Abstract

cromossomo 8q24 é a região mais comumente amplificado em vários tipos de cancro, bem como a duração típica de a amplificação sugere que ela pode ter como alvo genes adicionais para

MYC

. Para explorar o papel dos genes mais frequentemente incluídos no 8q24 amplificações, foi analisada a relação entre as alterações no número de cópias e a expressão do gene em três conjuntos de câncer de endométrio (N = 252); e no glioblastoma, ovário e cancros da mama perfilado por TCGA. Entre os genes vizinhos

MYC

, a expressão do gene contendo bromodomain

ATAD2

foi o mais associado com a amplificação. Bromodomain contendo genes têm sido implicados como mediadores da função transcricional MYC, e de fato

ATAD2

expressão mais associada com a expressão de genes conhecidos por ser regulada por MYC do que era

MYC

si. Amplificações de 8q24, expressão de genes a jusante da MYC, e superexpressão de

ATAD2 mau resultado

previsto e aumento do primário para as lesões metastáticas. Knockdown de

ATAD2

e

MYC

em sete endometrial e 21 linhas de células de câncer de mama demonstraram que linhagens de células que eram dependentes de MYC também dependia ATAD2. Estas mesmas linhas celulares também foram mais sensíveis à desacetilase de histona (HDAC) inibidor Tricostatina-A, de acordo com estudos anteriores identificação de proteínas contendo bromodomain como alvos de inibição por inibidores de HDAC. Os nossos dados indicam expressão elevada ATAD2 é um marcador de cancros endometriais agressivos, e sugerem inibidores específicos de ATAD2 podem ter utilidade terapêutica no estes e outros cancros dependentes de MYC

citação:. Raeder MB, Birkeland E, Trovik J, Kråkstad C, Shehata S, S Schumacher, et ai. (2013) Integrated Genomic Analysis do 8q24 Amplification em cancros Identifica endometriais

ATAD2

como essencial para a

MYC- Cancros

dependente. PLoS ONE 8 (2): e54873. doi: 10.1371 /journal.pone.0054873

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 28 de setembro de 2012; Aceite: 17 de dezembro de 2012; Publicação: 05 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Raeder et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro : HELSE Vest Grants 990.172 (MBR), 911.351, 911.624 e 911.626 (HBS); da Universidade de Bergen; Cancer Society da Noruega; Conselho de Investigação da Noruega Grants 205404 e 193373 (BH); o Instituto Nacional do Câncer (K08CA122833 e U54CA143798); e uma bolsa V Foundation (RB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma endometrial é a neoplasia maligna ginecológica pélvica mais comum, com um risco de vida entre as mulheres de 2-3% [1]. Aproximadamente 75% dos tumores são confinados ao corpo do útero no momento do diagnóstico e são ressecados. No entanto, 15% -20% destes tumores recaída. Estes tumores, e tumores que são metastáticos na apresentação, respondem muito pouco à quimioterapia ou a radiação e são geralmente fatal [1], [2].

Existe uma necessidade de novos marcadores para identificar pacientes com risco elevado de recaída , e a desenvolver novas terapias para os pacientes com doença metastática [3], [4]. Infelizmente, a investigação para estes objectivos é fortemente sub-representadas no câncer de endométrio em comparação com outros tipos de câncer, como mama e cancro do ovário. Uma abordagem é a identificação de genes que, quando alterado por acontecimentos genéticos somáticas, conduzem a progressão do tumor. Essas alterações podem então servir como marcadores de cânceres agressivos e os genes podem servir como potenciais alvos terapêuticos.

A amplificação focal mais frequente no cancro endometrial está em 8q24 [5]. Na verdade, 8q24 é a região mais comumente amplificado em vários tipos de câncer [6], e essa amplificação é um marcador de prognóstico negativo em vários tipos de câncer [7]. Embora

MYC

é um alvo provável [6], os efeitos desta amplificação no cancro endometrial nunca foram dissecados. Com efeito, é possível que ele atinge vários genes, como tem sido demonstrado para amplificações em outras partes do genoma do cancro [8]. Por exemplo, um gene vizinho,

ATAD2

, foi encontrado para ser um co-regulador do

MYC Comprar e superexpressão de

ATAD2

tem sido associada com mau prognóstico no peito , pulmão e cancros da próstata [9], [10], [11].

