Abstract
KRAS
estado mutacional é considerada um marcador preditivo negativo da resposta ao terapias anti-EGFR em pacientes com câncer colorretal (CRC). No entanto, existem dados conflitantes sobre a variável resposta à terapia alvo-EGFR. Os efeitos da oncogênico
KRAS
em alvos a jusante foram estudados em linhas de células com diferentes
KRAS
mutações. Células contendo um único
KRAS
G13D
alelo mostrou o perfil mais tumorigénico, com a ativação constitutiva da via a jusante, tornando-EGF-indiferente. Por outro lado,
KRAS
células A146T
mostrou uma EGF-resposta completa em termos de vias de transdução de sinal, proliferação celular, migração ou adesão. Além disso, o acetylome mundial de células CRC também era dependente de
estado mutacional do KRAS
. Vários membros da família RNPhn foram identificados dentro das 36 proteínas-acetilados. estado de acetilação é conhecida por estar envolvida na modulação de EGF-resposta. De acordo com os resultados aqui apresentados, hnRNPA1 e L acetilação foi induzida em resposta ao EGF em células
KRAS
A146T
, enquanto acetil-hnRNPA1 e os níveis de L manteve-se inalterada após o tratamento do fator de crescimento no
KRAS
G13D
células não respondem. Os nossos resultados mostraram que hnRNPs induzida por acetilação é dependente de estado mutacional KRAS. No entanto hnRNPs acetilação pode ser também o ponto onde convergem diferentes vias oncogênicas
Citation:. Roda D, Castillo J, Telechea-Fernández M, Gil A, López-Rodas G, Franco L, et al. (2015) EGF Induzida por acetilação de Heterogêneos Nucleares Ribonucleoproteínas é dependente de
KRAS
mutacional Estado em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 10 (6): e0130543. doi: 10.1371 /journal.pone.0130543
editor: Matias A. Avila, Universidade de Navarra Escola de Medicina e Centro de Investigação Médica Aplicada (CIMA), ESPANHA
Recebido: 01 de abril, 2015; Aceito: 22 de maio de 2015; Publicação: 25 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Roda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por doações do governo espanhol, Ministerio de Economía y Competitividad e subsídios FEDER (FIS PI09 /02480 e PI12 /02767 para AC; FIS PI12 /02.394 para ERGT e FIS PI12 /02110 para GLR) e Generalitat Valenciana (PROMETEO 2013-005 para AC). DR realizada uma bolsa do Ministerio de Ciencia e Innovación (Programa Rio Hortega) e da Sociedad Española Oncologia Médica (SEOM); MTM é um sujeito pré-doutoramento da Generalitat Valenciana (Prometeo) e AG é um beneficiário de bolsa de pós-doutorado da Associação Espanhola Contra o Câncer (AECC, Conselho Provincial de Baleares)
CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declararam que nenhum existem interesses conflitantes.
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é um dos tumores mais prevalentes em todo o mundo [1] e, apesar de muitos avanços na terapia, a sobrevivência a longo prazo para os pacientes com doença metastática é ainda pobre [2]. Os anticorpos contra o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR) tem sido utilizada com sucesso em pacientes de CRC com doença avançada. No entanto, menos de metade dos quais são sensíveis a tal terapia de [3].
KRAS
ou
ARN
mutações são os principais marcadores preditivos negativos para EGFR-resposta [4]. Portanto, o tratamento com anticorpos anti-EGFR é apenas para ser considerados em pacientes com um total
RAS
fenótipo do tipo selvagem [5, 6]. proteínas ras assegurar a transdução de sinal entre os receptores de membrana, tais como EGFR, e intra-citoplasmático de serina /treonina-cinases; contribuindo assim para a regulação de um número de funções celulares essenciais. Mutante RAS torna a proteína numa forma constitutivamente activa, que por sua vez desregula vias de sinalização a jusante [7]. No entanto, vários dados clínicos e experimentais indicam que nem todos
RAS
mutações são iguais em suas propriedades biológicas e, portanto, eles poderiam conferir efeitos variáveis [8, 9]. As mutações KRAS mais frequentes encontrados em pacientes com CCR estão no códon 12 e 13. No entanto, ativando
KRAS
mutações nos códons 61 e 146 foram recentemente associada a sobrevida livre de progressão mais curto em comparação com o tipo selvagem
KRAS
em pacientes tratados com CRC [10]. Além disso, as células de tumor, sob a pressão de inibir as vias de desenvolver oncogénicos mutações espontâneas. De fato, pacientes com CCR metastático experiência de tratamento anti-tumoral em curso
KRAS
alterações genotípicas [11]. Também observamos este efeito em células cultivadas; exclusão de um mutante
KRAS
G13D
alelo em células HCT116 (
KRAS
G13D /WT
) induziu uma espontânea
KRAS
A146T
mutação no restante alelo selvagem. Para descobrir os mecanismos moleculares por trás da resposta diferencial observado em células tumorais com diferentes mutações em
KRAS
parece uma questão importante para o desenvolvimento de novas terapias anti-tumorais e medicina personalizada.
