Abstract

Este estudo teve como objetivo investigar a atividade anti-tumoral de RY10-4, uma pequena molecular, que foi concebida e sintetizada com base na estrutura de protoapigenone. Um estudo anterior demonstrou que o rastreio RY10-4 possuía efeitos anti-proliferativos contra as células de carcinoma hepatocelular humano HepG2. No entanto, a gama completa de efeitos anti-cancro RY10-4 em tumores do fígado e os mecanismos subjacentes não foram identificados. Nisto, empregando citometria de fluxo, e análise de Western blot, demonstramos que RY10-4 pode induzir a paragem do ciclo celular, as espécies de oxigénio reactivas intracelulares de produção (ROS) e apoptose em células HepG2. No modelo de tumor de xenoenxerto de células HepG2, RY10-4 inibiu significativamente o crescimento de tumores e apoptose induzida em células tumorais, com poucos efeitos secundários. Além disso, RY10-4 causou a supressão da activação da STAT3, que podem estar envolvidos na indução de apoptose. Além disso, RY10-4 inibiu a proliferação de Hep3B e HuH-7 de células de carcinoma hepatocelular humano de um modo dependente da concentração. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que RY10-4 tem um grande potencial para desenvolver-se como agente quimioterápico para câncer de fígado

Citation:. Zhang X, Wang Y, Han S, Xiang H, Peng Y, Wu Y, et ai. (2016) RY10-4 inibe a proliferação de células hepatocelular Human Cancer HepG2 pela indução de apoptose

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151679. doi: 10.1371 /journal.pone.0151679

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 20 de outubro de 2015; Aceito: 02 de março de 2016; Publicação: 14 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 31.270.390, para YYW) e da Fundação de Ciência Natural da Província de Hubei (No. 2015CFC852, para XZ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

de acordo com a mais recente estatística global do câncer, o carcinoma hepatocelular é a terceira maior causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Como um dos principais modalidades de tratamento do cancro, a quimioterapia tem eficácia no prolongamento e melhorando a qualidade de vida para os pacientes [2]. Pesquisa de compostos moleculares pequenos com actividade anti-tumoral tem grandes vantagens para o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos. Alguns compostos moleculares pequenos, como piperlongumine [3] e obtusaquinone [4], segmentação e células cancerosas matando seletivamente, podem ser agentes terapêuticos do cancro promissores.

Utilizando produtos naturais como composto de chumbo é um método útil e viável em desenvolvimento de medicamentos. Com base na estrutura de um produto natural protoapigenone, RY10-4 foi desenhado e sintetizado por Yuan

et ai. no nosso laboratório, e mostrou-se actividades anti-tumorais potentes contra várias linhas celulares de cancro humano [5]. A sua estrutura química foi perto de protoapigenone, enquanto que a sua actividade anti-tumor foi melhorado e os efeitos secundários foram reduzidos. Os mecanismos que medeiam a actividade anti-tumoral de RY10-4 incluído a indução de autofagia ou apoptose em linhas celulares da mama humano ou de cancro do pulmão, respectivamente [6,7]. Em um estudo triagem prévia, RY10-4 mostraram efeitos antiproliferativos notáveis ​​sobre células de câncer hepatocelular humano HepG2

in vitro

, e inibiu o crescimento do tumor do rato hepatocelular H22

in vivo

[5] . No entanto, mais pesquisas são necessárias para compreender plenamente os efeitos anti-tumorais de RY10-4 em câncer de fígado e seu modo de potencial de ação. Aqui, demonstramos que RY10-4induces apoptose em células de câncer de fígado HepG2 tanto

in vitro

e

in vivo

, e, assim, tem capacidade para suprimir tumores hepáticos.