Vamos explorar o papel do 8q24 amplificação no câncer de endométrio por meio de análises genômicas integradoras de câncer de endométrio primários e metastáticos com os dados clínicos completos, e identificar

ATAD2

como um alvo adicional do 8q24 amplificação nestes cancros. Identificamos cópia número ganho de

ATAD2

como um regulador do

ATAD2

expressão, apresentar os primeiros dados que liga

ATAD2

superexpressão de

MYC

ativação e fornecer dados funcionais sugerindo ATAD2 como um alvo terapêutico em cancros dependentes de MYC.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

A coleção de primárias de carcinoma do endométrio e metástases para este estudo foi aprovado pelo Data Inspecção norueguês (961.478-2), norueguesa Ciências Sociais Data Services (15501) e “Ética em Pesquisa Regional.

Comitê em Medicina, Noruega ocidental” (referência 052.01). Todos os participantes assinaram termo de consentimento.

Série Paciente

primárias carcinoma endometrial e metástases foram coletadas de pacientes atendidos no Hospital Universitário Haukeland, Noruega como descrito anteriormente [5]. Tumores recolhidos para a investigação fundamental e séries de validação qPCR foram congelados imediatamente após a ressecção; tumores recolhidos para peixes foram formalina fixa e embebidos em parafina. Os pacientes foram acompanhados de uma cirurgia primária até Outubro de 2010 ou a morte. Os perfis número de cópias da série de investigação preliminar, e os perfis de expressão (Agilent 21 K e 22 k oligoarrays) a partir de um subconjunto de 57 tumores, foram publicados anteriormente [5].

Análise RNA

o ARN foi extraído e hibridado com matrizes Agilent 44K (N ° de Cat G4112F) de acordo com as instruções do fabricante e como descrito anteriormente [5]. intensidades de sinal foram avaliadas utilizando-ArrayTools BRB (National Cancer Institute, EUA). As matrizes foram lote médio normalizado.

-PCR quantitativo em tempo real

O ADNc foi sintetizado a partir de ARN usando 1 ug de ARN de alta capacidade para os kits de cDNA (Applied Biosystems). Expressão de

ATAD2

e

MYC

foi determinada utilizando ensaios de expressão gênica TaqMan Hs00204205 e Hs00905030 respectivamente (Applied Biosystems) e todas as amostras foram executados em cartões microfluídicos por instructuions do fabricante, utilizando GAPDH-Hs99999905_m1 como endógenas ao controle. As amostras foram corridas em triplicado e analisados ​​no gerenciador de RQ (Applied Biosystems).

Foram preparadas

FISH

Tissue microarrays (TMAs), representando as áreas de maior grau, em cada tumor conforme relatado anteriormente [12] e tratou-se a 56C ° durante a noite antes da hibridação. FISH foi realizado utilizando o kit de sonda e enumeração Chromosome sonda MYC Spectrum Laranja FISH 8 (CEP8) (Vysis) de acordo com as instruções do fabricante, conforme relatado anteriormente [13]. A contagem foi realizada em áreas de tecido digestão óptima e há núcleos sobrepostos. sinais da sonda e de controlo foram contados em 40-60 células dentro de áreas de digestão do tecido ideal e sem núcleos sobrepostos. Amplificações foram marcados quando a relação MYC /CEP8 foi . 1,0

TCGA Validação Dataset

Nós acessada nível 3 dados do portal de dados TCGA em novembro e dezembro de 2010. Para o câncer de mama, obtivemos dados de expressão gênica para 279 tumores e 24 controles normais (arrays de expressão Agilent 244K) e copy-número de 176 tumores (Affymetrix SNP 6.0 Arrays). No cancro do ovário obtivemos a expressão do gene (Agilent 244K matrizes de expressão) e copy-número (matrizes Agilent 1M) dados a partir de 514 e 489 tumores, respectivamente. Para glioblastoma obtivemos dados de expressão de genes a partir de 385 tumores e 10 controles normais (arrays Affymetrix U133A) e cópia de dados de números de 261 tumores (Agilent 244K matrizes).