Recentemente, um romance mecanismo dependente da desacetilase foi proposto para explicar a resistência a terapias anti-EGFR mutante em
KRAS
células de adenocarcinoma pulmonar [12]. A acetilação é uma modificação pós-translacional reversível regulada por dois tipos de enzimas: desacetilases de lisina (KDACs) e lisina (acetiltransferases Kats). Na verdade, inibidores de desacetilase têm emergido como agentes anti-tumor potenciais, aumentando hiperacetila�o de ambas as histonas e proteínas nonhistone [13]. Além disso, alguns relatórios descrevem a interação entre inibidores KDAC eo RAS-ERK cascata de sinalização em linhas celulares exibindo estado mutacional diferente em
KRAS
,
BRAF ou PI3KCA
[14-17].
os efeitos a jusante do menos frequente, mas não menos importante
KRAS
A146T
mutação está claro. Neste artigo vamos avaliar o impacto da
KRAS
A146T
mutação
contra KRAS
G13D
em celular proliferação, adesão e migração de linhas celulares derivadas de CRC HCT116. Dada a interação descrita recentemente entre acetila�es e cascatas de sinalização RAS-ERK, também estudaram o efeito do estado mutacional do KRAS no padrão de acetilação de proteínas, a fim de obter insights sobre os possíveis mecanismos moleculares por trás do efeito diferencial da
KRAS
mutações .
material e Métodos
2.1. Materiais
Os anticorpos para hnRNPA1 (ab5832, ab50492), hnRNPA3 (ab50949), hnRNPA
2 /B
1 (ab64800), hnRNPL (ab6106, ab65049) e GAPDH (ab8245) ou β- actina (ab8227) como controlo de carga, foram de Abcam. Os anticorpos contra a acetil-Lys (9441), pAKT (40665) e AKT (9272) foram de Cell Signaling Technology. Outros anticorpos utilizados foram: ERK (SC-93) e pERK (sc-7383) de Santa Cruz Biotechnology; KRAS (05-516) da Millipore e Talin (T3287) a partir de Sigma-Aldrich.
factor de crescimento epidérmico (EGF 20 ng /ml), tricostatina (TSA, 0,5 uM) e butirato de sódio eram da Sigma-Aldrich, UO126 (10 �) da Promega, LY294002 (10 �) a partir de Calbiochem e fibronectina da BD Biosciences.
2.2. Celular cultura
O cancro do cólon linhas de células HCT116 e seus derivados HAE6 e HAF1 foram adquiridos comercialmente a partir da GRCF biorrepositório e Centro Cell, da Universidade Johns Hopkins. Todas as linhas celulares foram cultivadas em 5A de McCoy modificação (Gibco) suplementado com 10% de FBS, penicilina /estreptomicina e L-glutamina e mantidas sob condições padrão.
2,3. Extracção de proteínas e análise de imunotransferência
proteínas totais foram extraídas em tampão RIPA suplementado com inibidores e butirato de sódio. Quantidades iguais de proteínas foram submetidas a electroforese em géis de SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose e imunotrans como descrito noutro local [18]. As manchas foram desenvolvidos por reforçada chemoluminiscence (ECL Detection Kit, GE Healthcare). Os níveis de proteína foram quantificadas por densitometria e normalizado pela β-actina ou GAPDH.
