Abstract
Apesar de alguns estudos descreveram as características de células-tronco do câncer de cólon (CSCs) e o papel do endotélio células progenitoras (EPCs) em neovascularização, ainda é controverso se existe uma interação ou não entre CSCs e EPCs. Nas actuais modelos de estudo, HCT116 e esfera HT29, que são conhecidas por serem as células enriquecedoras CSCs, foram estabelecidas para investigar os papéis dessa interação no desenvolvimento e metástase de câncer de cólon. Em comparação com os seus homólogos dos pais, as células esferóides demonstrou maior capacidade de invasão, maior potencial tumorigénico e metastático. Em seguida, o in vitro e in vivo relação entre CCC e EPCs foram estudados usando ensaio de formação do tubo capilar e modelos de xenoenxerto. Os nossos resultados mostraram que as células de esferóide pode promover a proliferação, migração e formação de tubo de CPE através da secreção de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Enquanto isso, os EPCs poderia aumentar a capacidade tumorigénica de células esferóides através de angiogênese. Além disso, a maior densidade de microvasos foi detectada nas células-tronco cancerosas área enriquecedoras em tecido de cancro do cólon humano. Nossas descobertas indicam que as células esferóides possuem as características de células-tronco cancerosas, e a coerção CSCs e EPCs podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cancro do cólon
Citation:. Wei B, Han XY, Qi CL, Zhang S, Zheng ZH, Huang Y, et al. (2012) coaction de Células Spheroid-Derived Stem-Like e células endoteliais progenitoras promove desenvolvimento de cancro do cólon. PLoS ONE 7 (6): e39069. doi: 10.1371 /journal.pone.0039069
editor: Giovanni Camussi, Universidade de Torino, Itália |
Recebido: 25 Dezembro, 2011; Aceito: 18 de maio de 2012; Publicação: 26 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Wei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation da China (No. 30.872.462 para Hong-Bo Wei, e No. 81.000.960 para Bo Wei). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é a terceira principal causa de mortes por câncer em todo o mundo, ea taxa de sobrevivência relativa de 5 anos é de apenas 53,8-65,2%, apesar dos avanços diagnósticos e terapêuticos [1], [2]. recorrência de tumores e metástases são dois factores críticos que influenciam a sobrevivência de câncer colorretal.
Recentemente, evidência crescente sugere que a iniciação do tumor e metástases são dependentes de uma pequena subpopulação de células tumorais de células-tronco cancerosas (CSCs) rolamento denominados infinito potencial de auto-renovação e a capacidade de se diferenciar em diversas populações que compreendem um tumor [3]. De acordo com este modelo, as células-tronco do câncer foram encontrados para sustentar a carcinogênese, metástase e recorrência de câncer colorretal.
A existência de células-tronco cancerosas foi comprovada pela primeira vez no contexto da leucemia mielóide aguda [4]. Este princípio foi alargado para alguns tumores sólidos, incluindo câncer de cólon, câncer de mama, tumores cerebrais e câncer de pulmão [5], [6], [7], [8], [9], [10]. separação de células de uma sub-população com base em marcadores da superfície celular e a confirmação da sua actividade de iniciação do tumor em ensaios de transplante de xenoenxerto, são procedimentos para o isolamento e identificação das CSCs a partir de tecidos tumorais ou linhas celulares [11] utilizada. Embora CD133, CD44, EpCAM foram amplamente utilizados como marcadores de superfície celular de células-tronco de câncer de cólon, ainda havia dúvidas sobre estes marcadores da superfície celular [12], [13]. população Side isolamento células (SP) já foram usados para enriquecer as células-tronco do câncer. Mas vários estudos mostraram evidência contra uma associação entre as células SP e células-tronco do câncer [14], [15], [16], [17]. Recentemente, pesquisas crescentes têm relatado que os não-aderentes, tridimensionais esferas de tumor (3D) em condições livres de soro poderia eficientemente enriquecer as células-tronco do câncer [18], [19], [20]
in vitro
. Por conseguinte, este método foi aplicado para enriquecer as células estaminais do cancro do cólon no presente estudo.
