Abstract
A evidência clínica sugere que lymphangiogenesis e metástase linfática são processos importantes durante a progressão do câncer de próstata. factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) -C mostrou ser um regulador chave nestes processos. Os nossos estudos anteriores demonstraram que o ácido lisofosfatídico (LPA), um factor de crescimento de lípido-baixo peso molecular, aumenta a expressão de VEGF-C em células endoteliais humanas. Nós anteriormente demonstrado que o receptor de LPA desempenha um papel importante no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra em linfático. No entanto, os efeitos do LPA sobre a expressão de VEGF-C no cancro da próstata não são conhecidos. Aqui, demonstramos que o LPA-regulado a expressão de VEGF-C em três linhas de células de cancro da próstata humano diferentes. No PC-3 células cancerosas humanas da próstata, os efeitos intensificadores de LPA foram mediadas através de ambos LPA1 e LPA3. Além disso, as espécies de oxigénio reactivas (ROS) de factor de crescimento derivado de epitélio expressão (LEDGF) e produção de lentes estavam envolvidos na LPA
expressão de VEGF-C 1/3-dependente. Além disso, autotaxina (ATX), uma enzima responsável pela síntese de LPA, também participam na regulação da expressão de VEGF-C. Ao interromper LPA
1/3 de PC-3, o meio condicionado (CM) induzida por marcadores linfáticos humanos umbilical células endoteliais da veia (HUVEC) expressão também foi bloqueado. Em resumo, descobrimos que LPA aumenta a expressão VEGF-C através da activação LPA
vias de 1 /3-, ROS- e LEDGF-dependentes. Estas novas descobertas poderiam potencialmente lançar luz sobre o desenvolvimento de novas estratégias para prevenir metástases linfáticas de cancro da próstata
citação:. Lin C-E, Chen S-L, Lin C-C, Chang, C-H, Lin Y-C Tai Y-L, et al. (2012) ácido lisofosfatídico Melhora crescimento endotelial vascular Factor de C-Expressão em humanos cancro da próstata PC-3 em células. PLoS ONE 7 (7): e41096. doi: 10.1371 /journal.pone.0041096
editor: Masuko Ushio-Fukai, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de abril de 2011; Aceito: 21 de junho de 2012; Publicação: 20 de julho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. A pesquisa foi apoiado por subsídios (NSC97-2311-B-002-002-MY3, NSC 99-2120-M-002-004 e INDH 101-EX101-10130BI) do Conselho Nacional de Ciência e Institutos de pesquisa de Saúde Nacional da República da China . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata é um dos cancros mais frequentes em homens. A progressão do cancro da próstata altamente metastático envolve processos tais como a perda de adesão celular, invasão local aumentada, angiogénese, linfangiogénese e [1]. Linfangiogênese recentemente foi encontrado para desempenhar um papel importante na metástase do cancro da próstata, e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) -C é um importante regulador linfática. VEGF-C liga-se ao receptor de VEGF (VEGFR) -3 e activa as vias de sinalização associadas ao Linfangiogênese [2]. evidência clínica muito revelou uma correlação entre a expressão de VEGF-C e linfonodo metástases regionais no câncer de próstata [3], [4]. Sobre-expressa o VEGF-C em células de cancro da próstata LAPC-9 tumor melhorada metástases linfáticas [5]. Na linha celular de cancro da próstata CWR22Rv-1, as células que sobre-expressam o VEGF-C mais frequentemente metastizado para os nódulos linfáticos e pulmões. No entanto, a taxa de crescimento tumoral e angiogénico comportamento não foram afectados pela sobre-expressão de VEGF-C [6]. Wu et al. em 2008, também mostraram que uma armadilha de ligando de VEGF-C e VEGFR-3 anticorpo reduziu significativamente a linfangiogénese e metástases de cancro da próstata para os nódulos linfáticos e órgãos distais. Todos estes resultados sugerem que os linf medeia a metástase do cancro da próstata.