Viabilidade Celular

lentivirais codificação shRNAs específico para

ATAD2

,

MYC

, e os controles de

GFP

,

LACZ1

, e

LACZ2

(Tabela S1) foram obtidos a partir O RNAi Consortium. Lentivírus foi produzida por transfecção de células 293T com vectores que codificam cada um shRNA (5 ug) com plasmídeos de empacotamento que codifica PSPAX2 e PDM2.G usando Fugene HD (Roche). Lentivírus contendo sobrenadante foi recolhido 48 e 72 h após a transfecção, reunidas e armazenadas a -80 ° C. As células foram infectadas em meio contendo polibreno, centrifugada a 1000 g durante 30 min, e seleccionadas em puromicina (2,5 ug ml

-1) A partir de 24 h após a infecção.

linhas celulares de cancro foram obtidas da ATCC , DSMZ, ECACC e HSRRB, e cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor (Tabela S2). A viabilidade das células após o ARNi foi medida em placas de 96 poços. Oito poços semeados com células foram infectadas com diluições 1:30 de cada vírus contendo shRNA. Metade dos poços foram submetidos a selecção de puromicina, e a viabilidade celular foi medida utilizando Cell-Titer Glo (Promega) uma semana mais tarde. Os valores de cada quadruplicado foram em média; “Outlier” poços foram excluídos se os poços replicados teve SD /média 0,2 e excluindo o bem melhorou a variância. Os valores médios em gancho de cabelo e ATAD2- MYC- foram normalizados para os valores médios a partir do controlo de GFP.

Para determinar a Tricostatina-A sensibilidade, Tricostatina-A (Sigma) (0,040-10 uM) e veículo (DMSO) controlo foram adicionados a cada um de três poços contendo cada linha celular em placas de 96 poços. A viabilidade celular foi determinada após 72 horas, utilizando Cell-Titer Glo (Promega).

imunotransferência

As células foram lavadas com PBS, colhidas, lisadas utilizando tampão de lise RIPA com inibidores de protease e fosfatase, e centrifugado a 16000 × g. O sobrenadante foi misturado com tampão de amostra 4X SDS, fervidos durante 7 minutos, e submetidas a SDS-PAGE em géis de gradiente 4-12%. As manchas foram sondadas com anticorpos contra ATAD2 (HPA029424, Sigma), MYC (SC-764, Santa Cruz) e actina (sc-1615, Santa Cruz).

Estatísticas

Os dados moleculares foi relacionado ao fenótipo clínico usando χ de Pearson

o teste t de Student 2 ou frente e verso, conforme apropriado. Utilizou-se análise de regressão linear múltipla para a predição de

ATAD2

níveis de expressão. sobrevida univariada e multivariada foram realizadas por métodos de log rank e Mantel-Cox, respectivamente. “MYC sinalização força” e os níveis de expressão de genes foram apresentados como Z-scores.

Resultados

Avaliação da

MYC

como um alvo do 8q24 Amplification

suporte de dados biológicos extensivo

MYC

como um oncogene [14], e 8q24, abrigando

MYC

, é a região amplificada mais comum em vários tipos de câncer [6]. No entanto, a importância da activação MYC no câncer de endométrio é essencialmente desconhecido.

Foi realizada uma análise integrada de número de cópias e expressão de dados para procurar evidências de que