As células progenitoras endoteliais (CPE), uma subpopulação menor da fracção de células mononucleares no sangue periférico, se originam, principalmente, a partir da medula óssea derivadas as células com a capacidade para se diferenciarem em células endoteliais maduras [21], [22]. EPCs deixar a medula óssea e recrutar a sites que exigem reparo vascular após gradientes de fatores de crescimento e citocinas que são liberados para a circulação de tecidos ou tumores feridos, e depois contribuir para a formação de vasos sanguíneos [23], [24]. Evidências recentes demonstraram que EPCs circulantes desempenham um importante papel na neovascularização do tumor, crescimento de tumor, metástase e [25], [26], [27], [28], [29].
Embora a contribuição de EPCs a neovascularização do tumor foi demonstrada em vários tipos de cancro, não têm sido relatados a interacção entre EPCs e de células estaminais do cancro do cólon. O objetivo deste estudo foi determinar os bionomics de células-tronco de câncer de cólon e o papel da coerção da CSCs e EPCs no crescimento e metástase de câncer de cólon
Declaração de Ética.
Materiais e Métodos
Todos os experimentos envolvendo participantes humanos (incluindo a recolha de amostras de sangue do cordão umbilical e de cancro do cólon umbilical humano) foram aprovados pela Comissão médica de Ética em Pesquisa Sun Yat-sen University, e conduzida de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsínquia. Todos os participantes envolvidos no estudo assinaram os formulários de consentimento informado e todas as experiências com animais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes. E este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica em Pesquisa Animal de Sun Yat-sen University.
Cultura de Células
HCT116 (ATCC, CCL-247) e HT29 (ATCC, HTB-38) linhas celulares de cancro do cólon foram mantidas em DMEM /F12 suplementado com 10% de FBS, 200 U /ml de penicilina, 200 ug /ml de estreptomicina. meios Tumorsphere (também chamado como meio isento de soro, SFM) foi composto por meio DMEM /F12 suplementado com 1 × B27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), insulina rotina (5 ug /ml, Invitrogen), 200 U /ml de penicilina, e 200 ug /ml de estreptomicina. Para a cultura de suspensão de 3D, as células HCT116 e HT29 cultivadas em duas monocamada dimensional foram digeridas com tripsina, ressuspendidas e, em seguida semeadas a uma densidade de 2 × 10
6 células em SFM em 100 mm de ultra-baixa pratos de fixação (Corning) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO2 a 5%? 95% de ar.
Detecção de Expressão CD133 por citometria de fluxo
As células derivadas de culturas de monocamada e em suspensão esferas no dia 7 após a cultura primária foram detectados para a expressão de CD133. As células foram lavadas duas vezes em PBS frio, e, subsequentemente, as suspensões celulares foram incubadas a 4 ° C com 1:10 conjugado com FITC monoclonal de ratinho anti-humano CD133 Ab (Miltenyi Biotec) durante 45 minutos no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes em PBS frio com 1% de BSA e ressuspensas em 400 ul de PBS frio com 1% de BSA para a análise de citometria de fluxo dentro de 1 hora.
auto-renovação e diferenciação de várias Ensaio
Spheroid células foram dissociadas em células isoladas e plaqueadas em placas de 6 poços a 100 células por poço em 2 ml de SFM. Para avaliar a capacidade de auto-renovação das células esferóides, imunofluorescência de células de Lgr5 e CK20 foram realizadas após a cultura de 7 dias. a diferenciação celular foi induzida através da cultura em DMEM /F12 suplementado com 10% de FBS em frascos comuns. Quatro semanas mais tarde, o mesmo imunofluorescência celular foi realizada, ea expressão de CD133 foi determinada pelo FCM como descrito antes.
proliferação celular e Formação de Colónias Ensaio
-Única célula suspensões de esferóide e Prepararam-se as células aderentes e semeadas a 1 x 10
4 culas por po em placas de 96 poços, e cultivadas em SFM quer ou meio contendo soro durante 24 h. A proliferação celular foi realizada no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 usando contagem celular Kit-8 (Dojindo, Japão). O ensaio de formação de colónia placa foi conduzido para determinar a eficácia de formação de colónias de células em quatro grupos. Suspensões de uma única célula foram plaqueadas a 1 x 10
2 células por poço em placas de 6 poços, e cultivadas em meio contendo soro a 37 ° C em 5% de CO2 durante 2 semanas. Em seguida, as placas foram coradas com corante de Giemsa-Wright. O número de colónias em cada poço foi contado e fotografado. As experiências foram realizadas de forma independente, pelo menos, três vezes.