ácido lisofosfatídico (LPA) é um factor de crescimento de lípido-baixo peso molecular que se liga a receptores da família da proteína G-acoplada (GPCRs) Edg e regula múltiplos celular funções [7], [8]. LPA foi sintetizado por clivagem enzimática de ácido fosfatídico de membrana. Uma vez que uma resposta inflamatória é accionado, o LPA é libertado a partir de plaquetas e induz múltiplas respostas celulares, tais como a migração celular, a proliferação, e a cura de feridas [9]. Além disso, as células cancerosas que sobre-expressam receptores de LPA também exibiu um aumento invasão tumoral e metástase [10]. A expressão de comutação de LPA
1 e LPA
3 receptores se encontra a ser associado com o desenvolvimento do cancro da próstata [11]. Na linha de células de câncer de próstata, LPA estimula as células PC-3 motilidade através LPA
1 [12]. Além disso, o LPA protege PC-3 a partir de derivados de apoptose através de uma inanição factor nuclear (NF) -κB-dependente via [13]. Todos estes resultados sugerem que o LPA desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata.
Autotaxina (ATX) é uma glicoproteína de 125 kDa que pertence à família ectonucleotide pirofosfatase /fosfodiesterase (ENPP) que tem a capacidade para hidrolisar ligações fosfodiéster
in vitro
. Além disso, também foi relatado ATX possuir lisofosfolipase D (LysoPLD) função enzimática, que hidrolisa a lisofosfatidilcolina (LPC) para gerar LPA [14], [15]. Em ATX-sobre-expressando ratinhos transgénicos, epitélio mamário é suficiente para iniciar a tumorigénese e gerar cancro altamente metastático [16]. Além disso, em estudos clínicos de cancro da próstata, os níveis elevados de expressão de ATX foram associados com ambos os potenciais malignas e resultados pobres [17].
Foi relatado que após privação de soro, o VEGF-C mensageiro (m) a expressão de ARN cancro de células foi aumentado por tratamento com soro a 10%. Esses resultados sugerem que há um factor de soro de regulação da expressão de VEGF-C [18]. Além disso, depois de derrubar zLPA
1 no peixe-zebra, o desenvolvimento embrionário ducto torácico estava com defeito [19]. Em células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs), LPA pode induzir a formação de tubo e expressão do marcador linfática através LPA
1/3 [20], [21]
. Esses resultados sugerem que os sinais de LPA-derivados são necessárias para o desenvolvimento de vasos linfáticos. No entanto, os papéis de LPA em lymphangiogenesis induzidas por células cancerosas permanecem incertas.
Em nossos resultados atuais, mostramos que LPA-regulada VEGF-C mRNA em diferentes linhas celulares de cancro da próstata humano. Ao usar um
1/3 antagonista LPA, demonstramos que estes efeitos aumentam em células PC-3 foram LPA
1 e LPA
3 dependente. Além disso, a produção de ROS e o factor de transcrição, factor de crescimento derivado de lente-epitélio (LEDGF), estavam envolvidos na regulação da expressão de VEGF-C de LPA. ATX, uma enzima responsável pela geração de LPA, também regulada a expressão de VEGF-C e secreção. Usando HUVECs, demonstramos que meios condicionados (CM) de células PC-3 aumentou a expressão de marcadores, tais como linfáticos Prox-1 e LYVE-1. Além disso, o pré-tratamento com Ki16425, LPA
1/3 antagonista bloqueou os efeitos reforço destes CM. Os nossos resultados sugerem que o ATX LPA e regular a expressão de VEGF-C em células de cancro da próstata e que pode levar a metástases linfáticas. Portanto, o bloqueio da LPA e sinalização VEGF-C pode ser uma estratégia eficaz para o tratamento de câncer de próstata.
Resultados
LPA Estimula VEGF-C de expressão em diferentes linhas celulares do cancro da próstata
para investigar se o LPA é um estimulador para a expressão de VEGF-C no cancro da próstata, que seleccionado do LNCaP, DU145, PC-3 e linhas de células de cancro da próstata humanos para testar a possibilidade. LNCaP é uma linha celular de cancro da próstata metastático e de baixo dependente de androgénio. Em contraste, DU145 e PC-3 são ambos independente de androgénios e altamente metastático. Todas as três linhas celulares foram tratadas com diferentes concentrações de LPA, e as amostras de RNA foram recolhidos. A partir da análise por PCR em tempo real, verificou-se que LPA estimulou a transcrição de VEGF-C de um modo dependente da dose em todas as três linhas de células de cancro da próstata (Fig. 1A-C). Nós usamos células PC-3 para analisar mais aprofundadamente se LPA aumenta a expressão da proteína VEGF-C e secreção subsequente. Para determinar o nível de translação do VEGF-C, as células PC-3 foram tratados com LPA, e os lisados celulares foram obtidos utilizando tampão RIPA. Os lisados celulares foram resolvidas com SDS-PAGE e detectadas com um anticorpo de VEGF-C. Os níveis de proteína VEGF-C intracelulares foram reforçados por tratamentos 1 e 5 uM de LPA (Fig. 1D). Para determinar a secreção de VEGF-C, as células PC-3 foram tratadas com 5 uM de LPA para 12 h, e os meios condicionados foram recolhidos. O meio condicionado foi analisado por um kit de ELISA de VEGF-C. Verificou-se que o LPA estimula também a secreção de VEGF-C (Fig. 1E).
