Abstract

Fundo

A maioria (70%) câncer de ovário epiteliais (EOCs) são diagnosticados tardiamente. biomarcadores não invasivos que facilitam a detecção de doenças e prever o resultado são necessários. Os microRNAs (miRNAs) representam uma nova classe de biomarcadores. Este estudo foi identificar e validar miRNAs plasma como biomarcadores em EOC.

Metodologia /Principais Achados

Foram avaliadas amostras de plasma de 360 ​​pacientes EOC e 200 controles saudáveis ​​de duas instituições. Todas as amostras foram agrupadas em triagem, treinamento e validação conjuntos. Nós digitalizados os miRNAs de plasma que circulam pela matriz de baixa densidade TaqMan no conjunto de triagem e identificadas /marcadores de miRNA validados por ensaio de reação em cadeia da polimerase em tempo real no conjunto de treinamento. As análises receiver operating regressão característico e logística estabeleceu o painel de miRNA de diagnóstico, que foram confirmados nos conjuntos de validação. Encontramos maior plasma miR-205 e menor expressão let-7F nos casos do que nos controles. MiR-205 e deixe-7F em conjunto, desde alta precisão de diagnóstico para EOC, especialmente em pacientes com doença em estádio I. A combinação destes dois miARNs e antígeno-125 (CA-125) melhorou a precisão da detecção. expressão miR-483-5p foi elevada nas etapas III e IV, em comparação com as fases I e II, que foi consistente com o seu padrão de expressão nos tecidos tumorais. Além disso, níveis mais baixos de deixá-7F foram preditivos de mau prognóstico em pacientes EOC.

Conclusões /Significado

Nossas descobertas indicam que o plasma miR-205 e deixe-7F são biomarcadores para a detecção do câncer de ovário que o complemento CA-125; deixe-7F podem ser preditivos de prognóstico do câncer de ovário

Citation:. Zheng H, Zhang L, Zhao Y, Yang D, Song F, Wen Y, et al. (2013) Plasma miRNAs como diagnósticos e prognósticos biomarcadores de câncer de ovário. PLoS ONE 8 (11): e77853. doi: 10.1371 /journal.pone.0077853

editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |

Recebido: 21 de junho de 2013; Aceito: 02 de setembro de 2013; Publicação: 01 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado parcialmente pelo National Science Foundation Natural da China (Grants 81.072.363), o programa de Changjiang Estudiosos e Equipe Pesquisa inovativa na Universidade na China (Grant IRT1076), o National Key Científico e Projecto Tecnológico (Grant 2011ZX09307-001-04) , e da Ciência e Tecnologia Fundação do Comité Tianjin (Grant 09ZCZDSF04700). O banco de tecidos é uma parceria entre o Tianjin Centro e da Fundação Nacional para a Pesquisa do Câncer. D. Y. é um Fellow Odyssey no MD Anderson Cancer Center, e apoiada pela Diane Denson Tobola Fellowship em Ovarian Cancer Research comunhão e The Harold C. e Maria L. Endowment Fund Daily. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a quinta maior causa de morte por câncer em mulheres em todo o mundo, e câncer epitelial de ovário (EOC) é a neoplasia ginecológica mais letal [1]. Porque EOC é geralmente testes de triagem assintomáticos e alguns estão disponíveis, quase 70% das mulheres apresentam em estágio avançado (estágio III ou IV) da doença, com taxas de sobrevida em 5 anos de menos de 30% [2]. Em contraste, os pacientes que são diagnosticados com doença em estádio I têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de até 90%, e os pacientes com doença em estágio II têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de até 70% [3]. Portanto, a detecção precoce do EOC pode melhorar significativamente os resultados clínicos. Sensíveis biomarcadores, não-invasivo que podem facilitar a detecção de doenças e estadiamento e prever os resultados terapêuticos são necessários para melhorar as taxas de sobrevivência e determinar tratamentos ideais.

Carboidratos antígeno-125 (CA-125) é o biomarcador mais utilizado para detecção do cancro do ovário [4], mas ela só é elevada em cerca de 50% de i EOCs fase e 70% -90% dos casos avançados [5]. Deste modo, existe uma necessidade crucial para novos biomarcadores que são mais sensíveis e específicos para a detecção de EOC quando utilizado isoladamente ou em combinação com o CA-125. Recentemente, microRNAs (miRNAs), uma família de pequenos RNAs regulatórios, surgiram como possíveis marcadores de plasma para doenças humanas, incluindo câncer, devido à sua relativa estabilidade na circulação [6].