Materiais e métodos

regentes e anticorpos

RY10-4 ( 95%) foi preparado anteriormente no nosso laboratório, como descrito por Yuan et al. [5]. Sulforhodamina B (SRB) foi comprado de J K Científica (Pequim, China). Dimetil sulfóxido (DMSO) e N-acetilcisteína (NAC) foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Hoechst 33342, iodeto de propídio (PI), reactivo kit de ensaio de espécies de oxigénio (DCFH-DA), tampão de lise RIPA, kit de ensaio de proteína BCA, e mais BeyoECL kit de quimioluminescência foram obtidos a partir de Beyotime Inc. (Xangai, China). Anexina kits de detecção de apoptose V-FITC /PI foi comprado de Keygen Biotech (Nanjing, China). Os anticorpos específicos contra a proteína Bcl-2, Bax, p53, a ciclina E, CDK2, caspase3 clivado, actina, STAT3, p-STAT3, p21, GAPDH e anticorpos secundários correspondentes foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA).

linha celular e cultura de células

câncer hepatocelular humano HepG2, Hep3B e linhas celulares HuH-7 foram comprados da China Center for Type Culture Collection, CCTCC). As células foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM, Hyclone), complementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS, Hyclone) e solução de antibiótico (100 ug /ml de estreptomicina e 100 IU /ml de penicilina), numa atmosfera humidificada atmosfera de 5% de CO

2 a 37 ° C.

ensaio SRB

A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de SRB tal como descrito anteriormente [6]. Em resumo, as células HepG2 foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (5000 células por poço), e tratou-se com uma série de concentrações de RY10-4. Após o tratamento, as células foram fixadas com ácido tricloroacético a 10% durante 1 h a 4 ° C, e lavou-se com ácido acético a 1%. As células fixadas foram coradas com 0,4% de SRB durante 15 min, lavou-se quatro vezes e deixado a secar à temperatura ambiente. O corante ligado foi solubilizado com uma solução de Tris-base, e a absorvância a 540 nm foi registada usando um leitor de microplacas (Biotek Instruments, Inc. EUA). Para explorar o papel de ROS na morte celular induzida por RY10-4, as células HepG2 foram pré-tratadas com o sequestrante de ROS NAC (5mM) durante 2 h seguido pelo tratamento com RY10-4 e a viabilidade celular foi medida.

clonogénicas ensaio

células HepG2 em fase exponencial de crescimento foram semeadas em placas de 6 poços (1000 células por poço) e deixadas a aderir. A seguir ao tratamento com diferentes concentrações de RY10-4 durante 24 h, as células foram cultivadas em meio fresco sem drogas até que colónias visíveis formadas. As colónias de células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% e corados com solução a 0,5% de violeta cristal coloração.

análise do ciclo celular

Para a análise do ciclo celular, a distribuição fase do conteúdo de DNA foi determinada utilizando PI coloração. Após tratamento com 0, 0,9, 1,8, e 2.7μM de RY10-4 durante 24 h, as células HepG2 foram colhidas e fixadas em 70% de etanol durante a noite a -20 ° C. Em seguida, as células foram lavadas e coradas com solução de coloração de PI (50 ug /ml de PI e 10 ug /ml de ARNase), durante 30 min no escuro. A distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo utilizando o software Cell-Quest (Becton Dickinson, EUA).

medição da produção de ROS intracelular

DCFH-DA foi utilizado como uma sonda fluorescente para medir intracelular produção de ROS por citometria de fluxo. Resumidamente, as células HepG2 foram semeadas em placas de 6 poços. Após a adesão, as células foram tratadas com concentrações variáveis ​​de RY10-4. Em seguida, o meio foi removido e as células foram incubadas com 10 uM DCFH-DA, durante 20 min no escuro. As células coradas foram recolhidas e analisadas por citometria de fluxo (Becton Dickinson, EUA). Em algumas experiências, as células foram pré-tratadas com o sequestrante de NAC ROS.

detecção de apoptose

células HepG2 foram tratadas com concentrações variáveis ​​de RY10-4 e analisadas quanto a apoptose utilizando um Hoechst 33342 ou coloração Anexina V-FITC /PI. Em resumo, após o tratamento, as células foram coradas com Hoechst 33342 durante 10 min à temperatura ambiente, depois lavadas e observadas sob um microscópio de fluorescência invertido (Nikon Eclipse, Japão). Alternativamente, as células foram recolhidas e coradas com o kit de detecção de anexina V-FITC /PI apoptose de acordo com o protocolo do fabricante; as células apoptóticas foram detectadas por cytomety fluxo (Becton Dickinson, EUA).