LPA-expressão aumentada de VEGF-C é mediada através de LPA
1 e LPA
3 em células PC-3
Em células de câncer de próstata, LPA receptores 1-3 perfis de expressão são bem estudados e são pensados para associar com o desenvolvimento e progressão do câncer de próstata. No entanto, em diferentes linhas celulares de cancro da próstata, os perfis dos receptores de LPA diferentes são diferentes. As células PC-3 expressam o mais alto
1 nível de expressão LPA e o menor
nível 3 expressão LPA, enquanto em comparação com LNCaP e DU145. Em contraste, as células LNCaP expressam o mais elevado nível de LPA
3 e o menor nível de LPA
1 entre as linhas de células de cancro da próstata três [11]. No nosso estudo anterior, o LPA
1/3 é responsável por LPA expressão aumentada de VEGF-C em células HUVEC [20]. Assim, utilizou-se primeiro Ki16425, um antagonista de LPA
1 e LPA
3, para determinar se estes dois receptores lisofosfatídico são responsáveis por LPA efeito sobre a expressão de VEGF-C em células de cancro da próstata. No estudo anterior, Ki16425 já tem provado ser capaz de bloquear o ATX motilidade induzida em células PC-3 [12]. Após o tratamento Ki16425, o efeito de aumento do LPA sobre a expressão de VEGF-C foi significativamente diminuída em LNCaP, DU145 e células PC-3 (Fig. 2A). Para confirmar ainda mais a observação, as células PC-3 foram transfectadas transientemente quer com LPA
1 ou LPA
3 siRNA. perfil de expressão LPA1-3 foi testado em LPA1 e LPA3 células transientemente knockdown. Nossos resultados sugerem a sequência de siRNA foram selecionados poderia alvo específico
1 e LPA
3 receptor LPA sem interromper os outros dois receptores (Fig. 2B). De acordo com 10% de FBS em meio RPMI cultura, os níveis de ARNm basais de VEGF-C na LPA
1 ou LPA
3 knockdown células foram ambas reduzidas em 51% e 37% em separado. Em RPMI única cultura, os níveis de ARNm basais de VEGF-C na LPA
1 ou LPA
3 células knockdown foram ambas reduzidas em 58% e 36% respectivamente, em comparação com células de controlo siARN transfecção mexidos (Fig. 2C). Isto implica que o LPA é um forte indutor de VEGF-C em soro. Além disso, derivado de células de LPA também pode ser um regulador para o VEGF-C em células PC-3. Por tratamento direto com LPA, observamos também que LPA-reforçada expressão VEGF-C foi diminuída em células PC-3 transfectadas transitoriamente com qualquer LPA
1 ou LPA
3 siRNA (Fig. 2D). Os resultados sugeriram que tanto LPA
1 e LPA
3 estão envolvidos e crítica no controle da expressão de VEGF-C
. Além disso, há diferenças significativas entre a taxa de crescimento do LPA
1, LPA
3 células knockdown e células de controlo sob a LPA e tratamento do soro (Fig. S1).
(A, B e C ) O LNCaP, DU145, e linhas celulares de cancro da próstata PC-3 humano foram tratados com diferentes doses de LPA durante 2 h. ARNm foi transcrito reverso e analisados por um PCR em tempo real. O nível relativo de VEGF-C normalizadas para GAPDH é mostrada. (D) PC-3 células foram tratadas com diferentes concentrações de LPA durante 4 h. Os lisados celulares foram resolvidas por 12% SDS-PAGE e analisados por transferência de Western utilizando um anticorpo anti-VEGF-C. GAPDH serviu como controlo de carregamento. células (E) PC-3 foram tratados com 5 LPA uM durante 12 h. O meio condicionado foi recolhido e medido com um kit de ELISA de VEGF-C. * Estatisticamente diferente em comparação com a amostra incubada veículo tratado com LPA (*
p Restaurant 0,05).