Os miRNAs são pequenos, não Os ARN que codificam proteínas que regulam pós-transcricionalmente a expressão do gene através da supressão de mRNAs alvo específicas [7], [8]. miARNs circulantes específicos têm sido associadas a diferentes tipos de tumor, incluindo cancro do pulmão [9], [10], o cancro do cólon [11], [12], o cancro da próstata [13], do cancro do ovário [14], [15], e pancreática cancro [16], [17]. Taylor

et ai.

[14] compararam os perfis de miARN de exossomas derivadas de tumores que tinham sido isolados a partir do soro de pacientes com cancro do ovário com aqueles a partir de tecidos tumorais combinadas dos mesmos pacientes. No entanto, esses estudos foram limitados por ter pequenas amostras e avaliar alguns fatores clínicos. O objectivo deste estudo foi identificar e validar miARNs circula no plasma humano para utilização como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico no cancro do ovário. Buscou-se comparar estes miRNAs plasma identifid com CA-125, especialmente para aumentar a sensibilidade de detecção EOC em pacientes com níveis séricos de CA-125 normais.

Materiais e Métodos

Desenho do estudo e população

Nós projetamos um multi-estágio, estudo caso-controle retrospectivo, aninhada para determinar se os perfis de miRNA soro pode ser utilizado para prever o desenvolvimento EOC. Todas as amostras foram agrupadas em triagem, treinamento e conjuntos de validação (Fig. 1). Um total de 560 amostras de plasma (360 casos e 200 controles) foram obtidos a partir Instituto Tianjin University Medical Câncer e Hospital (TCIH) e Centro de Câncer da Universidade Médica de Nanjing entre julho de 2007 e junho de 2010. Os casos e controles foram bem pareados por idade entre da formação e validação conjuntos. Todos os pacientes EOC foram histologicamente diagnosticado com câncer de ovário primário. Todos os pacientes recrutados para este estudo não tinham recebido quimioterapia ou radioterapia antes de o sangue empates. E todas as amostras de sangue foram obtidas antes da cirurgia. A Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia sistema de estadiamento (FIGO) foi usado para encenar casos. Todos os pacientes e controles eram geneticamente não relacionados mulheres chinesas, étnico Han que eram residentes permanentes da área urbana de Tianjin e Nanjing. Controles com cardiovascular, respiratório, digestivo, urinário, reprodutor e doenças endócrinas foram excluídos

Nós separou as amostras em três conjuntos:. Triagem, treinamento e validação. O conjunto de validação incluiu duas fases para validar o melhor painel.

Os protocolos de estudo foram aprovados pelos comitês de Tianjin e Nanjing Center. Foi obtido consentimento informado, e todos os participantes foram entrevistados pessoalmente por entrevistadores treinados através de um questionário pré-testado para obter informações sobre dados demográficos, história menstrual e reprodutiva, estilo de vida, a exposição ambiental e histórico familiar de câncer. Depois da entrevista, uma amostra de sangue venoso de 5 ml foi recolhido. Entre estes casos, as amostras de tecido de tumor de ovário 44 correspondentes foram obtidos a partir do centro Tianjin para este estudo. EOC amostras de tecido tumoral e tecido RNA foram obtidos do Banco de Tecidos Facility do TCIH, que recolhe todos os tecidos de tumores sólidos de pacientes cirúrgicos, quando possível.

CA-125 níveis de amostras de plasma foram adquiridos a partir de registros médicos eletrônicos de os dois centros. dados de acompanhamento dos pacientes foram adquiridas, e duração de sobrevivência foi calculado a partir da data do diagnóstico até a data da morte ou do último acompanhamento em março de 2012.

Triagem Set Online

Para detectar generalizável assinaturas de miRNA, nós reunidas amostras de soro de 10 casos em estágio inicial (fase I), 10 casos em estágio avançado (estágio IIIc-IV), e 10 controles saudáveis, respectivamente, e analisados ​​destas três amostras piscina usando uma matriz de baixa densidade TaqMan (TLDA definir 2.0, Applied Biosystems) peneiramento de cavacos em fase de instrução. O TLDA versão 2.0 (Sanger miRBase V14 humano) incluiu 667 miARNs humanos. dados de microarranjos foram depositados no Centro Nacional de Biotecnologia Informação de Gene Expression (do NCBI) Omnibus (NCBIGEO GSE50472).