2,4. 2D-electroforese e análise acetylome
extractos de proteína (100 ug) foram separados por electroforese bidimensional (2D), como previamente descrito [18]. imagens proteômicas foram adquiridos com um Typhoon Trio Imager. Em paralelo, 2D-gel foram electro em membranas de nitrocelulose e analisados por Western blot com anticorpo anti-lisina acetilada. proteínas acetilados sobrepostos com os géis SYPRO Rubi-manchados foram excisadas para análise MS. amostras de gel foram processados com uma estação MassPrep (Waters). NanoLC-ESI-MS /MS e análise de dados foram realizados conforme descrito [19] pela Unidade de Proteômica e Bioinformática, (CIMA-Universidade de Navarra, Espanha).
2.5. Imunoprecipitação
500 ug de proteínas foram imunoprecipitadas dia para o outro com anticorpos específicos ou IgG de soro normal (Dako) a 4 ° C de um dispositivo de rotação. complexos proteína-anticorpo foram puxados para baixo com 50% (v /w) Dynabeads (Invitrogen, Life Technologies). Após várias lavagens em PBS, os imunocomplexos foram recuperados por ebulição em LB e depois analisados por Western blot como descrito. 1% dos extratos de proteínas utilizadas para imunoprecipitação foi carregado como entrada.
2.6. Isolamento de ARN e análise de expressão por qPCR
extracção de ARN, a síntese de ADN complementar e qRT-PCR foram realizadas como descrito preciosa. [18]. As sequências dos iniciadores para
hnRNPA1
,
hnRNPA3
,
hnRNPA2 /B1
,
hnRNPL
e
GAPDH
são mostrados em dados suplementares. Pré-desenvolvido iniciadores Taqman para
KRAS
,
ADAM19
,
catepsina C
,
catepsina L
e
18S
eram da Applied Biosystems. a expressão do gene relativa foi expressa como 2
-Δ (ΔCt) Os dados foram normalizados por
18S
quantificação na mesma reacção amostra. Todas as reacções foram realizadas em triplicado.
2,7. a expressão do gene de microarray. A hibridação e análise de dados
O RNA total (5 ug) foi utilizada para obter cRNA biotinilado de acordo com o protocolo do fabricante (Affymetrix). Qualidade do ARNc marcado foi confirmado por hibridação com um chip de teste de Affymetrix (Test3-chip). cRNA etiquetado foi hibridado com uma Genechip Affymetrix Human Gene 1.0ST. dados de microarranjos foram obtidos por software AGCC Affymetrix. Os dados brutos de três repetições para cada linha de células foram analisados por R /Bioconductor utilizando o pacote Limma [20]. F-estatísticas, estatísticas t e log chances de expressão diferencial foram calculados pelo empírica moderação Bayes dos erros padrão para um valor comum. Diferencialmente expressos genes foram identificados por comparação aos pares, (p-valor de corte = 0,05). Somente genes com uma mudança vezes acima de 1,5 e abaixo de -1, foram considerados diferencialmente expressos para análises posteriores e classificados de acordo com a categoria processo biológico seguindo os critérios da ontologia Consórcio Gene [21].
2.8. BrdU proliferação celular ensaio
A proliferação celular foi examinado por um kit bromodeoxiuridina (BrdU) ensaio de incorporação (Calbiochem). Resumidamente, as células foram semeadas a uma densidade de 5×103 células /poço numa placa de cultura de 96 poços. Após jejum de 24 horas, as células foram tratadas com EGF (20 ng /mL) em meio isento de soro. O reagente de BrdU foi adicionado às cavidades, durante 4 h na presença ou na ausência de EGF. Nos pontos de tempo indicados, as células foram fixadas durante 30 minutos em uma solução fixadora /desnaturante. As células foram incubadas com anticorpo anti-BrdU (1: 100) durante 1 h e depois de várias lavagens, incubou-se com IgG conjugado com HRP durante 30 min. substrato de benzidina de tetra-metil foi então adicionada durante 15 min e a reacção foi parada pela adição de 1,25 M de solução de paragem de ácido sulfúrico. Absorbância foi medido em cada poço a dupla comprimentos de onda 450-540nm.