(A) LNCaP, DU-145 e as células PC-3 foram tratou-se com 10 uM Ki16425, um antagonista de LPA
1 e LPA
3, seguido por 5 LPA uM durante 2 h (L5: 5 uM LPA). os níveis de ARNm de VEGF-C relativas foram medidas. (B) As células PC-3 foram transfectadas transitoriamente com LPA
1 e LPA
3 siRNA. (C) A expressão basal de ARNm de VEGF-C de células PC-3 transfectadas com LPA
1 ou LPA
3 siARN foi medida num FBS a 10% e nenhum soro de cultura de células condicionado. (D) células PC-3 transfectadas com LPA
1 e LPA
3 siRNA foram tratados com LPA, e ARNm de VEGF-C foi medido. ARNm foi transcrito reverso e analisados por um PCR em tempo real. Os níveis relativos de VEGF-C normalizadas para GAPDH e β-actina estão apresentados. * Estatisticamente diferente em comparação com a amostra incubada veículo tratado com LPA (*
p Art 0,05; **
p Art 0,01; ***
p
0,001)
LPA
1/3-reforçada expressão VEGF-C é ROS Dependente
Depois de identificar que LPA
1 e LPA
3 são. envolvida na expressão de VEGF-C em células de cancro da próstata, que investigou ainda mais as possíveis vias de sinalização a jusante envolvidos. Desde ROS são conhecidos por ser um indutor de VEGF-C [22], [23], a hipótese de que a produção de ROS induzida pelo LPA liga transcrição de VEGF-C em células PC-3. Usando DCFDA como um detector de ROS intracelular, observa-se que o LPA melhorado a produção de ROS em células PC-3, e a resposta pode ser abolido por pré-tratamento com N-acetilcisteína (NAC), um tratamento conhecido para reduzir as concentrações de ROS (Fig. 3a). Além NAC, dois antioxidantes, TEMPOL e Tiron também foram utilizados para confirmar LPA induzida a produção de ROS (Fig. 3B). Além disso, induzida pelo LPA ROS foram bloqueados pelo pré-tratamento com Ki16425 (Fig. 3C), sugerindo que o LPA
1/3 é responsável pela geração de ROS e a produção de ROS não é derivado de oxidação LPA intracelular. Observamos também que induzida pelo LPA VEGF-C foi abolido pelo NAC (Fig. 3D). Os resultados sugeriram que a produção de ROS está envolvido na LPA
1/3-induzida a expressão de VEGF-C.
células PC-3 foram pré-tratados com 2,5 uM DCFDA durante 10 min. Seguido de 10 min de estimulação de LPA, as células foram tratadas com tripsina e analisada por citometria de fluxo. (A), NAC 10 mM, (B) Tirón 1 mM e Tempol 1 mM foram usados para tratar células antes da estimulação de LPA. (C) Ki16425 (10 uM) foi utilizado para bloquear o LPA
1/3 via de sinal antes da estimulação de LPA. (D) As células PC-3 foram tratados com NAC 10 mM, seguido por um anti-oxidante 5 LPA uM durante 2 h (L5: 5 uM LPA). A expressão de ARNm de VEGF-C foi medida relativa. ARNm foi transcrito reverso e analisados por um PCR em tempo real. O nível relativo de VEGF-C normalizadas para GAPDH é mostrada. * Estatisticamente diferente em comparação com a amostra incubada veículo tratado com LPA (*
p Art 0,05)
LPA
1/3 Medeia VEGF-C Expression pela indução. LEDGF
factor de crescimento derivado de epitélio da lente (LEDGF /p75) foi identificada como uma proteína de stress-resposta induzida pela inanição privadas de soro, o stress térmico, e o stress oxidativo [24], [25]. No cancro da próstata, LEDGF foi ainda identificado como um gene de resistência a drogas para atenuar caspase induzida por docetaxel e vias lisossomais [26]. Recentemente, oxidative- e térmica transcrição induzida por stress de VEGF-C foi encontrado para ser mediada por LEDGF no carcinoma pulmonar [22]. Além disso, linfangiogénese regulada por gonadotropina é também mediada através de expressão induzida por LEDGF VEGF-C em cancro do ovário [27]. Assim, a hipótese de que induzida pelo LPA expressão VEGF-C é mediada através da LEDGF. Os nossos resultados demonstraram que o LPA induzida LEDGF ARNm e a expressão de proteína (Fig. 4A, 4B). Além disso, nossos resultados demonstraram que a LPA induzida LEDGF mRNA é transitória e rapidamente diminuiu. Os resultados sugerem fortemente que um mecanismo pós-transcrição pode também estar envolvido na manutenção LPA induzida nível de expressão da proteína LEDGF. Pré-tratamento com Ki16425 e NAC bloqueou completamente os efeitos intensificadores de LPA na expressão LEDGF (Fig. 4C, 4D), sugerindo o envolvimento de LPA
1/3 receptores e ROS. Além disso, LEDGF siARN foi transfectado em células PC-3 para confirmar se está envolvido na LEDGF induzida pelo LPA expressão de VEGF-C (Fig. 4E). Os resultados demonstraram claramente que LEDGF é necessário para o efeito de aumento do LPA sobre a expressão de VEGF-C (Fig. 4F).