Formação Set

Os miRNAs identificados no rastreio definido foram validados utilizando transcription- reversa quantitativa polimerase reação em cadeia (qRT-PCR) em amostras de plasma individuais de 76 pacientes EOC e 30 controles normais.

validação ajustado

O conjunto de validação composto por um processo de duas fases. associações promissores da seleção e treinamento conjunto foram avaliados na fase de validação eu definir, compreendendo 134 casos e 70 controles de Tianjin Center. Um receptor operando análise da avaliação de risco característica baseada em curva (ROC) foi então realizada para determinar o efeito de discriminação dos miRNAs plasma candidato. A validação de fase II set incluiu amostras de 77 casos EOC e 50 controles normais eram de Tianjin Centro e 73 casos EOC e 50 controles normais eram de Nanjing Center.

RNA Isolation

O sangue foi coletado em tubos de EDTA (BD Biosciences) e processados ​​para isolar plasma. O sangue foi centrifugado a 1200 g à temperatura ambiente durante 10 minutos, e o plasma sobrenadante foi transferido para um novo tubo e armazenado a -80 ° C.

O ARN foi isolado a partir das amostras de plasma de dadores saudáveis ​​e de doentes com cancro do ovário . Em resumo, a 250 ul de plasma foi descongelada em gelo e centrifugados a 14.000 g, a 4 ° C durante 10 minutos para remover os linfócitos. Em seguida lisadas 200 mL de sobrenadante com uma quantidade igual de QIAzol reagente de lise (Qiagen, Xangai, China). Para pools de plasma usados ​​para selecionar candidatos biomarcadores do cancro do ovário humanos, criamos a amostra piscina através da combinação de 110 ul de cada uma das 10 amostras. A piscina foi misturada por inversão e centrifugados a 14000 g durante 10 min; 1 ml de sobrenadante foi transferido para um novo tubo para o isolamento de ARN. Para a normalização, 5 ul de 25 fmol sintético

Caenorhabditis elegans

miARN CEL-miR-39 foi adicionado a cada amostra desnaturado. ARN pequeno foi isolado utilizando miRNeasy Mini (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante, excepto que o RNA foi eluída em 30 ul de água isenta de nuclease pré-aquecida. Para isolar o ARN total a partir de tecidos tumorais do ovário, as amostras congeladas foram homogeneizadas em primeiro reagente TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA) utilizando um Homogeneizador Omni-Mixer (Omni International, Kennesaw, GA). O ARN total foi isolado usando o método padrão TRIZOL (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade do RNA total foi verificada com um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

Mirna Profiling

expressão miRNA da amostra da piscina foi perfilado usando TLDA. Em resumo, o ARN foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de transcrição reversa TaqMan miARN, e os ensaios de TaqMan miARN multiplex RT, Piscina humana enunciadas. Uma quantidade de 9,16 ml de solução de ARN foi transcrito de plasma em 15 uL de mistura de RT. Os tubos foram incubados a 16 ° C durante 30 minutos, seguido por 42 ° C durante 30 minutos e 85 ° C durante 5 minutos. O kit de Mistura de PCR TaqMan PreAmp (Applied Biosystems) destina-se a aumentar a quantidade de ADNc disponíveis para análise antes de utilizar o TLDA. A mistura de reacção 25 mL consistia em 2,5 l de cDNA diluído combinados com 12,5 ul de TaqMan PreAmp master mix, 2,5 l de iniciadores Megaplex pré-amplificador, e 7,5 mL de água livre de nuclease. O passo de pré-amplificação foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. O produto foi diluída por adição de 75 ul de água isenta de nuclease e 9 ul da mistura diluída foi combinado com 450 ul de TaqMan Universal PCR Master Mix e 441 ul de água isenta de nuclease. Depois de carregar 100 ul de cada mistura de piscina em multiplex, a matriz (TaqMan MicroRNA humano matriz Definir v2.0) foi centrifugado e selado. A amplificação foi realizada num Applied Biosystems 7900 HT termociclador (Applied Biosystems) utilizando as condições dos ciclos recomendados pelo fabricante. Os dados foram analisados ​​usando RQ Manager Software versão 1.2 e 7900 Sequence Detection System 2.4 (Applied Biosystems).