MYC

é alvo de 8q24 amplificação no câncer de endométrio. Foram avaliados dados de expressão de uma série de 82 tipos de câncer endometrial obtidos em um único condado em Noruega, com dados de número de cópias do genoma correspondentes de 70 tumores (a “Série investigação preliminar”). Dezasseis destes tumores (23%) apresentaram amplificação 8q24. A maioria destas amplificações foram de baixo nível, que vão até a um número de cópias de 4,7. Nós validado nossos resultados em quatro conjuntos de dados adicionais. Duas delas representam amostras com perfil de expressão do genoma: uma “série de validação interna” para o qual os dados gerados a partir de 40 primárias e 19 cânceres de endométrio metastáticos recrutados da mesma região, na Noruega, e uma “série de validação externa” que representa a expressão publicado anteriormente perfis de 111 tumores [5]. Os outros dois conjuntos de validação representam amostras analisadas com ensaios focalizadas: uma “série qPCR” de 162 amostras e uma “série FISH” de 399 amostras. As características dos pacientes e variáveis ​​histopatológicos para todos os nossos conjuntos de dados internos são apresentados na Tabela S3.

Nós descobrimos que ambos

MYC Comprar e genes regulados positivamente pela MYC foram sobre-expressos em câncer de endométrio com 8q24 amplificação em relação ao endometrial cancros sem ele (p = 0,047 e p ​​= 0,0078, respectivamente) (Figuras 1-A-b). Usamos uma lista anteriormente publicada de 68 genes que se encontram a ser regulada pela MYC em vários contextos e ensaios (Tabela S4; www.myccancergene.org) [15] e teve a sua sobre-expressão ( “MYC sinalização força”) usando GSEA [16]. Nós também testamos cinco assinaturas de ativação MYC suplementares provenientes do “Gene Definir banco de dados Enriquecimento”, refletindo a ativação de MYC em diferentes contextos. Quatro deles foram expressos em níveis mais elevados em cancros do endométrio com 8q24 amplificação (Figura S1a).

(a)

MYC

expressão e (b) a sinalização MYC são ambos aumentou entre os cânceres de endométrio com 8q24 amplificação. (C) Variações no

MYC

expressão explicam apenas uma pequena proporção da variação na sinalização MYC. fits lineares são mostrados na série de validação vermelho, amarelo e verde para a série de investigação preliminar, série de validação interna e externa, respectivamente. (D) Os comprimentos das amplificações que contêm

MYC

são significativamente maiores do que o esperado em comparação com amplificações observadas em outras partes destes cancros. (E) Entre 26 genes no 8q24 pico com dados de expressão, expressão do

ATAD2

é mais fortemente e significativamente associada com a amplificação correspondente. barras azuis mostram a percentagem de aumento na expressão gênica e barras vermelhas mostram os valores de p. O limite de significância é de Bonferroni-corrigido para múltiplas hipóteses. (F) A expressão de

ATAD2

está altamente correlacionada com MYC sinalização força. fits lineares são mostrados como no painel c.

No entanto, variações no

MYC

expressão si só explicou uma pequena proporção de variações no MYC força sinalização (R2 = 0,11, p = 0,002 ) (Figura S1b). Foram obtidos resultados fracos de modo semelhante nos conjuntos de dados de validação internos e externos (r2 = 0,00, p = 0,34 e r2 = 0,06, p = 0,012, respectivamente; Figura S1B). Em todos os três conjuntos de dados, as variações na expressão MYC representam apenas 5% das variações na intensidade sinalização MYC (R2 = 0,05, Figura 1c).

Além disso, 8q24 amplificações são mais longos do que a distribuição típica de tamanhos de amplificação em endometrial cancro (p = 0,0021) (Figura 1C), e geralmente envolvem múltiplos genes. Nós, portanto, a hipótese de que 8q24 amplificações pode ter como alvo genes adicionais, alguns dos quais podem funcionar através do aumento da sinalização MYC. Para identificá-los, nós avaliamos todos os 26 genes na região de pico de amplificação em 8q24 a que não tínhamos dados de expressão, para identificar genes cuja expressão correlacionada mais fortemente com a amplificação.