células PC-3 foram tratados com LPA e ARNm (A) e (B) os níveis de expressão de proteína de LEDGF foram determinados. LEDGF proteinm foi recolhido após o tratamento LPA 2 h. O pré-tratamento com 10 uM Ki16425 e NAC 10 mM durante 1 h suprimidos os efeitos do LPA (L5: 5 uM LPA) sobre a expressão LEDGF (C e D). LEDGF siARN foi transfectado em células PC-3 (E) e suprimiu os efeitos do LPA sobre a expressão de VEGF-C (F). ARNm foi transcrito reverso e analisados por um PCR em tempo real. Os níveis relativos de LEDGF e VEGF-C normalizadas para GAPDH são mostrados. * Estatisticamente diferente em comparação com as amostras incubadas com veículo tratados com LPA (*
p Art 0,05; **
p Art 0,01; ***
p Art 0,001).
O bloqueio da LPA
1/3 Receptor e Queda da ATX Expressão Reduzir VEGF-C transcrição e secreção por células PC-3
LPA é altamente enriquecidos em soro e plaquetas; no entanto, muitos relatórios demonstraram que o cancro da mama, glioma, e câncer de próstata pode auto-sintetizar LPA e promover a progressão do tumor [28], [29], [30]. ATX é um LPC lysoPLD-hidrólise que gera LPA. LPA secretado pela ATX aumenta a capacidade de invasão e progressão do câncer de mama. Em gliomas, a actividade lysoPLD de ATX também promove a adesão de células de cancro e invasividade. Com base nesses relatórios anteriores, também estavam tentando determinar se as células cancerosas da próstata sintetizados ATX pode auto-regular a expressão VEGF-C. Portanto, as células PC-3 foram cultivadas em meio RPMI-1640-único meio para evitar um efeito de soro. Ao bloquear LPA
1/3 com Ki16425, basal do mRNA de VEGF-C (Fig. 5A) e a secreção (Fig. 5B) em células PC-3 foram significativamente reduzidos. Estes resultados sugerem que o LPA segregado por células PC-3 activada LPA
1/3 e, por conseguinte, regulado a expressão de VEGF-C. Além disso, ATX siRNA e do seu inibidor, S32826 [31] (Fig. 5C, 5D), foram usadas para determinar se ATX está envolvido na regulação de VEGF-C. Os resultados demonstraram que a infra-regulação da expressão do gene ATX e actividades diminuiu o ARNm de VEGF-C (Fig. 5C, 5D) e secreção (Fig. 5E). Os resultados sugerem que o ATX está envolvida na expressão de auto-regulação de VEGF-C em células de cancro da próstata.