2.9. -Cicatrização de feridas ensaio
As três linhas de células foram cultivadas sob condições padrão. monocamadas confluentes foram riscados com uma ponta de pipeta 10 ul para induzir uma ferida. As bordas feridos foram fotografadas utilizando um microscópio invertido Nikon Eclipse Ti (10x). As imagens foram coletadas em 0, 24 e 48 h após a zero.
2.10. A análise estatística
Os dados são a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. Diferenças significativas foram determinadas pelo teste t de Student de uma amostra. Foram consideradas significativas as diferenças
p Art 0,05. borrões representativos são mostrados.
Resultados de
3
.
1 |. efeito diferencial da
KRAS
A146T
e KRAS
G13D em células CRC tratados com EGF
linha celular HCT116 CRC, abrigando uma activação endógena
KRAS
G13D /p mutação, e dois HAF1 isogênico (
KRAS
p /-) e HAE6 (
KRAS
/G13D -) clones foram usados para este estudo. Todos esses genes recomendadas para prever um resultado clínico para a terapia do cancro foram sequenciados nas três linhas de células [22] (S1 tabela). Curiosamente, enquanto todas as mutações encontradas em HCT116 foram também observadas em células HAE6, descobrimos que em células HAF1 um
KRAS
A146T
mutação hotspot espontaneamente surgiu em que até agora foi destinado ser um alelo de tipo selvagem. Dado este resultado, caracterizada
KRAS
A146T
células e os comparou com HCT116 ou linhas celulares HAE6 (S1 Fig e Arquivo S1). células HAE6 apresentou a maior taxa de proliferação e os mais baixos níveis de adesão celular. Uma ferida análise da migração das células de cicatrização revelaram diferenças entre as três linhas celulares (HCT116, com mostrando uma taxa mais elevada do que HAF1 mas menor do que as células HAE6. Em contraste com os resultados anteriores,
KRAS
estado mutacional não teve nenhum efeito aparente na fosforilação ERK e AKT, em condições basais. Isto não é surpreendente, uma vez que as três linhas celulares abrigam um PIK3CA ativando mutação.
KRAS
A146T
parecia ser a mutação menos tumorigénico. no entanto, a cultura de células não sincronizado em condições basais poderia mascarar o efeito da mutação KRAS em resposta a um estímulo específico. por conseguinte, para explorar ainda mais o efeito a jusante de
KRAS
A146T
versus o bem caracterizada
KRAS
G13D
mutação, as células HAF1 e HAE6 foram cultivadas em meios e em seguida estimuladas com EGF privadas de soro. Para descartar a possibilidade de que a mutação pode afectar
KRAS
expressão, qPCR foi realizado e
KRAS
níveis de ARNm encontrados em ambas as linhas celulares foram semelhantes (dados não mostrados). Embora EGF-tratamento induziu uma rápida fosforilação de ERK1 /2 e AKT em HAF1, esta resposta foi pobre em células HAE6 (Fig 1A). , níveis pERK notáveis já eram elevados em controles HAE6 não tratados. Além disso, como já foi descrito em outras linhas de células com uma via de ERK hyperactivated [23], diminuiu os níveis FEG pakt nesta linha celular HAE6.
. alvos a jusante de KRAS via de sinalização foram analisados por western blot para determinar pAKT e /2 níveis pErk1 após EGF-tratamento. B. A adesão celular foi determinada por análise por Western blot da clivagem talina em células HAF1 e HAE6. rácio C. A migração foi estudada após o tratamento EGF (20 ng mL /) por ensaio de cicatrização de feridas. O gráfico mostra a percentagem de células que migraram para a área da ferida após 24h. A proliferação celular D., medido pelo ensaio de BrdU, para analisar a actividade proliferativa nas células tratadas com EGF (20 ng /ml). * P 0,05 vs o EGF-tratados controlos não tratados (n = 4)
experiências de adesão celular não pode ser realizada em meios isentos de soro, porque as células foram sensíveis a HAF1 tripsinização após 24h privação de soro.. Um talina-clivagem mais elevada tem sido associada com a adesão celular inferior [24]. Portanto, analisamos clivada-Talin como um método indirecto para medir a adesão celular. Em células não estimuladas, a talina-clivagem foi já superior em HAE6 do que em células HAF1. Além disso, enquanto a talina-clivagem foi induzida em resposta ao EGF em células HAF1, esta clivagem proteolítica foi o EGF-independente em células HAE6 (Fig 1B). A seguir, analisou migração celular e descobriram que as células foram HAE6 também não respondem a EGF, em contraste com a migração celular induzida por EGF na linha celular HAF1 (Fig 1C). Finalmente, a proliferação de células, embora induzida por EGF em ambas as linhas celulares, foi aumentada a um menor grau do que em HAE6 em HAF1 células (Fig 1D). Nós fundamentado que hiperativação de ERK1 /2 induzida pela KRAS
G13D pode chegar a um patamar além do qual as células não pode ser mais estimulada por EGF.