A expressão de

ATAD2

correlaciona fortemente com 8q24 Amplification e MYC Sinalização

a expressão de

ATAD2

foi mais fortemente associada com a amplificação de 8q24 do que era expressão de qualquer outro gene na região pico da amplificação (p-value = 2.77E-06) (Figura 1D). Quatro outros genes,

NDUFB9

,

DERL1

,

FAM91A1

, e

WDR67,

foram significativamente regulada por 8q24 amplificação, embora menos forte do que o

ATAD2

a expressão de

ATAD2

também se correlacionou com força sinalização MYC mais fortemente do que fez expressão de qualquer outro gene na região do pico do 8q24 (R2 = 0,48, p . 0,001; Figura 1E, Figura S1b). De fato, a associação entre o

foi observada ATAD2

expressão e MYC força sinalização mesmo entre amostras sem amplificação 8q24 (R2 = 0,48, p 0,001). A correlação entre o

ATAD2

força expressão e MYC sinalização era mais de duas vezes tão forte como o próximo gene mais significativamente associados (

NDUFB9

) e mais forte do que para

MYC

si ( R2 = 0,05; Figura 1c).

ATAD2

não é um dos 68 genes na assinatura de ativação MYC, e para nosso conhecimento

MYC

não foi encontrada para modular a expressão de

ATAD2

[15]. No entanto, foi encontrado ATAD2 anteriormente para se ligar a MYC e a região E-box de vários genes alvo MYC, e níveis ATAD2 foram encontrados para ser limitante para a transcrição dependente de MYC [9].

Ambos genome-wide série de validação também exibiram a correlação entre os sinais de myc e

expressão ATAD2

(R2 = 0,54, p 0,001 e R2 = 0,45, p 0,001 em série validação interna e externa, respectivamente) e a relativa falta de correlação com

MYC

expressão (R2 = 0,00, p = 0,33 e R2 = 0,06, p = 0,012; Figuras 1F e S1b). Expressão de

ATAD2

também se correlacionou com quatro dos cinco assinaturas adicionais de activação MYC, e correlacionado mais fortemente com estas assinaturas do que a expressão de

MYC

si (Tabela 1). A última assinatura não mostrou associação com a

ATAD2

ou

MYC

expressão.

A amplificação de 8q24 e expressão de

ATAD2

, mas não MYC , estão associados à doença progressão

Entre os 70 tipos de câncer do endométrio para a qual tínhamos dados da matriz SNP do genoma, 8q24 amplificação foi associado com sobrevida livre de progressão reduzida (p = 0,024) e aumento do risco para a doença específica morte (p = 0,043). A amplificação de 8q24 foi mais freqüente em não-endometrióides (p = 2.98E-05) e de alta qualidade tumores (p = 2.90E-08) (Tabela S5), também características associadas com cânceres agressivos [17].

Nós confirmamos 8q24 amplificação está associada com mau prognóstico usando FISH em uma série independente de 399 tipos de câncer endometrial. Vinte cancros (5%) apresentaram aumento 8q24-cópia números relativos ao cromossoma 8 centrómero (Figura 2a). Estes foram associados com 64% de sobrevida de 5 anos, contra 85% para cancros sem 8q24 amplificação (p 0,001) (Figura 2b). Um padrão similar foi observado para a sobrevida livre de recorrência (p = 0,001). A amplificação de 8q24 também foi associado com estágio de alta FIGO (p = 0,003), tipo histológico não-endometrioid (p 0,001), e alto grau (p 0,001). (Tabela S5)

sondas FISH contra 8q24 (vermelho) e do cromossomo 8 centrômero (verde) em um tumor primário e as metástases show de amplificação emparelhado apenas no (a) (b) Entre 399 pacientes avaliados por FISH, aqueles com 8q24 amplificações têm resultado últimos pior. Na série de investigação primária, tumores entre os maiores quartis de (c)

ATAD2

expressão e (d) a força sinalização MYC também tinham maior risco de morte específica da doença. (E) O receptor de estrógeno negativo (ER) tumores com

expressão ATAD2

no quartil superior também foram associados com um risco elevado de morte específica da doença; o risco era muito menor entre receptor de estrogênio positivo (ER +) tumores com

expressão ATAD2

no quartil inferior. (F)

ATAD2

expressão e (g) a sinalização MYC são ambos mais elevada entre as metástases do que os tumores primários da série de validação interna.

expressão alta de

ATAD2

e sinalização MYC também foram associados com maior risco de progressão do câncer (p = 0,003 e p = 0,015, respectivamente), a morte específica por câncer (p = 0,004 e p = 0,001) (Figuras 2c-d), e outras características pobre-prognóstico .