Após 16 horas de inanição, células PC-3 foram tratadas com 10? M Ki16425 em RPMI1640 com ácido gordo 0,005% de BSA para 8, 12, 24, e 48 h. Determinou-se o nível relativo (A) e da concentração da secreção de VEGF-C de ARNm de (B) em amostras. Além disso, as células PC-3 foram transfectadas com ATX siRNA por 24 h para derrubar o gene ATX. As células de PC-3 foram cultivadas em meio RPMI-1640 com BSA isento de ácido gordo de 0,005% durante mais 24 h, e o ARN da amostra foi recolhida. Além disso, o inibidor, S32826, também foi utilizado para inactivar a actividade ATX durante 12 h. expressões ATX e ARNm de VEGF-C (C e D) foram medidos. Seguindo o mesmo protocolo, células PC-3 transfectadas com ARNsi e ATX tratados com S32826 foram deixados em jejum e cultivadas em RPMI-1640 com BSA isento de ácido gordo de 0,005% durante 48 h. Foram determinadas as concentrações de secreção de VEGF-C (E) das amostras. ARNm da amostra foi sujeitos a transcrição reversa e analisados por um PCR em tempo real. Níveis relativos de genes normalizado para p-actina estão apresentados. concentrações secreção de VEGF-C foram medidos por um ELISA. * Estatisticamente diferente em comparação com a amostra incubada veículo tratado e transfectadas com Ki16425 e ATX siRNA (*
p Art 0,05; **
p Art 0,01; ***
p
. 0,001)
Ao interromper LPA
1/3 PC-3, meio condicionado (CM) induzida HUVEC linfática marcador Expressão foi bloqueado
para simular o microambiente entre as células de cancro da próstata e células endoteliais, células HUVEC foi utilizado como um modelo para investigar os mecanismos pelos quais as células de cancro da próstata induzir a linfangiogénese. As HUVECs foram tratadas com diluições de PC-3 CM. Os níveis de marcadores linfáticos, incluindo Prox-1 e LYVE-1 de expressão foram regulados positivamente em células HUVEC (Fig. 6A) após o tratamento CM. Para determinar se o VEGF-C segregado por células de cancro da próstata é necessário para estimular marcadores linfáticos, PC-3 de células estavelmente transf ectadas com VEGF-C shRNA foram seleccionados (Fig. 6B). Usando CM de células PC-3 VEGF-C knockdown para tratar HUVECs, expressão do marcador linfática em HUVECs foi significativamente reduzida em relação ao grupo controle de vetores CM (Fig. 6C). Este resultado indica que o VEGF-C é essencial para a expressão do marcador de desencadeamento linfática por células PC-3. Os nossos resultados são consistentes com descobertas anteriores de que o VEGF-C desempenha um papel fundamental na próstata linfangiogénese induzida por cancro. Além disso, nós pré-tratados células PC-3 com Ki16425 antes de recolher o CM (Fig. 6D). Os resultados demonstraram que, ao interromper o LPA
3/1, a capacidade de PC-3 CM para induzir a expressão do marcador linfático foi reduzido em 32% em comparação com o grupo de controlo. No entanto, pré-tratamento das células HUVEC com Ki16425 não afecta a indução da expressão do marcador linfático (Fig. 6D), sugerindo que a capacidade de indução de CM é provavelmente devido ao VEGF-C. Para esclarecer ainda mais os papéis de LPA
1 e LPA
3 em PC-3
, foram coletadas meio condicionado a partir de LPA
1 ou LPA
3 células transitoriamente knockdown para tratar células HUVEC. Em nossos resultados, meios condicionados a partir LPA
1 ou LPA
3 células knockdown tinha capacidade limitada para induzir a expressão do marcador linfática em HUVEC (Fig. 6E).
(A) células PC-3 foram cultivadas em RPMI-único meio de 24 h após 16 h de fome. A 24 h CM foi recolhida e diluída para o tratamento de HUVEC durante 4 h. Após o tratamento, observou-se a expressão do marcador de HUVEC linfático. (B) As células de PC-3 transfectadas de forma estável com o VEGF-C shRNA foram testados para ARNm de VEGF-C e de expressão de secreção. (C) de VEGF-C knockdown PC-3 CM foi utilizado para tratar células HUVEC seguindo o procedimento descrito acima. (D) As células PC-3 foram tratadas com 10? M Ki16425 ao ser cultivadas em meio RPMI-único meio durante 24 h antes de CM foi utilizado para tratar células HUVEC. Ki16425 também foi usado para testar se o LPA existente no PC-3 CM é crucial para a regulação HUVEC marcador linfático. Ki16425 (10 uM) foi pré-tratada durante 1 h antes de PC-3 CM tratamento de HUVEC. (E) a partir de CM células PC-3 transfectadas com LPA
1 ou LPA
3 siARN foi utilizada para tratar as células HUVEC como os procedimentos descritos acima. ARNm da amostra foi sujeitos a transcrição reversa e analisados por um PCR em tempo real. Níveis relativos de genes normalizadas para GAPDH e β-actina estão apresentados. * Estatisticamente diferente em comparação com as amostras e as amostras incubadas com veículo tratados com PC-3 CM (*
p Art 0,05; **
p Art 0,01; ***
p Art . 0.001)
Discussão
neste estudo, nós investigamos os papéis de LPA na regulação da expressão VEGF-C no câncer de próstata. Os nossos resultados demonstram claramente que o LPA induzida a expressão de VEGF-C em diferentes linhas celulares de cancro da próstata. LPA
1 e LPA
3 foram ambos identificados como estando envolvido na via de sinalização induzida pelo LPA de VEGF-C. Para sinais a jusante, induzida pelo LPA produção de ROS e expressão LEDGF foram identificados como participantes na regulação do VEGF-C. Além disso, ATX gene knockdown reduzida basal de expressão de VEGF-C. Isto indica que o LPA e ATX são ambos essenciais para a regulação da expressão de VEGF-C em células de cancro da próstata.