Mirna Quantificação por em tempo real qRT-PCR

Para determinar os níveis de miRNA em amostras de plasma, nós utilizado o sistema ABI Mirt-PCR, com as seguintes condições: 2,5 ul de pequenos RNAs enriquecidas a partir de amostras de plasma ou 10 ng de ARN total de amostras de tecido foram reversamente transcrito usando o kit de transcrição reversa TaqMan miARN (Applied Biosystems) em 7,5 ul de reacção tampão com os iniciadores específicos para o alvo. Os tubos foram incubados a 16 ° C durante 30 minutos, seguido por 42 ° C durante 30 minutos e 85 ° C durante 5 minutos. Após o condicionamento, uma diluição de 1:20 foi utilizado como molde para a fase de PCR utilizando TaqMan Universal PCR 2 × Master Mix (Applied Biosystems) num ABI Prism 7900. Medimos poços em triplicado, utilizando um volume de reacção final de 15 ul e a sequência condições de ciclo: 10 minutos a 95 ° C, seguido de 50 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. O 7900 Sequence Detection System defaults 2.4 de software foram usadas para calcular a variação relativa na expressão pela 2

-ΔΔCt método com 95% de confiança.

Análise Estatística

Os níveis relativos de miRNA foram quantificados usando o

-ΔΔCt método 2, e os dados foram analisados ​​como o log

10 da quantidade relativa do alvo miRNA. A significância estatística foi determinada usando o Wilcoxon signed-rank ou

t

-test entre pacientes e controles. As curvas ROC foram gerados para avaliar a precisão do diagnóstico de cada candidato miARN, e a sensibilidade e a especificidade do ponto de corte óptima foram definidos como aqueles valores que maximizada a área sob a curva ROC (AUC). Um modelo de regressão logística foi utilizada para selecionar marcadores de miRNA de diagnóstico com base no conjunto de dados de treinamento. A correlação entre a sobrevivência (sobrevivência global [OS] e sobrevivência livre de progressão [PFS]) e miRNAs plasma foi analisada pelo método de Kaplan-Meier e teste log-rank. A análise de regressão de riscos proporcionais de Cox foi utilizada para determinar se plasma miRNA foi um fator prognóstico independente para EOC.

Foram utilizados os pacotes de software estatístico SAS versão 9.0 (SAS Institute, Cary, NC) e MedCalc (Mariakerke, Bélgica ). Os gráficos foram gerados com o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e uma

P valor

de . 0,05 foi considerado significativo

Resultados

características do paciente

Foram coletadas 560 amostras de plasma (360 casos e 200 controles) e dados clínicos e demográficos associados para este estudo; os casos incluídos 179 tumores serosos (49,7%), tumores 86 endometrióides (23,9%), 33 tumores mucinosos (9,2%), 15 tumores de células claras (4,2%), e 47 adenocarcinomas, sem outra especificação (NOS) (13,0%) . características dos participantes são apresentados na Tabela 1 e Tabela S1. As distribuições da maioria dos fatores de risco foram geralmente similares entre pacientes e controles (Tabela S1). Em pacientes, não houve diferença significativa na distribuição dos estágios Figo, grau histológico, ou CA-125 níveis entre os grupos de formação e validação (Tabela 1).

Mirna Screening

Usando o chip TLDA, nós analisamos 667 miRNAs humanos para encontrar os níveis significativamente diferentes de expressão miRNA entre casos e controles. À tela com eficiência várias miRNA candidatos biomarcadores, primeiro gerou três piscinas de alíquotas de plasma que foram derivadas de pacientes EOC em estágio final precoce e e controles saudáveis. Comparado com o pool de controle, houve 43 e 50 miRNAs que foram diferencialmente expressos na piscina fase inicial e em caso de fase final, respectivamente. Entre estes miARNs significativas, havia 30 miARNs cruzado. Foram identificados trinta miRNAs plasma diferencialmente expressos entre os pacientes EOC e controles saudáveis ​​(Fig. 2A e Tabela S2).