ATAD2

expressão foi maior em não-endometrióide, de alta qualidade e negativos tumores ER (p 0,001, P 0,001 e p = 0,02, respectivamente; Tabela S6); sinalização alta MYC foi associada com pouco diferenciado (p = 0,0016) e não-endometrióide (p 0,001) cancros. Expressão de

ATAD2

também foi associado negativamente com a expressão de

ESR1

(R2 = 0,10, p = 0,005). Da mesma forma, estudos anteriores descobriram que

ATAD2

expressão é maior em tumores de câncer de mama triplo negativo [18] e é regulada negativamente pelo estrogênio em cultura de células [19].

Na verdade,

ATAD2

expressão foi um preditor independente de mortalidade específica da doença (HR = 1,83, p = 0,027) ea progressão da doença (HR = 1,62, p = 0,011) após o ajuste para o estado ER. tumores ER-negativos com superior quartil

ATAD2

expressão foram particularmente letal. (HR = 4,1, p = 0,002; Figura 2e)

Nós confirmaram estes resultados, avaliando

ATAD2

expressão por PCR quantitativa e estado ER por imuno-histoquímica em nossa série de validação qPCR de 162 tumores adicionais. Entre estes, os tumores ER-negativos com superior quartil

ATAD2

expressão foram associados com resultados ainda piores do que na série primária (HR = 6,8, p 0,001) (Figura s1c). Alta

ATAD2

expressão também permaneceu associada com maior risco de morte específica da doença (p = 0,0043) e menor sobrevida livre de progressão (p = 0,016). Após o ajuste para o estado ER,

ATAD2

expressão continuou a prever a morte específica da doença (HR = 1,86, p = 0,018), mas apenas tenderam para uma associação com a progressão da doença (HR = 1,31, p = 0,11). Expressão de

ATAD2

também foi maior no de alto grau (p 0,001)., Não-endometrioid (p = 0,005) e ER-negativos tumores (p = 0,02) (Tabela S6)

em contraste,

MYC

expressão não foi associada com a progressão ou risco de morte específica da doença em qualquer nossa série investigação primário (p = 0,07 e p ​​= 0,68, respectivamente) ou a série de validação qPCR (p = 0,53 e p = 0,28, respectivamente). Alta expressão de

MYC

foi associada com grau elevado em ambas as séries (p 0,001 e p = 0,02, respectivamente), e com a histologia não-endometrióide na série investigação primário (p = 0,03) (Tabela S6) .

As metástases também exibem mais 8q24 amplificação,

ATAD2

expressão, e

MYC

sinalização força do que os tumores primários. Em relação a tumores primários, metástases exibiram taxas de 2,4 × mais elevados de amplificação 8q24 focal por FISH (14,3%; p 0,007). Entre os 399 pacientes da série FISH, 49 haviam emparelhado tumores primários e metastáticos. Cinco destas amostras (10%) não exibiu amplificação 8q24 no primário, mas adquirido na metástase. Apenas uma das amostras (2%) exibiu o padrão oposto. Para examinar

ATAD2

sinalização de expressão e MYC, nós também comparou os 42 tumores primários com os 19 metástases em nossa série de validação interna. Ambos

ATAD2

expressão e força sinalização MYC foram maiores nas metástases (p = 0,002 e 0,004, respectivamente; Figura 2f-g), incluindo, entre 8 pacientes com tumores emparelhados primários e metástases (p = 0,01 e 0,05 respectivamente) .

extensão a outros tipos de câncer e tecido normal

Nós também investigou se 8q24 amplificação está associada ao aumento

expressão ATAD2

em outros tipos de câncer. Especificamente, foram utilizados dados de 514 cancros do ovário, 279 cancros da mama, e 385 glioblastomas de The Cancer Genome Atlas [20], [21]. Estes incluíram dados de expressão de tecido normal adjacente de 24 cancros da mama e 10 glioblastomas. 8q24 amplificações foram observadas em 72% (n = 126) dos cancros da mama, 74% (N = 364) dos cancros do ovário, e 10% (n = 27) dos glioblastomas.