3.2. níveis de mRNA diferencial em KRAS
G13D vs KRAS
A146T linhas celulares de CRC
Nós examinamos esses possíveis efeitos de transcrição dependentes de KRAS em ambas as linhas de células usando DNA microarrays Affymetrix (S2 e S3 Arquivos). Sob a presença de
KRAS
G13D
mutação, genes mais diferencialmente expressos foram regulados negativamente (Fig 2A e 2B; S2 Fig), quando comparado com
KRAS
A146T
mutação (HAF1). No entanto, a expressão da maioria dos genes não alterou substancialmente, e apenas alguns deles foram sobre-reguladas. A fim de validar estes dados, a expressão de uma variedade de genes regulados positivamente foi analisada por qPCR. Estes genes foram selecionados por seu papel proeminente na metástase do tumor, o fator de crescimento derramamento ou CRC fármaco-resistência [25, 26]. A expressão destes genes foi dramaticamente sobre-regulada em células com uma mutação
KRAS
G13D
alelo, confirmando assim os dados de microarranjos (Fig 2C e S2 FIG). Entre os genes regulados negativamente em HAE6 vs. células HAF1, a via mais representativa afectada foi de sinalização EGFR1; 43 genes foram regulados negativamente fora do 156 descrita pela via canonical EGFR1. No entanto, outras vias desencadeada por citocinas e factores de crescimento, tais como VEGF, PDGF, HGF, IGF-1, TGFp, TNFa e várias interleuquinas, foram também regulada para baixo. Isto não é surpreendente, pois a maioria deles compartilha várias etapas dentro da via de sinalização RAS.
RNA total a partir de células CRC cultivadas em condições basais com 10% FBS foi analisada por microarray. A. Venn-diagrama que mostra a percentagem de genes cima e para baixo-regulado encontrados na linha de células abrigando um
KRAS
G13D
mutação (HAE6), quando comparado com os níveis de mRNA encontrado em HAF1 células (
KRAS
A146T
)
. gráfico B. Bar representando genes diferencialmente expressos (valor-p ≤ 0,001) entre as duas linhas de células HAE6
contra
células HAF1, considerando somente log2 mudança dobra 1,5 e -1.5. símbolo do gene para cada gene é indicado do lado esquerdo. C. Três genes,
catepsina L
,
catepsina C Comprar e
ADAM19
foram selecionados com base no seu potencial papel na invasão celular e migração, para validação microarray usando qPCR. * P 0,05 contra células HAF1.
3.3. Efeito de mutações KRAS na acetylome global CRC
Um dos potenciais vias afetadas pelo estado mutacional do KRAS que podem regular vários processos biológicos é acetilação de proteínas. Procurou-se estudar se o perfil de acetilação global no CRC foi diferencialmente afetada pela activado KRAS
G13D e KRAS activado
A146T. proteínas isoladas a partir de ambas as linhas de células cultivadas em 10% de FBS, foram imunoprecipitados e analisados por Western blot com anticorpos anti-acetil-Lys (Fig 3A). Uma abordagem proteómica western blot 2D foi utilizado para analisar profundamente-acetilados proteínas a partir das duas linhas de células. proteína global Lys-acetilação foi aumentado em comparação com HAE6 HAF1 células, de acordo com o aumento do número de pontos detectados (Fig 3B).