(A) A TLDA rastreio revelou 30 significativas mudanças miRNA plasma entre casos e controles. (B) no conjunto de treinamento, foram detectados 30 miRNAs significativos utilizando qRT-PCR e descobriu que 11 miRNAs candidatos foram diferencialmente expressos pela trama vulcão. O -log

10 do

valores P

(eixo Y) é plotado contra o log

2 da mudança vezes entre casos e controles (eixo X). Cada símbolo é codificada por cores de acordo com a expressão significativo da sonda entre os dois grupos. As linhas pontilhadas delinear os pontos de corte para significativamente subregulado (esquerda) ou regulada (à direita) miRNAs em casos. Um mapa de calor dos 11 miRNAs significativas é mostrado à direita. (C, D) Na fase de validação I, só o miR-205 (C, esquerda) e deixou-7F (D, esquerda) apresentaram níveis diferentes. Uma análise ROC indicou que as AUC de miR-205 e deixe-7F para diferenciar casos e controles foram 0,609 (IC 95%: 0,538-0,677) e 0.780 (95% CI: 0,717-0,835)., Respectivamente

os níveis plasmáticos miRNAs de pacientes versus controles no conjunto de treinamento

no conjunto de treinamento, usamos qRT-PCR para detectar os acima mencionados 30 miRNAs significativas em um estudo de caso-controle que incluiu 76 casos EOC e 30 controles saudáveis. Nove miRNAs (MIR-205, miR-200a, miR-184, miR-34a *, miR-141, miR-483-5p, miR-193b *, deixe-7e *, e miR-363 *) foram detectados em maior níveis nos casos do que nos controles, enquanto que miR-98 e deixe-7F foram detectados em níveis inferiores (ilustrado por uma trama vulcão e mapa de calor, Fig. 2B).

os níveis plasmáticos miRNAs de pacientes versus controles no validação fase I set Online

na fase de validação eu definir, os perfis de 11 miRNAs candidatos expressão também foi avaliada utilizando o método qRT-PCR em 134 casos EOC e 70 controles. MiR-205 e deixe-7F teve diferentes níveis de expressão entre casos e controles. Comparado com nos controles, plasma miR-205 níveis foram significativamente maiores (

P

= 0,012) os níveis (Fig. 2C, painel esquerdo) e deixe-7F eram significativamente mais baixos (

P

= 1,97 × 10

-10) em pacientes EOC (Fig. 2D, painel esquerdo).

Uma análise ROC foi utilizada para avaliar a sensibilidade e especificidade dos marcadores de miARN de plasma dois candidatos. A AUC do miR-205 e deixou-7f foram de 0,609 (95% CI, ,538-,677; sensibilidade = 30,1%, especificidade = 94,2%) (Figura 2C, painel da direita.) E 0,780 (IC 95%, 0,717-0,835; sensibilidade = 66,9%, especificidade = 84,2%), respectivamente (Fig. 2D, painel da direita).

Combinação de miR-205 e deixe-7F para EOC Diagnóstico

Um modelo de regressão logística foi utilizado para estimar a potência conjunta de miR-205 e deixe-7F em predizer o risco de EOC em fase de validação eu definir. MiR-205 e deixe-7F foram eficazes em discriminar casos de controles [Fig. S1A; logit (P = EOC) = -0.610-3.075 × deixá-7F + 1.532 × miR-205 foi usado para construir a curva ROC]. A AUC do painel de miARN (let-7f e miR-205) foi 0,831 (Cl 95%, 0,772-0,880; sensibilidade = 62,4%, especificidade = 92,9%) (Fig. 3A), o que foi significativamente mais elevado do que as AUCs de miR-205 (

P Art 0,001). e deixe-7F (

P

= 0,008) sozinho (Fig. S1B)