ATAD2

foi co-amplificado para o mesmo nível que o

MYC

em quase todos os tumores (como era entre os nossos câncer de endométrio; Figura s1d-g)

A expressão de.

ATAD2

correlacionada com 8q24 amplificação entre todos os três tipos de cancro (r2 = 0,47, 0,11, e 0,36 para os cancros da mama, os glioblastomas, e cancros do ovário, respectivamente; p 0,001 em todos os casos; Tabela S7), e foi de 2,6 × 2,5 × e maior entre os tipos de cancro em relação ao tecido normal da mama e no cancro do glioblastoma, respectivamente (p 0,001 em ambos os casos).

MYC

expressão correlacionada menos fortemente com 8q24 amplificação em todos os três tipos de câncer (R2 = 0,12, 0,07, e 0,10 para os cancros da mama, glioblastomas, e cancros do ovário, respectivamente; p 0,001 em todos os casos).

expressão MYC

em cânceres de mama foi surpreendentemente metade de tecido normal (p 0,001); no glioblastoma foi mais elevada por um factor de 3,5 (p 0,001).

ATAD2

expressão também se correlacionou com a sinalização MYC em todos os três tipos de cancro (r2 = 0,11, 0,21, e R2 = 0,31, respectivamente, para os cânceres de mama, glioblastomas, e cancros do ovário; p 0,001 em todos os casos), e foi mais fortemente correlacionada com a força MYC sinalização de

MYC

expressão era (R2 = 0,10, p 0,001; R2 = 0,09, p 0,001;. e R2 = 0,02, p = 0,003 nos três tipos de câncer)

ATAD2

Expression está correlacionada com a

E2F

Gene Expression e

ATAD2

copiar número de forma

Aditivo

Nós também explorou as contribuições relativas de E2F, o estrogênio, e cópia-número na expressão ATAD2. O

ATAD2 e região promotora contém sítios de ligação para várias proteínas E2F e dados funcionais anteriores mostraram que E2F aumentos

expressão ATAD2

em cultura de células [9], [22];

ATAD2

também tem sido induzida pelo estrógeno [23]. Em nossos dados, a expressão de cada

E2F

fator de transcrição foi associada com

ATAD2

expressão, mas apenas a inclusão de

E2F1

,

E2F2

e

E2F8

melhorou o ajuste global de um modelo de previsão de

ATAD2

expressão de

ATAD2

-número de cópias e

expressão ESR1

. Os níveis destes três genes de expressão foram altamente correlacionados, e nós nos concentramos em

E2F1

.

Nós descobrimos que

ATAD2

copy-número,

ESR1

expressão e

E2F1

expressão explicou 77% da variação no

expressão ATAD2

no câncer de endométrio, e cada uma das variáveis ​​de previsão permaneceu significativamente associada a

expressão ATAD2

na ajustados modelo (Figura 3a e Tabela S7). Descobrimos também que

ATAD2

copy-número e

E2F

expressão previu independentemente

expressão ATAD2

no câncer de mama, câncer de ovário e glioblastoma (Figura 3b-d e Tabela S7) .

ESR1

, que foi menos fortemente associada a

ATAD2

expressão, foi significativo no modelo ajustado apenas no cancro do endométrio (p = 0,016) e glioblastoma (p 0,001), e não no ovário ou câncer de mama. Estes dados sugerem que a cópia-número de

ATAD2

é um determinante importante do

expressão ATAD2

mesmo no contexto de outros mecanismos de regulação celular.

(a) O câncer endometrial , (b) o cancro da mama, (c) câncer de ovário, e (d) glioblastoma. pontos amarelos representam as amostras ea placa azul é o previsto ajuste 3-D. As linhas verdes e vermelhas são a distância entre as observações de ajuste eo reais previstos para amostras acima e abaixo da placa 3D-fit, respectivamente.