Western blot, ensaio

A expressão de proteínas foi determinada por Western blot. Resumidamente, as proteínas totais foram extraídas por lise RIPA tampão contendo 1% phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) e 1% de cocktail. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de PVDF (Bio-Rad). A membrana foi bloqueada por leite desnatado a 5% durante 1 h à temperatura ambiente e incubado com um anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C. A membrana foi em seguida lavada e incubada com um anticorpo secundário correspondente, durante 2 h à temperatura ambiente. O complexo específico de proteína-anticorpo foi visualizada por ECL além de quimiluminescência kit.

modelo de xenoenxerto de camundongos Nude

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional animal Comitê de Ética da Universidade Huazhong da Ciência e Tecnologia, China . Todos os animais experimentais receberam cuidados de acordo com as diretrizes propostas pela Institutional Animal Care e do Comitê Use, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Ratinhos BALB /c nu com quatro a cinco semanas de idade (No. 4304701485) foram adquiridos a partir de Hunan SJA Animal Laboratory Co. Ltd. (Hunan, China). Os ratinhos foram alojados sob condições específicas isentas de agentes patogénicos, com livre acesso a comida para roedores e água a 20-22 ° C com 12 horas de ciclo claro-escuro, e aclimatados durante uma semana antes da experiência. Em seguida, as células HepG2 (2 × 10

6) foram injectadas subcutaneamente em cada ratinho. Quando os volumes dos tumores estabelecidos atingiu 100-200 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos: controlo de solução salina, RY10-4 baixa dose (5 mg /kg), grupo tratado, e doses elevadas de RY10-4 (50 mg /kg) grupo tratado. O peso corporal e o volume tumoral dos animais foram medidas uma vez por semana. Os ratinhos foram observados diariamente para ulceração, inchaço abdominal, emaciação e /ou outros sinais de sofrimento. Quando um rato apresentou o sintoma acima (s) e acredita-se que o rato não iria sobreviver, ele foi sacrificado e a hora da morte foi registrada. O volume do tumor foi calculado pela fórmula: V =

ab

2/2 (

a

,

b Quais são comprimento do tumor e largura, respectivamente). O volume relativo do tumor (RTV) = V

t /V

0, em que V

0 é o volume do tumor medido no momento da primeira administração do fármaco e V

T representa cada medição do tumor depois o tratamento. No ponto final experimental, todos os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical, sob anestesia com éter.

A histopatologia e a análise imuno-histoquímica

Uma parte da amostra de tecido do tumor foi fixada com paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. As secções de tecido (4 mm) foram preparadas e coradas com hematoxilina /eosina (H E) de acordo com o protocolo padrão. A outra parte da amostra foi congelada a -80 ° C, em seguida, congelada-seccionadas em 4 a 10 mm de espessura. As secções foram bloqueadas com BSA a 5% e incubadas com os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem, as secções foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP, seguido pela aplicação de um kit de desenvolvimento de cor DAB (Beyotime Inc., China). As imagens foram capturadas sob um microscópio (Nikon, Japão).

análise estatística

Os dados foram expressos em média ± S.D. a partir de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se ANOVA com pós-teste de Dunnett.

valores P

foram calculados utilizando

t

teste de Student (nível de alfa: 0,05, bicaudal). As diferenças entre os grupos foram consideradas significativas para

P

valores inferiores a 0,05.

Resultados

Os efeitos anti-proliferativa de RY10-4 sobre células HepG2

Quando os resultados do ensaio de SRB são lineares ao longo de um intervalo de números de células, o ensaio pode ser usado para determinar a citotoxicidade induzida pela droga [8]. Como mostrado na Fig 1A, RY10-4 inibiu a proliferação de células HepG2 de um modo dependente da concentração. A concentração inibitória máxima metade (

CI50) o valor de RY10-4 em células HepG2 foi de 1,88 uM. Além disso, o ensaio clonogénico mostraram que o tratamento RY10-4 diminuiu significativamente o número de colónias de células HepG2 em comparação com o grupo de controlo. A formação de colónias de células HepG2 foi quase completamente abolida por RY10-4 na concentração de 3,6 uM (Fig 1B).

células HepG2 (A) foram tratadas com diferentes concentrações (0,312, 0,625, 1,25, 2,5, 5, e 10 uM) de RY10-4; razão de inibição do crescimento celular foi determinada pelo ensaio de SRB, e o

valor de IC50 foi de 1,88 uM. (B) As células HepG2 foram semeadas numa densidade muito baixa, e tratou-se com RY10-4 durante 24 h. Em seguida, as células foram cultivadas em meio fresco sem drogas para formar colónias. Calculou-se a razão de formação de colónias (% do controlo).