lisofosfolipídios foram sugeridos para promover a progressão do cancro da próstata. LPA induz a migração de células PC3 através do LPA
1, p42, p38 e vias alfa e também promove a invasão de Matrigel [32]. Recentemente, também indicam que CD97 heterodimerizado e funcionalmente em sinergia com LPA
1 implicada na progressão do cancro [33]. Além disso, o LPA induzida sobrevivência do cancro da próstata e invasão foi mostrado para associar a proteólise mediada por calpaina de FAK [34]. Além disso, a expressão de VEGF é activado pelo factor de activação de LPA por meio de indução de hipoxia (HIF) -1α expressão em células PC-3 [35]. No entanto, o papel de LPA na próstata lymphangiogenesis induzida por câncer ainda é pouco compreendido.
VEGF-C é considerado um fator chave linfática em iniciar lymphangiogenesis e metástase linfática em cancros da próstata. Em células LNCaP, o VEGF-C foi identificado como sendo regulada negativamente por androgénio através do receptor do factor de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-IR) e via FOXO [36]. Além disso, com ablação de androgénios, rala estimula a síntese de VEGF-C, aumentando a produção de ROS [23]. Desde a ativação Rala é desencadeada pela LPA
1 em células HEK293 [37], a relação entre a ativação do receptor LPA e os efeitos do andrógeno sobre a regulação do VEGF-C é digno de uma investigação mais aprofundada. Os nossos resultados sugerem que tanto LPA
1 e LPA
3 são responsáveis pela expressão de VEGF-C induzida pelo LPA. Além disso, em LPA
1 e LPA
3 estavelmente knocked-down células PC-3, basal expressão do gene VEGF-C mostrou ter diminuído. Em nosso estudo recentemente publicado, LPA induzida por VEGF-C e linfangiogênese em HUVECs foram também LPA
1 e LPA
3 dependentes [38]. Estes resultados sugerem que a activação de LPA
1 e LPA
3 regula a expressão de VEGF-C em ambos cancro e células endoteliais.
No cancro da próstata, o VEGF-C-regulação foi demonstrado estar associado com a geração de ROS [22], [23]. Os resultados sugerem um papel de ROS na expressão de VEGF-C induzida pelo LPA. Os nossos resultados mostraram que a produção de ROS foi induzida por LPA e participa na transcrição induzida pelo LPA de VEGF-C. Além disso, LEDGF, um factor de transcrição activado por ROS, está envolvida na expressão de VEGF-C induzida pelo LPA. Na pesquisa clínica, a expressão LEDGF foi elevada em 93% das amostras de tumor da próstata clínicos, e atenuou a morte celular induzida por docetaxal [39]. Aqui, mostramos que a expressão LEDGF foi induzida pelo tratamento LPA em um LPA
forma 1/3-dependente. Estes resultados suportam mais LPA sendo um regulador importante na progressão do cancro da próstata.
Os níveis de expressão de ATX, uma enzima LPA produtoras, são mais elevados em células de câncer de próstata andrógeno-independente [40]. Além disso, dados clínicos revelaram que cerca de 50% dos doentes com cancro da próstata mostraram forte expressão de ATX. Além disso, o nível de expressão de ATX foi significativamente correlacionado com o grau de Gleason primário de focos de cancro e a presença de invasão capsular da próstata [17]. Os nossos resultados sugerem que o VEGF-C é regulado por ATX expressão em células PC-3. Portanto, câncer de próstata sintetizar LPA podem formar um loop autócrino para estimular a expressão de VEGF-C e promover ainda mais a progressão do câncer. Com base nestes resultados, um inibidor ATX pode ser um candidato potencial para prevenir metástases induzida por lymphangiogenesis de câncer de próstata.