Nós estabelecemos o miR-205 e deixe-7F painel na fase de validação I e confirmado em amostras independentes na fase II. Na fase I, (A), a AUC foi de 0,831 (IC de 95%, 0,772-0,880; sensibilidade = 62,4%, especificidade = 92,9%) para os casos; (B) 0,895 (IC 95%, 0,822-0,967; sensibilidade = 77,8%, especificidade = 90,0%) para os casos em estágio inicial versus controle; e (C) 0,814 (IC de 95%, 0,700-0,929; sensibilidade = 68,4%, especificidade = 92,9%) por baixo do CA-125 ( 35 U /ml) em comparação com controlos casos. Na fase II, (D) a AUC foi de 0,813 (IC 95%, ,759-,860; sensibilidade = 71,3%, especificidade = 82,0%) para os casos em comparação com os controles; (E) (IC 95%, 0,699-0,853; sensibilidade = 70,0%, especificidade = 82,0%) 0,783 para os casos em estágio inicial versus controle; e (F) 0,726 (IC 95%, 0,634-0,805; sensibilidade = 64,3%, especificidade = 72,0%) para baixo CA-125 ( 35 U /ml). casos em comparação com controles

o painel de dois miRNA também uma distinção entre os casos em estágio inicial (fase I) e controles, com uma AUC de 0,895 (IC 95%, 0,822-0,967; sensibilidade = 77,8%, especificidade = 90,0%, Fig 3B.). Na fase de validação I definida, cerca de 89,3% dos pacientes tinham EOC CA-125 elevação, os outros doentes não conseguiu ser detectado por CA-125. A precisão diagnóstica do painel de miRNA foi avaliada de acordo com o nível de CA-125. Na baixa de CA-125 ( 35 U /mL) grupo (n = 14, 10,7% de todos os casos, o quadro 1) na fase de validação I definida, a AUC do painel de miARN foi 0,814 (Cl 95%, 0,700 a 0,929;.. sensibilidade = 68,4%, especificidade = 92,9%, Fig 3C)

Validando o painel de miRNA na Validação Fase II Set Online

o painel de dois miRNA foi ainda avaliado na fase de validação II conjunto de 250 amostras de plasma (150 pacientes EOC e 100 controles saudáveis). A AUC do painel de miARN foi 0,813 (Cl 95%, 0,759-0,860; sensibilidade = 71,3%, especificidade = 82,0%, Figura 3D.) Em toda a fase de validação amostras II. A AUC foi 0,783 (IC 95%, 0,699-0,853;. Sensibilidade = 70,0%, especificidade = 82,0%, Fig 3E) nos casos em estágio inicial (fase I) e controles, respectivamente. A precisão diagnóstica do painel de miRNA foi então avaliada de acordo com o nível de CA-125. Na baixa de CA-125 ( 35 U /mL) grupo (n = 14, 9,3% de casos, Tabela 1) da fase de validação II, a AUC do painel de miARN foi 0,726 (Cl 95%, 0,634-0,805; sensibilidade = 64,3%, especificidade = 72,0%, Fig. 3F).

Os níveis plasmáticos de miRNA e Sobrevivência

Para determinar ainda se deixe-7F plasma e os níveis de miR-205 são preditivos de prognóstico, realizamos uma análise de sistema operacional e PFS em todos os pacientes a partir dos conjuntos de treinamento e validação. Uma análise de curvas de sobrevida de Kaplan-Meier não revelou uma associação entre let-7F ou níveis de miR-205 e OS (Fig. S2). No entanto, plasma menor expressão let-7F foi significativamente correlacionada com a má PFS em todos os pacientes (

P

= 0,006, teste log-rank) (Fig. 4A), especialmente em estágio III e IV casos (

P

= 0,002, teste de log-rank). A análise de regressão multivariada de Cox demonstrou que o plasma deixá-7F foi um indicador de prognóstico significativo de EOC em PFS (HR = 2,07, 95% CI = 1,27-3,37) (Tabela 2).

(A) A PFS análise para todos os pacientes (n = 360) revelou que baixos níveis plasmáticos de deixá-7F foram associados com pior prognóstico (

P

= 0,006). curvas de sobrevida de Kaplan-Meier específica de estágio revelou que os

valores P

do teste log-rank foram 0,576 e 0,002 para as fases I e II (B) e III e IV (C), respectivamente. Os dados de sobrevivência foram comparadas pelo teste de log-rank, e deixe-7F níveis de expressão em pacientes foram definidos como alto ou baixo em relação à média. NP, sem progressão; P, progressão.