RY10-4 induzida paragem do ciclo celular em células HepG2

A distribuição do ciclo celular de células HepG2 após o tratamento RY10-4 foi avaliada através da análise de conteúdo de DNA utilizando a coloração PI. Como mostrado na Fig 2A e 2B, RY10-4 em concentrações de 0,9, 1,8, e 2,7 uM induzido um aumento significativo na percentagem de células em fase S. Também 2,7 mM RY10-4 induziu um aumento notável na fase G2 /M (

P

= 0,0127). A análise Western blot mostrou que a expressão de proteínas relacionadas com o ciclo celular ciclina E e CDC2 em células HepG2 foi diminuída por meio de tratamento RY10-4 (Fig 2C).

(A) células foram tratadas com 0, 0,9, 1,8 , e 2.7μM RY10-4 durante 24 h, e o teor de ADN foi analisado utilizando coloração com iodeto de propídio e citometria de fluxo. (b) Distribuição do ciclo celular, apresentados como média ± DP de três experiências independentes. (C) Após o tratamento com RY10-4, expressão de proteínas relacionadas com o ciclo celular E ciclina e CDK2 foi analisada por Western blot.

RY10-4 induzida produção intracelular ROS em células HepG2

A produção ROS intracelular foi detectada usando oxidação sensível sonda fluorescente DCFH-DA. Como mostrado na Fig 3A, após tratamento com concentrações indicadas de RY10-4, a produção de ROS intracelular foi aumentada drasticamente em células HepG2. Observou-se uma forma dependente da concentração, e pré-tratamento com a NAC (5mM) durante 2 h quase inverteu completamente a produção de ROS induzida RY10-4 em células HepG2 (Figura 3B). Consistentemente, pré-tratamento com NAC também impediu a diminuição de viabilidade celular induzida por RY10-4 (Fig 3C).

(A) As células HepG2 foram tratadas com as concentrações indicadas de RY10-4, e a produção de ROS foi intracelular detectado como descrito em Métodos. (B) Os níveis intracelulares de ERO (% do controlo), apresentados como média ± DP de três experiências independentes. (C) As células HepG2 foram tratadas com RY10-4 na ausência ou na presença de NAC pré-tratamento; a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de SRB.

RY10-4 apoptose induzida em células HepG2

foram realizadas A coloração por fluorescência dos núcleos e anexina V-FITC coloração /PI para detectar apoptose em células HepG2. Figura 4A demonstra que, após tratamento com concentrações indicadas de RY10-4, núcleos condensados ​​e os corpos apoptóticos foram observados nas células HepG2 através de coloração com Hoechst 33342. Anexina V-FITC /PI coloração também mostrou que RY10-4 induziu apoptose numa concentração dependente forma (Fig 4B). Em comparação com o grupo de controlo, da percentagem de células apoptóticas foi significativamente aumentada nos grupos tratados com RY10-4 (Fig 4C). Além disso, a apoptose relacionada com a proteínas p53, Bcl-2, Bax, e clivada da caspase-3 foram analisados ​​por Western blot. Como mostrado na Fig 4D, a expressão de proteína anti-apoptótica de Bcl-2 diminuíram após o tratamento com RY10-4, enquanto que a expressão de p53, Bax e clivada da caspase-3 aumentou de uma forma dependente da concentração. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que RY10-4 pode induzir apoptose em células HepG2.

(A) células foram tratadas com as concentrações indicadas de RY10-4 durante 24 h, e os núcleos foram coradas pela Hoechst 33342. As setas indicam núcleos condensados ​​e fragmentados. (B) ensaio de citometria de fluxo para detectar a apoptose em células HepG2 por meio da coloração /PI Anexina V. fluxo representante citometria perfis são mostrados. (C) A percentagem de células apoptóticas, apresentados como média ± DP de três experiências independentes. (D) Expressão de proteínas relacionadas com a apoptose foi analisada por Western blot em células HepG2 não tratadas ou tratadas com RY10-4.