. Os homogenatos celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-acetil-lisina e os precipitados foram então imunotrans contra os resíduos da acetil-lisina, incluindo uma quantidade igual de homogenato de partida (chamado de entrada). IgG: Os homogenatos imunoprecipitada com IgG de soro normal. Os marcadores de massa molecular (kDa) estão à esquerda do gel. B. perfis de expressão da proteína de ambas as linhas celulares separados por IEF PAGE bidimensional, coradas com SYPRO Ruby (painel da esquerda) ou anticorpo contra imunotransferidas acetil-lisina para identificar proteínas acetilados (painel da direita). O pH aumenta da esquerda para a direita na abscissa ea massa molecular diminui de cima para baixo na ordenada. C. Distribuição de funções GO Biológicas atribuídos às proteínas acetilados identificados no acetylome de células HAE6.
pontos positivos do acetylome HAE6 foram excisadas e identificado por espectrometria de massa. 67 pontos foram detectados, mas apenas aqueles com uma pontuação de iões Mascot confiante e uma correspondência alta peptídeo foram selecionados (S2 Tabela). O (GO) análise da função biológica de nossos 36 proteínas acetilados revelou que as proteínas alvo foram enriquecidos em quatro principais categorias relacionadas com o crescimento celular, metabolismo energético, processo metabólico RNA e proteínas (Fig 3C). Muitas destas proteínas foram já descritas para serem alvos de acetiltransferases putativos ou desacetilases e tornar-acetilado sob diferentes condições experimentais (revisto em S2 Tabela). Os nossos resultados de microarray confirmou que as diferenças no padrão de acetilação não eram devidas a um aumento da expressão do mRNA. Com efeito, esses genes cujos produtos foram identificados na nossa análise acetylome manteve-se inalterada em comparação com HAE6 quando HAF1 células (S2 e S3) Arquivo.
3,4. Acetilação de familiares RNPhn
Entre os alvos-acetilados havia um grupo interessante de RNA binding proteins, todos eles membros da família de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos (hnRNPs), envolvido em uma variedade de funções moleculares que vão de processamento de mRNA, o transporte, a estabilidade ou mesmo de tradução [27]. Foram analisados nas duas linhas de células se a acetilação basal de hnRNPs era dependente de
estado mutacional do KRAS
. A acetilação foi medida por experiências de imunoprecipitação com anticorpos acetilo (Lys), seguido por Western blot com anticorpos que reconhecem o membro hnRNP específica. Como mostrado na Fig 4A, hnRNPA1 e A2 /B1 foram encontrados para ser hyperacetylated sob condições de crescimento (FBS a 10%) em comparação com quando HAE6 HAF1; No entanto, este esquema não era tão evidente em outros membros da família testado tal como hnRNPA3 ou L. O ARNm e os níveis proteicos de hnRNPs foram analisadas por qPCR e Western blot, respectivamente (Figura 4B e 4C); a expressão de nenhum dos hnRNPs mostraram uma mudança significativa quando comparados entre as diferentes linhas de células. Portanto, os diferentes níveis de acetilação observadas não são o resultado de um aumento da taxa de expressão do gene ou a estabilização de proteínas.
. Os extractos totais das duas linhas celulares de CRC em condições basais (10% de FBS) foram isoladas e imunoprecipitadas com anticorpos de α-acetil lisina. A amostra foi imunoprecipitada foi então analisada por Western blot com anticorpos que reconhecem o membro hnRNP específica (painel da esquerda). As entradas de cada hnRNP específica nas diferentes linhas de células são mostradas (painel da direita). B. níveis de ARNm de hnRNPs foram analisadas por qPCR (n = 3). Não houve significância estatística. análise de mancha C. ocidental mostrando os níveis de proteína dos diferentes hnRNPs em células HAF1 e HAE6. p-actina foi utilizada como controle de carga.
3.5. A acetilação do hnRNPA1 e L em resposta a EGF
Embora acetilação de hnRNPs já foi descrito em outros sistemas celulares, no momento, não se sabe se a acetilação é parte da resposta de EGF em células de CRC. Se for o caso, será importante estabelecer se os
KRAS
estado mutacional poderia condicionar a induzida por acetilação diferencialmente de hnRNPs mediante estímulos EGF. Ambas as linhas celulares foram crescidas em meio isento de soro e depois estimuladas com EGF durante um curto (20 min.) E um período de tempo (2h) de tempo (Figura 5A). As amostras de cada condição foram imunoprecipitados com anticorpos tanto anti-hnRNPA1 ou anti-hnRNPL. Estes hnRNPs foram selecionados uma vez que representam esses isoforma mostrando a mais alta e as diferenças de acetilação mais baixas quando se comparam as células HAF1 e HAE6. Para estabelecer a relação de acetilação (acetil-RNPhn /total de RNPhn), proteínas pull-down foram ainda analisados por Western blot com anticorpos específicos contra acetil-Lys ou o RNPhn correspondente.
