume do tumor (mm3) = 0,5 * comprimento (mm) * largura (mm) * largura (mm)
A análise estatística
Os dados foram expressos como. significa ± desvio padrão (SD). As experiências foram realizadas pelo menos em triplicado. As comparações foram feitas com o teste t de Student de duas caudas ou ANOVA. Um valor de
P
. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
expressão Klotho foi regulada em células cisplatina resitant
Para confirmar a resistência de células A549DDP e H460DDP, ensaio de MTT foi realizado para medir a IC50 de células A549 e células A549DDP. Os resultados mostraram a IC50 foi de 17,7 ± 1,93 uM em células A549 e 86,6 ± 13,2 uM em células A549DDP, enquanto H460DDP e a sua linha de células progenitoras foram 63,5 ± 3,8 e 27,7 ± 2,0, respectivamente (Figura 1A). A expressão de Klotho foi determinada por PCR em tempo real e ensaio Western blot. O nível de ARNm relativa de células em Klotho A549DDP foi cerca de 35% mais baixa do que em células A549 (Figura 1B). ensaio de Western blot mostrou a mesma tendência na expressão de proteínas de Klotho em ambas as linhas celulares (Fig 1C). Além disso, foi identificada a expressão de Klotho e IC50 em outras linhas celulares, incluindo H1299, PC-9, H1650 e MCF-7 (Fig 1C) e verificou-se que as expressões Klotho endógenos foram negativamente relacionada com a sensibilidade a cisplatina (Fig 1C) e análise estatística mostrou uma relação inversa entre expressões Klotho e IC50. Assim, especulamos que houve relação entre a expressão Klotho e a resistência à cisplatina e a expressão Klotho pode contribuir para a resistência
A:. Duas linhas de células tratadas com cisplatina apresentaram diferença na IC50. B: RT-PCR quantitativo para a detecção da expressão Klotho em células A549 e células A549DDP. C: análise por Western blot da expressão Klotho num painel de linhas celulares de cancro do pulmão, incluindo duas variantes resistentes cisplatina e de uma linha celular de cancro da mama (MCF-7). Klotho expressão é superior em H460 parental, e linhas de células A549, em comparação com as variantes resistentes a cisplatina. Klotho maior expressão foi também detectada em H1299, PC-9, H1650 e linhas de células MCF-7. GAPDH serviu como uma referência interna. A detecção foi feita em triplicado e os dados foram apresentados como média ± SD (* P 0,05)
Sobre-expressão de Klotho poderia inibir a via de sinalização Akt e induzir a apoptose de células A549 /DDP
Para determinar o papel de Klotho cisplatina na resistência de células resistentes a cisplatina, é detectada pela primeira vez a expressão de p-AKT em A549, H460 e as suas células resistentes à cisplatina. Os resultados demonstraram que a expressão da Akt fosforilada foi significativamente reduzido nas células A549 e H460 (Fig 2A). Em seguida, foram preparadas células cancerosas com Klotho sobre-expressão. Tal como mostrado na Figura 2C, as expressões proteína de Klotho em ambas as linhas celulares foram marcadamente aumentada após a transfecção. O efeito de Klotho sobre-expressão na resistência das células A549 /DDP e H460 /DDP a cisplatina foi determinada pelo ensaio de MTT. Os dados são apresentados na Figura 2B. A proliferação de células transfectadas com Klotho foi significativamente suprimida quando comparada com o grupo de controlo. Os valores de IC50 médios foram mais baixos em células transfectadas KLOTHO o que implica que estas células eram mais sensíveis a cisplatina. Além disso, a expressão de Akt fosforilada foi negativamente relacionada com a expressão Klotho, células com sobre-expressão Klotho mostrou uma diminuição da expressão de Akt fosforilada quando comparada com o grupo de controlo (Fig 2C). Em seguida, foi detectada a apoptose de células submetidas a transfecção Klotho. Coloração DAPI é um método para detectar a apoptose. células em apoptose vai morfologicamente apresentar as características de apoptose seguintes DAPI coloração: condensação nuclear brilhante e corpos apoptóticos perinuclear. Citometria de fluxo é uma técnica para a contagem, a análise e ordenação partículas microscópicas suspensas numa corrente de fluido. Ele permite a análise multiparamétrica simultânea das características físicas ou químicas das células individuais fluem através de um aparelho de detecção electrónica, e é vulgarmente utilizado para detectar a apoptose. ensaio Western blot revelou que a expressão do Bax e Bcl-2 apresentaram as mesmas tendências para aqueles em citometria de fluxo e coloração com DAPI (Figura 2D). A coloração com DAPI mostrou que o número de células apoptóticas com Klotho sobre-expressão foi dramaticamente aumentada quando comparados com aqueles submetidos a transfecção com o plasmídeo em branco, mas a apoptose de células tratadas com o plasmídeo em branco foi comparável à que no controlo (Figura 2E). A citometria de fluxo mostrou a análise da apoptose das células transfectadas com A549DDP Klotho foi de 47%, enquanto que foi de 19,8% H460DDP, o que significa que foram mais sensíveis à cisplatina em comparação com os controlos negativos (Figura 2F). Estas descobertas sugerem que Klotho poderia aumentar a sensibilidade de células resistentes à cisplatina cisplatina, elevando a apoptose de um modo dependente de Akt
A, B:. Ensaio Western blot mostrou que a expressão de P-Akt estava significativamente aumentada nas células resistentes à cisplatina. C: Ensaio MTT mostrou uma grande diminuição no IC50 das células Klotho transfectadas. D: ensaio de Western blot mostrou que a expressão elevada de Klotho em células resistentes a cisplatina. expressão P-Akt foi regulada em células resistentes a cisplatina após transfecção Klotho. GAPDH serviu como uma referência interna. O experimento foi realizado em triplicado e os dados foram apresentados como a média ± DP (* P 0,05)
Além disso, foi investigado o fenótipo das células resistentes a fármacos e as células-mãe, e verificou-se que ERCC1 foi regulada para baixo nas células transfectadas KLOTHO, enquanto que a P-gp, um gene relacionado com o efluxo de droga, e contribui para a resistência mais cisplatina, não foi afectada pela Klotho (Fig 2C). Estes resultados implicaram que Klotho pode afectar a reparação das células através de ERCC1 para alterar a resistência das células cancerosas, em vez de aumentar o efluxo dependente de energia do fármaco hidrofóbico.
Klotho knockdown inibiu a apoptose e aumento da resistência à cisplatina em A549 células /DDP
Para investigar adicionalmente o papel de Klotho na resistência das células à quimioterapia, Klotho knockdown foi realizada em células A549DDP e H460DDP com shRNAs específica. Quatro shRNAs foram projetados e transfectado em células A549DDP ou H460DDP como descrito em nosso estudo anterior, em que resultados demonstraram que o sh-2 mostrou a melhor eficiência de interferência [9]. Neste estudo, SH-2 foi utilizado nas experiências seguintes. Tal como mostrado na Figura 3B, o ensaio de Western Blot demonstrou a expressão de Klotho foi significativamente regulada para baixo por cerca de 50% em comparação com o grupo de controlo negativo em ambas as linhas celulares. A seguir, foi explorado o efeito do knockdown Klotho sobre a sensibilidade das células resistentes a cisplatina, em que um ensaio MTT foi utilizado para examinar a CI50 de células A549DDP e H460DDP (Fig 3A). Os resultados mostraram a CI50 de células transfectadas shRNA tiveram um aumento pronunciado no IC50, em comparação com o grupo de controlo negativo. Especialmente em células A549DDP, a IC50 média de células transfectadas shRNA foi 452,5 ± 20,69