Actividade

anti-tumor de HepG2 RY10-4 em xenoenxerto de células modelo

O efeito anti-tumoral de RY10-4

in vivo

foi avaliada utilizando um modelo de rato de xenotransplante nu. Todos os ratinhos sobreviveram durante todo o período de experiência, e eles foram sacrificados sob anestesia de éter na extremidade experimental. Como mostrado na Fig 5A, o tratamento com RY10-4 resultou na inibição do crescimento notável de tumores de xenoenxerto de células HepG2, em comparação com o grupo de controlo tratado com solução salina. No final do experimento, o volume do tumor foi 1326 ± 407 mm

3, 530 ± 201 mm

3 e 411 ± 108 mm

3 no grupo controle, de baixa dose grupo de tratamento RY10-4 e -dose elevada grupo de tratamento RY10-4, respectivamente. O volume médio do tumor no grupo de controlo atingiram cerca de sete vezes o volume inicial, enquanto que os tumores nos grupos de tratamento foram aumentadas apenas cerca de duas vezes, em comparação com o volume inicial (Fig 5B). Também foi avaliada a expressão de proteínas relacionadas com a apoptose, Bcl-2 e Bax em amostras de tecido de tumor de cada grupo por imuno-histoquímica e Western blot. Como mostrado na Fig 5C e 5D, em comparação com o grupo de controlo, a expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 diminuiu enquanto a proteína pro-apoptótica Bax aumentada tanto em doses baixas e altas de RY10-4. A coloração de HE também mostraram grandes áreas de morte de células tumorais nos grupos de tratamento (Figura 5E). Estes resultados sugerem que RY10-4 poderia induzir a apoptose tumor hepatocelular

in vivo

. O peso corporal de cada grupo não se alterou significativamente durante toda a experiência (Figura 5F), e tratamento RY10-4 não afectou os índices bioquímicos do sangue dos ratinhos nus portadores de tumor (Tabela S1), o que sugere que RY10-4 tem provavelmente pouco lado efeitos

in vivo

.

(a) tumores de xenoenxerto representativos obtidos a partir de ratos controle e ratos tratados com RY10-4. (B) O volume relativo do tumor (RTV) foi calculada de acordo com a fórmula em Métodos. (C e D) expressão de Bcl-2 e Bax no tecido tumoral foi analisado por coloração de imunofluorescência e Western blot. coloração (E), ele foi realizado para exame anatomopatológico do tecido tumoral em diferentes grupos. (F) Os pesos médios do corpo de ratos em cada grupo foram avaliados.

Os mecanismos moleculares de indução de apoptose por RY10-4 em células HepG2

Desde STAT3 regula a expressão de vários crescimento do tumor relacionada com os genes oncogénicos e desempenha um papel fundamental na proliferação celular [9], foi investigado se RY10-4 pode regular a activação constitutiva de STAT3 nas células HepG2. Como mostrado na Fig 6A, RY10-4 inibiu a fosforilação constitutiva da STAT3 (tirosina 705) em células HepG2. RY10-4-regulado a expressão de p21, que pode ser envolvida a paragem do ciclo celular induzida por RY10-4. Além disso, a IL-6 (10 ng /ml) reverteu inactivação STAT3 induzida por RY10-4, seguido do aumento da expressão de ciclina E em células HepG2 tratadas com RY10-4 (Fig 6B). Além disso, o pré-tratamento com NAC inibiu a ab-rogação da STAT3 e p53 aumento causado por RY10-4 em células HepG2 (Figura 6c).

(A) As células HepG2 foram tratadas com as concentrações indicadas de RY10-4, e a expressão de p-STAT3 e p21 foi analisada por Western blot. (B) As células HepG2 foram tratadas com RY10-4 com ou sem estimulação de IL-6; expressão de p-STAT3 e ciclina E foram analisados ​​por Western blot. (C) As células HepG2 foram tratadas com RY10-4 na ausência ou na presença de NAC pré-tratamento. A expressão de p-STAT3 e p53 foi analisada por Western blot.