Ambos linhas celulares de CRC foram cultivadas em soro livre de forma e, em seguida, estimulada com EGF (20 ng /mL) durante 20 e 120 min. A. Extractos proteicos de controlo ou de células tratadas com EGF foram isolados e imunoprecipitadas com α-hnRNPA1 (painel superior) ou hnRNPL (painel inferior) anticorpos. As amostras imunoprecipitadas foram, em seguida, analisado por Western blot com anticorpos que reconhecem os resíduos de acetil-lisina e, quer hnRNPA1 ou hnRNPL. Entradas de cada RNPhn específica nas diferentes linhas de células são mostrados. B. níveis de ARNm de hnRNPA1 hnRNPL e foram analisadas por qPCR no controle e 2h células tratadas com EGF. Não houve significância estatística (n = 3). análise de mancha C. ocidental mostrando os níveis de proteína de ambos os hnRNPs em células HAF1 e HAE6 no controle e 2h condições EGF-tratamento. A intensidade das bandas hnRNPs foi medida e normalizada por β-actina; gráficos no painel inferior mostra a quantificação tanto para hnRNPL e A1 na HAF1 (barras brancas) e HAE6 (barras cinzentas) linhas celulares.
De acordo com a privação de soro, os níveis basais de ambos os acetilação hnRNPs foram maiores em HAE6 do que em células HAF1 (Figura 5A, pista 0). No entanto, a acetilação de ambos, e hnRNPA1 hnRNPL no ponto final de EGF-tratamento era a mesma nas duas linhas celulares. Curiosamente, quando a acetilação das amostras tratadas com EGF foi comparada com controlos não tratados, os níveis de hnRNP-acetilados não se alterou significativamente durante o curso de tempo de tratamento de EGF em células-HAE6 (Fig 5A). Por outro lado, o EGF induziu uma acetilação dramática de ambos os hnRNPs em HAF1 células. Curiosamente a mesma resposta foi observada após tratamento com EGF na linha celular parental HCT116 (Fig S3). Por fim, o ARNm e proteína de níveis ou hnRNPA1-G não foram induzidos em qualquer linha de células tratadas com EGF para os pontos de tempo testados (Fig 5B e 5C; S3 figura). Por conseguinte, a acetilação induzida por EGF em HAF1 observada não pode ser atribuído à modulação de transcrição ou tradução de hnRNPs.
3,6. Papel da
KRAS
mutação A146T em RNPhn acetilação
Para estudar se
KRAS
A146T
mutação pode contribuir para induzida EGF- acetilação da hnRNPs, que especificamente não inibiu o KRAS via de sinalização na linha de células HAF1. Independentemente do
KRAS
mutação A146T, as células HAF1 também englobam um
PI3KCA
mutação. Por isso foi analisada a acetilação de hnRNPs induzida por EGF em células pré-tratados com inibidores de ambos, MEK1 /2 (U0126) e PI3K (LY294002). A inibição de uma via única, quer MEK1 /2 ou PI3K, utilizando o inibidor específico por si só, não teve efeito sobre a acetilação de proteínas (Fig 6A). A capacidade de RAS para influenciar a actividade de PI3K e vice-versa, tem sido bem documentado [28, 29]. Com efeito, bloquear a actividade de MEK1 /2 foi mostrado para induzir a fosforilação de AKT em linhas celulares de CRC [30]. Por outro lado, bloquear a actividade de PI3K foi demonstrado que o aumento /2 níveis pErk1 em resposta a uma variedade de estímulos [28]. De acordo com isto, quando ambos os inibidores foram utilizados em simultâneo, a inibição do RAS /PI3K vias de sinalização bloqueou completamente a acetilação induzida por EGF de ambos hnRNPA1 e hnRNPL (Fig 6B). Curiosamente, os níveis basais de hnRNPs acetilados em controles privadas de soro não foram afetadas pelos inibidores de cinases.