Mirna Expressão em EOC Tissue

Nós determinamos se a expressão dos miRNAs no plasma em diferentes estágios foi correlacionada com que em combinar tecidos tumorais. Foram examinados 11 miRNAs significativas (miR-205, miR-200a, miR-184, miR-34a *, miR-141, miR-483-5p, miR-193b *, deixe-7e *, miR-363 *, miR- 98 e deixe-7F) do conjunto de treinamento em amostras de tecido de tumor correspondentes. A análise comparativa revelou que a expressão tumoral de miR-483-5p, mas não deixe-7F, foi fortemente correlacionada com a expressão de plasma (r = 0,541,

P

= 1,52 × 10

-4) (Fig. S3A). Nós também descobrimos que miR-483-5p foi expresso em níveis mais elevados no estágio III e IV tecidos tumorais do que nos estágios I e II (

P

= 0,048) (Fig. S3B), consistente com os níveis no plasma (

P

= 0,043) (Fig. S3C). MiR-483-5p foi expresso a níveis mais elevados no plasma em estágios avançados (fase III e IV) do que na fase inicial (fase I e II) (Fig. S3C). Não há outros níveis de miRNA no plasma foram correlacionados com os níveis em tecidos tumorais.

Discussão

contas EOC para neoplasias mais ovarianos. Desde a descoberta do CA-125, em 1981, numerosos estudos têm documentado o seu papel como uma ferramenta de diagnóstico e recorrência em pacientes EOC [18], [19]. Aproximadamente 80% dos pacientes têm EOC CA-125 elevação. CA-125 é útil para monitorizar a doença, avaliação da resposta terapêutica, e a detecção de recaída [20], [21]. No entanto, ele executa mal em detectar as fases iniciais do desenvolvimento do cancro do ovário [22]. Novos marcadores de diagnóstico de câncer de ovário são necessários para a seleção. Actualmente, vários miARNs circulantes foram definidos para a utilização em diferentes tipos de cancro [13], [23], [24], [25]. Neste estudo, verificou-se que deixe-7F e miR-205 são altamente promissoras como biomarcadores de diagnóstico e progressistas na EOC.

Usando um processo de validação rigorosa e um modelo de regressão logística, foi demonstrado que o deixe-7f- painel de miR-205 miRNA teve alta precisão no diagnóstico EOC, especialmente em pacientes com doença em estádio I. Importante, este painel pode ser usado em baixo-CA-125 para identificar pacientes em fase inicial EOC.

A família deixou-7 /miR-98 foi um dos primeiros miARNs mamíferos a serem identificados [26]. Deixe-7 foi observado originalmente no nematóide

C. elegans

[27], e os níveis de muitos membros let-7-expressão família foram encontrados para ser reduzida em vários cancros [28], [29], [30], [31], [32]. Deixe-7f está envolvido em processos fisiológicos e patológicos, incluindo a carcinogénese [33]. Estudos anteriores demonstraram que ele age como um supressor tumoral em muitos tipos de câncer, incluindo o carcinoma de células renais [34], o câncer de tireóide papilar [35], e câncer gástrico [36]. O let-7 família miARN é selectivamente segregada para o meio extracelular através de exossomas, o que pode ser importante na vigilância do cancro. Uma diminuição na let-7 no meio extracelular, tal como no plasma, pode, assim, criar um ambiente ideal para Câncer e metástases. Em nosso estudo, descobrimos que plasma deixá-7F pode ser usado como uma detecção EOC e biomarcador prognóstico. Comparados com os controles saudáveis, os pacientes com cancro do ovário têm níveis mais baixos de plasma deixá-7F. Em pacientes EOC, estes níveis mais baixos, também são indicadores de mau prognóstico.

miR-205 é um miARN altamente conservada entre espécies diferentes, incluindo seres humanos. A família miR-200 (miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 e miR-429) e miR-205 são frequentemente reprimidos em câncer avançado [37]. Estudos têm demonstrado que, visando os repressores transcricionais de E-caderina, e ZEB1 ZEB2, a família de miR-200 está envolvida na epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) e invasão tumoral [38]. O aumento da expressão de miR-205, também tem sido observada em adenocarcinoma do endométrio [39], da cabeça e do pescoço linhas de células de carcinoma de células escamosas [40], carcinoma do pulmão de células escamosas [41], e cancro do ovário [37]. Por contraste, a expressão reduzida de miR-205 foi avaliado no melanoma [42] e os cancros do esófago [43], rim [44], da bexiga [45], [46], da mama [47], e da próstata [48] . MiR-205 pode funcionar como um gene supressor de tumores ou oncogenes, dependendo do contexto celular. Em nosso estudo, plasma miR-205 foi expressa em níveis mais elevados em pacientes EOC do que nos controles saudáveis. No entanto, não houve diferença na expressão de miR-205 entre os tecidos de tumor EOC e tecidos saudáveis ​​adjacentes.