Dependência de

MYC

Prevê Dependência

ATAD2 Comprar e resposta a HDAC Inibidores em Endometrial- e do cancro da mama células

Os resultados acima leva à hipótese de que

ATAD2

expressão promove MYC sinalização e que as células de cancro do endométrio que são dependentes de

myc

também seria dependente de

ATAD2

. Medimos o efeito sobre a viabilidade de knockdowns shRNA de

ATAD2

e

MYC

em sete linhas celulares de cancro do endométrio. Foram utilizados dois shRNAs contra cada gene, selecionando os que apresentaram a maior redução da expressão da proteína entre os seis e três shRNAs blindados contra

ATAD2

e

MYC

respectivamente (Figura 4a, b).

Western blot para (a) ATAD2 e (b) MYC indicam extensão do knockdown com seis shRNAs contra

ATAD2 Comprar e três shRNAs contra MYC, respectivamente. ATAD2 experiências foram realizadas em células da KLE e MYC experimentos foram realizados em células infectadas com o controlo TE9 GFP e vectores MYC. Experimentos subsequentes usados ​​

ATAD2

shRNAs A e E, e MYC shRNAs a e b. Reduções na viabilidade celular entre os sete linhas endometriais de células de cancro (c) e linhas de células de cancro 21 da mama (d) eram altamente correlacionados após knockdown de ATAD2 ou myc e depois knockdown de myc e o tratamento com o inibidor de HDAC Tricostatina-A (1,25 uM) ( e-f).

Knockdown de qualquer

ATAD2

ou

MYC

resultou em reduções altamente correlacionadas na viabilidade através das linhas de cancro do endométrio sete celulares (R2 = 0,70 , p = 0,020; Figura 4C). Em dois casos, observou-se mais de 75% reduções na viabilidade. Não houve associação entre a expressão de

ATAD2

ou

MYC

ou 8q24 número de cópias e sensibilidade à

ATAD2

ou

MYC

knockdown.

Estes resultados sugerem que os cancros dependentes-Myc de outros tipos podem também ser dependente de ATAD2. Não há diminuição da proliferação tinha sido visto anteriormente com

ATAD2

knockdown em células TIG3-T ou U2OS [9]. Quando testamos um painel maior de linhas de câncer 21 mama, no entanto, que confirmou a forte correlação entre a diminuição da viabilidade após o knockdown de ATAD2 ou MYC (R2 = 0,61, p 0,001; Figura 4d).

A associação entre dependência de

MYC

e

ATAD2

sugere ATAD2 como um alvo terapêutico no

MYC

dependentes de cânceres. Considerando

MYC

tem sido um oncogene conhecido, abordagens clínicas para bloquear a sinalização MYC ainda não foram bem sucedidos. Histona-desacetilase (HDAC), no entanto, têm sido mostrados para inibir indirectamente proteínas contendo bromodomain tais como ATAD2 [24].

Utilizou-se o mapa de conectividade [25] para identificar os compostos cuja assinaturas anticorrelated com a sinalização MYC assinatura. Entre as 1309 pequenas moléculas representadas pelo mapa de conectividade, o assinatura do inibidor de HDAC a Tricostatina A foi mais-anticorrelated com o assinatura MYC sinalização. (Valor de p 0,00001; Tabela S8). Nós também gerada uma assinatura de doença agressiva da série investigação preliminar, utilizando os 50 genes mais sobre- e sub-expressos em pacientes com doença metastática em comparação com pacientes sem doença metastática. Nós encontramos o Trichostatin-A assinatura foi também o mais anticorrelated com esta assinatura de doença agressiva, amarrado com assinaturas de quatro outras moléculas (p 0,00001; Tabela S8).

Para confirmar funcionalmente a relação entre Trichostatin-A e MYC dependência, testamos todas as linhas de células cancerosas e câncer de mama endometriais para inibição do crescimento por Trichostatin-a e compararam os resultados com

MYC

knockdown. Tricostatina-A inibição do crescimento nas mesmas linhas celulares que eram dependentes

MYC

tanto no endométrio (R2 = 0,74, p = 0,013; Figura 4E), e nas linhas de células de cancro da mama (R2 = 0,31,