A homogeneidade e a heterogeneidade Ensaio de aderência de
A capacidade de adesão de células a ECM foi testada utilizando fibronectina (FN) -Revestido placas de 96 poços (Corning) . Suspensões de célula única de esferóide e as células aderentes foram plaqueadas (10
5 /poço), e incubadas a 37 ° C durante 2 h, em seguida, lavadas com PBS para remover as células não adesivas. Delt OD de 570 nm comprimento de onda foi determinada de modo a reflectir as células aderentes utilizando FN-Contagem celular Kit-8 (Dojindo, Japão). A capacidade de adesão das células para células homogéneas foi testado utilizando células em monocamada pavimentadas placas de 96 poços. esferóides de células aderentes e foram colocadas em placas a 10
5 por poço, e incubou-se a 37 ° C durante 60 min, 90 min e 120 min. Em seguida, as células não aderentes foram contadas e a actividade adesiva homotípica foi calculada utilizando a fórmula:. Adesão homotípica (%) = (número total de células – células não adesivas) /células totais x 100%
migração e invasão ensaios
Migração e ensaios de invasão foram realizadas em 24 poços câmaras placa transpo� com 8 mm de poros inserções de filtro de policarbonato (Corning). Um total de 5 × 10
4 ou 10
5 dissociado esferóide ou células aderentes foram semeadas em inserções não revestidas ou revestidas com Matrigel em 100 ul de inserções de meio isento de soro para os ensaios de migração ou invasão respectivamente. As câmaras inferiores foram cheias com 0,5 ml de meio DMEM /F12 10% suplementado com FBS. Após 24 h e /ou 48 h, as células no lado superior do filtro foram removidas e as células na superfície inferior do inserto foram fixadas e coradas com violeta de cristal. O número de células coradas foi contado sob um microscópio de luz. Os ensaios foram realizados em triplicado.
Análise Western Blot
Os extractos celulares totais foram separadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10% e transferida para membrana de polivinilideno Fluoreto (Millipore) para ICAM-1, CXCR4 e detecção de VEGF. As membranas foram lavadas em solução salina tamponada com Tris com Tween (TBST, composto por Tris-HCl a 10, pH 8, NaCl 150 mM e 0,05% de Tween 20), bloqueado 1 h à temperatura ambiente com 5% de leite magro em TBST, e depois sondado 1 h à temperatura ambiente com anticorpo anti-ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnologies), anti-CXCR4 (Abcam), anti-VEGF (BD Pharmingen) e anti-GAPDH (Peprotech). Após incubação com anticorpo secundário conjugado com peróxido de rábano, proteínas imunorreactivas foram detectadas pelo sistema de detecção ECL (Millipore). As concentrações de proteína foram determinadas usando o kit de ensaio de proteína BCA (ThermoScientific Biosciences).
Isolamento e Avaliação de EPCs
As células mononucleares foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade a partir de sangue do cordão umbilical humano e cultivadas em fibronectina balão -Revestido usando M199 suplementado com 20% FBS e 1% de extractos de tecido cerebral do rato. EPCs foram purificados de paridade na taxa de adesão diferente, e as células não aderentes em 24 horas, foram transferidos para um outro frasco revestido com fibronectina. Após a cultura de 14 dias, EPCs foram incubadas com PE-CD133, CD34 FITC, PE-VEGFR2 ou controlos do mesmo isotipo IgG e identificados por citometria de fluxo como descrito antes.
proliferação e migração celular de EPCs
-suspensão de células isoladas de EPCs foi semeadas a 2 x 10
4 culas por po em placas de 96 poços, e cultivadas em M199 contendo 0, 20%, e 40% de sobrenadante de células aderentes ou esferóide. A proliferação celular foi realizada no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 usando contagem celular Kit-8 (Dojindo, Japão). Os ensaios de migração foram realizados para avaliar o recrutamento de EPCs por esferóide ou células aderentes. suspensão de uma única célula de EPCs foi inoculada em 5 × 10
4 culas por po em inserções em 100 ul de meio isento de soro. As câmaras inferiores foram cheias com 0,5 ml de DMEM /F12 contendo 40% de sobrenadante de células aderentes ou esferóide. Após 24 h, as células migradas foram contadas como descrito anteriormente. Os ensaios foram realizados em triplicado.