Os efeitos anti-proliferativos de RY10-4 sobre outras linhas de células de carcinoma hepatocelular

Para observar o anti-proliferativa efeitos da RY10-4 contra outras linhagens de células cancerígenas do fígado, nós escolhemos linhagens celulares de carcinoma Hep3B e HuH-7 hepatocelular. Como mostrado na Fig 7A, RY10-4 inibiu a proliferação de células Hep3B e HuH-7 de uma maneira dependente da concentração, e células Hep3B foram mais sensíveis. Em seguida, foram detectadas as expressões de proteínas relacionadas à apoptose em células Hep3B tratados RY10-4. Como mostrado na Fig 7B, após o tratamento com RY10-4, a expressão de p53 e Bax aumentada, enquanto que a expressão de Bcl-2 diminuiu.

(A) células Hep3B ou HuH-7 foram tratadas com concentrações série de RY10-4, e razão de inibição do crescimento celular foi determinada pelo ensaio de SRB. células (B) Hep3B foram tratados com RY10-4, e as expressões de relacionados com a apoptose proteínas p53, Bcl-2 e Bax foram analisados ​​por Western blot.

Discussão

A protoapigenone produto natural e vários dos seus derivados têm demonstrado efeitos anti-tumorais potentes contra algumas das linhas celulares de cancro humano [10,11]. Protoapigenone poderia ser considerado como um composto de chumbo útil para descobrir novos agentes quimioterápicos. No nosso laboratório, RY10-4 foi desenhado e sintetizado como um análogo protoapigenone, como uma tentativa de desenvolver um composto anti-tumoral romance. De acordo com algumas pesquisas e relatórios anteriormente [12,13], RY10-4 tinham actividades anti-tumorais potentes contra células de cancro da mama humano. Num outro relatório, RY10-4 poderia induzir a morte celular autophagic em células MCF-7 enquanto protoapigenone não poderia [6]. Além disso, Xue

et al

. relataram que RY10-4 induz apoptose e inibe a invasão de células do cancro do pulmão A549 humanas através da inibição da sinalização STAT3 [7]. Esses estudos indicam que RY10-4 tem um grande potencial como um agente anti-tumoral romance.

No presente estudo, avaliou-se a actividade anti-tumoral de RY10-4 em câncer de fígado. Os resultados mostraram que RY10-4 proliferação efetivamente inibiu de células de câncer de fígado HepG2

in vitro

com o IC

50 valor de 1,88 M. Além disso, o ensaio clonogénico foi realizada para determinar os efeitos a longo prazo de RY10-4 sobre células HepG2. O ensaio clonogênica correlaciona-se bem com o ensaio de tumorigenicidade

in vivo

, e provou valor preditivo no teste de quimio-sensibilidade dos agentes antitumorais [14]. Os nossos resultados indicam uma inibição dependente da concentração na clonogenicidade em células HepG2 tratadas com RY10-4 (Fig 1B), sugerindo que RY10-4 tem um potencial curativo contra o cancro hepatocelular.

Indução da paragem do ciclo celular e apoptose são os mecanismos principais de acção de muitos agentes anti-tumorais. Tem sido relatado que protoapigenone e seus análogos, bem como RY10-4 poderia causar a paragem do ciclo celular e a apoptose em algumas linhas celulares de cancro humano [13,15-17]. Aqui, se analisar a distribuição do ciclo celular e a apoptose de células HepG2 após tratamento com RY10-4. Descobrimos que RY10-4 poderia induzir a paragem do ciclo celular em S e G2 /M fases, que pode ser atribuída à diminuição da regulação das proteínas relacionadas com o ciclo celular ciclina E e CDC2 (Figura 2). Além disso, a Hoechst 33342 e coloração de anexina V-FITC coloração /PI mostrou que RY10-4 também induziu apoptose dependente da concentração, em células HepG2 (Figura 3). P53 é um dos mais importantes supressores de tumor e segmentação proteínas da família da p53 pode ser útil terapeuticamente [18,19]. P53 pode ser estimulado por hipoxia, agentes cancerígenos, estresse oxidativo e outros factores de stress, induzindo a parada do ciclo celular ou apoptose

via

várias vias [20]. Proteínas Bcl-2 da família, incluindo os reguladores de pro- e anti-apoptóticas, também desempenham um papel importante na indução da apoptose e sobrevivência celular [21,22]. Além disso, as proteínas da família da caspase como a caspase-3 são os executores da apoptose e activação de caspases vai iniciar a apoptose [23]. Após o tratamento com RY10-4, a expressão de p53, Bax e caspase-3 clivada aumentada, enquanto que a expressão de Bcl-2 diminuiu em células HepG2 (Figura 3D). Estes resultados indicam que a indução da apoptose pode ser um mecanismo subjacente da actividade anti-tumoral para RY10-4 contra células HepG2 cancro hepatocelular humano.