A perda de deixá-7 em cancro resulta em embriogénese reversa e desdiferenciação [49], e miR-205 tem sido identificado como um potente regulador da EMT [50]. Descobertas recentes têm ligado let-7 com a manutenção de células-tronco e sugerir uma ligação entre EMT e haste formação de células. A transformação de uma célula epitelial com uma célula mesenquimatosa desempenha um papel chave em ambos o desenvolvimento embrionário e invasão do cancro e metástases. Células submetidos a EMT perder suas características morfológicas epiteliais, reorganizar a sua citoesqueleto, e adquirir um fenótipo móveis através do para cima e para baixo-regulação de várias moléculas, incluindo proteínas de junção tight e aderentes e marcadores mesenquimais. Em EMT câncer de ovário, deixe-7F e miR-205 participar no processo de EMT, regulando os seus genes-alvo [49]. Os níveis circulantes de deixar-7f e miR-205 pode ser um reflexo do processo EMT; Assim, é importante para investigar o seu papel na regulação do ambiente extracelular.

Muitos estudos têm demonstrado que circula miARNs em amostras de sangue são originários a partir de tecidos tumorais [14], focos inflamatórios [51], dano de células endoteliais [52 ], e as células mononucleares de sangue periférico normais e plaquetas [53]. Neste estudo, analisou-se os tecidos de cancro do ovário e descobriram que a expressão de miR-483-5p foi correlacionada com os níveis de plasma. Este resultado sugere que os exossomas derivadas de tumor pode explicar uma pequena parte da origem de plasma miARN. Além disso, a maior expressão de miR-483-5p foi encontrado em EOC avançado do que no início de EOC, tanto no tecido tumoral e plasma. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para descobrir que miR-483-5p pode estar relacionada com a progressão do câncer de ovário. Recentemente, soro de miR-483-5p foi identificado como um biomarcador potencial para detectar o carcinoma hepatocelular [54].

Em resumo, identificou-se o plasma deixou-7f e miR-205 como potenciais marcadores para o diagnóstico do cancro do ovário, especialmente para a detecção precoce do EOC. Deixe-7f também pode ser um marcador de prognóstico de cancro do ovário. miARNs circulantes foram encontrados para ser biomarcadores estáveis, específicos e sensíveis. Com base nos nossos dados, propomos que miARNs específicos que estão associados com exossomas circulantes são marcadores precoces de cancro do ovário e pode ser usado para determinar o estágio, prognóstico, e resposta a terapia.

Informações de Apoio Figura

S1. desempenho

diagnóstico de miRNAs. (A) Os miRNAs foram construídas utilizando um modelo de regressão logística. (B) Os resultados de uma análise ROC indicou que o miR-205 e painel de deixá-7F discriminação entre casos e controles. A AUC-ROC de miR-205, let-7, eo painel de miRNA (miR-205 e deixe-7F) para diferenciar casos e controles foram 0,780, 0,609 e 0,831, respectivamente. O painel teve uma AUC = (IC 95%: 0,772-0,880) 0,831, que foi significativamente melhorada em comparação com os dois miRNAs sozinho (miR-205 [

P Art 0,001] e deixá-7f [

P

= 0,008])

doi: 10.1371 /journal.pone.0077853.s001

(TIF)

Figura S2.

PFS e OS de todos os pacientes por deixá-7F ou nível de miR-205. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier revelou que a baixa expressão let-7F foi associado com PFS (

P

= 0,006, Fig. A), mas não com OS (

P

= 0,589, Fig. B) . Não houve diferenças entre os níveis de miR-205 e PFS (

P

= 0,969, C) ou OS (

P

= 0,576, D). Os dados de sobrevivência foram comparadas pelo teste de log-rank, e deixe-7F ou níveis de expressão de miR-205 foram definidos como alto ou baixo em relação à média. NP, sem progressão;