O meio condicionado recolhido a partir de células cancerosas é amplamente utilizado para simular as interações microambiente locais entre anfitriões e tumores. Utilizando um modelo in vitro de HUVEC, as células cancerosas foram mostradas a interleucina secreta (IL) -1α para estimular a secreção de IL-8 por células endoteliais [41]. Além disso, o meio condicionado da linha celular de cancro do pulmão A549 regula factor de crescimento derivado (PDGF) expressão de plaquetas das células endoteliais que é dependente de VEGF [42]. Todos esses resultados sugerem que células HUVEC é um
in vitro
modelo adequado para investigar os componentes ativos em meio condicionado de culturas de células de câncer. meio condicionado PC-3 induzida por proliferação de células endoteliais linfáticas (LEC), a formação do tubo, e cicatrização de feridas. Além disso, VEGFR-2 também foi identificado sinalização para desempenhar um papel crítico na resposta LECs “ao tratamento com meio de PC-3-ar [43]. Aqui, demonstramos que o VEGF-C é um importante indutor da expressão de marcadores de HUVEC linfáticos em meio de PC-3-condicionado. Os nossos resultados são consistentes com estudos anteriores que as células PC-3 que expressam de forma estável o VEGF-C siARN reduzida linfangiogénese intratumoral [44]. Além disso, a nossa investigação demonstrou ainda que a activação de LPA
1/3 regula PC-3 a expressão de VEGF-C, e meio condicionado de PC-3 foi capaz de induzir a expressão de marcadores de células endoteliais linfáticas.
em resumo, que mostra que o efeito de aumento de LPA e eixo ATX na expressão de VEGF-C em células de cancro da próstata. Portanto, antagonistas do LPA
1/3 e ATX pode ser estratégias terapêuticas viáveis para inibir próstata lymphangiogenesis induzida por câncer e, portanto, evitar mortes relacionadas ao câncer de metástases.
Materiais e Métodos
celular cultura
O PC-3, linhas celulares de cancro da próstata humano DU145, LNCaP e obtidos a partir da ATCC foram cultivadas em RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), penicilina ( 100 U /ml) e estreptomicina (100 U /ml) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2. cordões umbilicais humanos foram gentilmente cedidas pelo (aprovação Institutional Review Board no. 9561709146) National Taiwan University Hospital. As HUVECs foram cultivadas em 1% de gelatina-revestido (Sigma, St. Louis, MO, EUA) placas de 10 cm em 60% M199 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 100 U /ml de penicilina, 100 mg /mL estreptomicina, 20% de FBS, e meio de crescimento endotelial 20% (AGE). As células foram submetidos a um semanal passagem. As células foram sub-cultivados após tripsinização e usadas nas experiências até 4. passagem de PC-3 transfectadas de forma estável com o VEGF-C de pequena hairpin (SH) O ARN foi mantida e amplificadas em meio completo suplementado com puromicina (0,25 ug /ml) durante seis semana antes das experiências foram realizadas.
LPA Estimulação
LPA (Sigma, St. Louis, MO, EUA) foi preparado em clorofórmio e metanol (01:09) e armazenado a -20 ° C. Cem mil células foram cultivadas em placas de 3,5 cm de diâmetro, com meio completo. Após 24 h de implantação, as células PC-3 foram deixados em jejum com livre de soro RPMI-1640 durante 16 h. Depois de fome, o LPA foi adicionada a meio RPMI isento de soro com 0,005% de albumina de ácido gordo livre de soro bovino (BSA) como um transportador. O
1/3 antagonista LPA, Ki16425 (Cayman, Ann Arbor, Michigan, EUA) e o inibidor ATX, S32826 (Echelon, Salt Lake City, UT, EUA) foram ambos dissolvidos em DMSO. A concentração de trabalho para Ki16425 e S32826 foram 10? M e 200 nM.
Análise Western Blot
Após o tratamento, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e lisadas em gelo com tampão RIPA (Tris 50 mM a pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, e 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS)). Os lisados foram centrifugados a 4 ° C e 14.000 rpm durante 15 min, e os sobrenadantes clarificados foram recolhidos. Quantidades iguais de amostras foram separadas por electroforese em gel de 12% SDS-poliacrilamida (PAGE) e, em seguida, transferido para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, bellerica, MA, EUA). Os anticorpos seguintes foram usadas para blotting: anticorpo monoclonal de cabra anti-hVEGF-C (AF752; R D, Minneapolis, MN, EUA), anticorpo policlonal de cabra anti-hLEDGF (SC-33371; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,