fortes evidências sugerem que as ROS estão implicados numa variedade de programas celulares e desempenha um papel-chave nos processos fisiológicos e patológicos humanos [24]. As células cancerosas exibem geralmente níveis basais mais elevados de ROS, que tem um estado redox diferente em comparação com as células normais, e níveis elevados de ROS pode frequentemente danificar as células [25,26]. Portanto induzir a produção de ROS em células cancerosas podem ter um impacto terapêutico positivo. Compostos como piperlongumine, obtusaquinone psoralidin e induzir a produção de ROS, assim, inibir a proliferação de células cancerosas humanas [3,4,27]. Neste estudo, foi demonstrado que RY10-4 induzida a produção intracelular de ROS, que pode ser revertida pelo pré-tratamento com NAC em células HepG2. Também a morte celular induzida RY10-4-se parcialmente prevenida por NAC pré-tratamento (Figura 4). Estes resultados sugerem que a produção de ROS pode desempenhar um papel importante na morte de células HepG2 induzida por RY10-4. A relação entre a apoptose induzida por RY10-4 e produção ROS a ser investigados em um estudo de acompanhamento. Numerosas evidências indicam que a STAT3 desempenha um papel central no desenvolvimento e progressão de muitos tumores humanos, e a supressão da activação da STAT3 leva à inibição do crescimento e apoptose em linhagens de células tumorais, bem como modelos de xenoenxerto de ratinho [9,28]. Em nosso estudo, descobrimos que RY10-4 suprimida activação STAT3 em células HepG2, eo efeito foi dependente da geração de ROS (Fig 6). Tomados em conjunto, ROS inactivação dependente de STAT3 pode ser o mecanismo molecular de RY10-4 para a sua actividade anti-tumor do fígado.

De uma maneira geral, apenas a ensaios clínicos, em última instância pode determinar se um novo agente é eficaz para a terapia do cancro em pacientes. No entanto, existem muitas limitações e restrições éticas, médicas e económicas para os ensaios clínicos, portanto, um sistema experimental conveniente é de grande importância para a triagem de drogas anticâncer [29]. O modelo de camundongos xenotransplante nu é normalmente utilizado para avaliar a actividade biológica de agentes anticancerígenos

in vivo

[30,31]. células cancerosas humanas podem crescer como xenoenxertos em um mouse imunodeficientes. Até certo ponto, este modelo é útil para prever a resposta clínica à terapia medicamentosa. Aqui, nós estabelecemos o modelo de xenoenxerto de células HepG2 para avaliar a actividade antitumoral do RY10-4. Descobrimos que RY10-4 apoptose induzida no tumor e inibiu significativamente o seu crescimento

in vivo

(Fig 5). Além disso, RY10-4 provavelmente tem apenas efeitos colaterais menores

in vivo

, uma vez que não influenciaram o peso corporal do animal e índices bioquímicos do sangue.

Em conclusão, este estudo demonstra que RY10-4 pode notavelmente inibir a proliferação de células HepG2 câncer hepatocelular humanos tanto

in vitro

e

in vivo

. A indução de apoptose pode ser o mecanismo subjacente para a sua actividade anti-tumoral. RY10-4 suprimiu o crescimento do tumor do fígado

in vivo

sem significativa hematológicas toxicidade, hepatotoxicidade ou nefrotoxicidade. Além disso, RY10-4 inibiu a proliferação de Hep3B e HuH-7 de células de carcinoma hepatocelular humano de um modo dependente da concentração. Estes resultados sugerem que RY10-4 tem grande potencial como um novo agente quimioterápico para câncer de fígado.

Informações de Apoio

Tabela S1. hemograma completo e perfil bioquímico para a ratinhos nus após tratamento com RY10-4 durante 4 semanas (média ± SD, n = 8)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0151679.s001

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