A. HAF1 células foram tratadas com EGF na presença ou ausência de inibidores de MAPK (MEK, UO0126 ou PI3KA, LY294002). Os extractos de proteína a partir de células foram imunoprecipitados com HAF1 α-hnRNPA1 ou anticorpos hnRNPL. As amostras imunoprecipitadas foram, em seguida, analisado por Western blot com anticorpos que reconhecem os resíduos de acetil-lisina e, quer hnRNPA1 ou hnRNPL (painel da esquerda). A fosforilação de ERK1 /2 e AKT em células HAF1 também foi avaliada para confirmar a eficiência de inibidores individuais nas doses utilizadas (painel direito). B. Ambos os inibidores de MAPK foram simultaneamente utilizadas para estudar o seu efeito sobre a acetilação induzida por EGF de hnRNPs. C. Papel de desacetilases sobre os níveis basais de acetilação hnRNPs foram ainda estudados em HAF1 células tratadas com tricostatina A. A imunoprecipitação com anticorpos hnRNPs e Western blot contra a acetil-lisina, hnRNPA1 ou L em células tratadas com EGF HAF1, TSA ou uma combinação de ambos são mostrados.
basal níveis de acetil-hnRNPs poderia ser dependente da meia-vida de acetilações. Na verdade, a acetilação de proteínas não é apenas o resultado da actividade induzida por acetiltransferase, mas também de desacetilases. Para examinar o papel de desacetilases de acetilação basal, foi investigado se o inibidor da desacetilase tricostatina A (TSA) poderia imitar o efeito do EGF em células HAF1. Na verdade, TSA aumentou a acetilação de ambos os hnRNPs aos mesmos níveis alcançados pelo EGF-tratamento, embora nenhum efeito sinérgico foi observado (Fig 6C).
Discussão
Aqui descobrimos vários aspectos dos eventos moleculares subjacentes carcinogénese do cólon que será ainda discutido. Nós fornecemos o primeiro relatório indicando que a acetilação de 36 proteínas específicas é dependente de
estado mutacional do KRAS
; entre eles, vários membros da família PRNhn. Além disso, os nossos dados indicam que hnRNP acetilação é parte da resposta de EGF-indutível. Em segundo lugar, vamos mostrar as conseqüências moleculares de desequilíbrio alelo pela exclusão de qualquer um, um tipo selvagem ou um alelo mutante no
KRAS
G13D /WT
células CRC. A deleção do alelo de tipo selvagem (HAE6) conduz, não só para hnRNP acetilação, mas também para o perfil mais tumorigénico e EGF-sem resposta destas células. Por outro lado, a eliminação do alelo mutante (HAF1) induz uma espontânea
KRAS
A146T
mutação no alelo do tipo selvagem.
Coletivamente nossas observações parecem paralelas os achados clínicos indicam que a ruptura do
KRAS
alelo selvagem é um fator prognóstico adverso para CRC [31]. Surpreendentemente, em HAF1 células, uma espontânea
KRAS
A146T
mutação pontual foi encontrado. De acordo com isso, os relatórios mais recentes mostram
KRAS
alterações genotípicas dinâmicas em toda a progressão do câncer colorretal metastático [11]. Esta mutação pontual também presta uma ativação constitutiva do KRAS [32], em um futuro próximo, seria importante analisar possíveis mutações espontâneas em qualquer outra linha de células CRC utilizados como modelo experimental para estudar os mecanismos moleculares da terapia de resistência ou nova droga desenvolvimento.
testes de triagem de mutação com base no hotspot
KRAS
códons 12 e 13 resultaram na erros de classificação de até um terço dos pacientes que foram erroneamente considerada como
KRAS
de tipo selvagem e eram resistentes aos tratamentos anti-EGFR [33, 34].
KRAS
mutações nos códons 61 e 146 estão significativamente associados com a sobrevivência livre de progressão mais curto em comparação com o tipo selvagem
KRAS
em pacientes CRC tratados com uma combinação de cetuximab e quimioterapia [10].