In vitro
capilar formação do tubo
Os sobrenadantes de HT29, HT29 Esfera, HCT116 e HCT 116 Sphere foram adicionados a placas de 24 poços (Corning Inc ) revestido com fator de crescimento reduzida Matrigel (BD Biosciences). Para ilustrar, se a capacidade de formação de tubo de CPE pode ser influenciada através do bloqueio de VEGF, bevacizumab (Avastin, um anticorpo de VEGF monoclona, Genentech Inc.) foi adicionado ao sobrenadante de células de esferóides a uma concentração de 0,25 mg /ml, tal como outros dois grupos [30], [31]. Então, um total de 5 × 10
4 EPCs foram semeadas e incubadas a 37 ° C, 5% CO2 durante 3 a 30 h. Após 24 h, os tubos capilares foram contadas em campos aleatórios de cada poço. Os ensaios foram realizados em triplicado.
ELISA
Para demonstrar o efeito parácrino das células de haste do cancro e confirmar o resultado da detecção de VEGF a partir da análise de Westerm Blot, nós investigamos a secreção de VEGF por células estaminais cancro utilizando um método quantitativo. concentração de VEGF no sobrenadante de células esferóides /aderentes foram determinados por ELISA (R D Systems) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. E também, o experimento foi realizado três vezes.
In vivo
Tumorigênese
Para determinar se as células esferóides são mais tumorigénico do que suas contrapartes aderentes
in vivo
e se EPCs promover a sua capacidade tumorigénica, aumentando a angiogênese do tumor, realizou-se o desenvolvimento do tumor e experiências metástase hepática. As células isoladas foram ressuspensas em PBS. E, em seguida, 100 suspensões l contendo 2 x 10
6 células aderentes, células esferóides, ou células esferóides mais 2 × 10
5 ou 2 × 10
4 EPCs (as células esferóides e relação EPCs de 10:01 e 100:1) foram injectados por via subcutânea (SC) nos flancos do macho com 4 a 6 semanas de idade BALB /C-rato nu, obtidos a partir do Jackson Laboratory. diâmetros tumorais subcutâneos foram medidos com um compasso de calibre digital a cada dois ou três dias, e o volume do tumor em mm
3 foi calculada utilizando a fórmula: Volume = largura
2 × comprimento × 0,52. Em seguida, 3 ou 4 semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e secções de tecido congelado (6 uM) de tumores subcutâneos foram feitas por coloração de imunofluorescência para observar a angiogénese em cada grupo. Aqui usamos um anticorpo CD31 policlonal não-específico para detectar a neovascularização do tumor subcutâneo e outro anticorpo CD31 específico monoclonal humano para a contribuição EPCs para angiogoiesis.
In vivo
Liver Metástases
modelo metastático
fígado foi utilizada para determinar o potencial metastático de células de esferóides e se EPCs promover esta capacidade, aumentando a angiogénese tumoral. metástases hepáticas foram produzidos por injecção interna do baço de 4 × 10
6 células aderentes, as células esferóides, ou células speroid mais 4 × 10
5 ou 2 × 10
4 EPCs (o rácio de 10:01 ou 100 :1), e, em seguida, esplenectomia foi realizada 10 minutos após a injecção interna do baço para evitar Splend metástase. O estado geral de saúde foi gravado em detalhes uma vez por dia. Fígado focos de metástase foram examinados e medidos. E secção de tecido foi feito para coloração HE para confirmar a origem patológica.
Evidência clínica obtida por imunofluorescência Coloração
As secções congeladas (6 mm) de tecido de câncer de cólon e mucosa do cólon normal (n = 15 , a partir do mesmo paciente) foram fixadas com paraformaldeído a 4% /PBS, tratadas com microondas durante 10 min para a coloração imunofluorescente. A-CD31 anti Ab (Fisher Scientific), o anti-CD133 Ab (Abcam), o anti-Lgr5 Ab (Abcam), eo anti-CK20 Ab (Santa Cruz Biotechnologies) foram utilizados de acordo com o protocolo do fabricante. A contracoloração dos núcleos com DAPI (Invitrogen) foi também realizada. As secções foram incubadas com o segundo DeLight448- secundário ou 555-conjugado anti-ratinho ou coelho Ab (Abcam) durante 1 h a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. As imagens foram capturadas com um microscópio confocal Zeiss (LSM-710). Aqui, ao longo deste manuscrito, dados de pelo menos três experiências independentes foram analisadas para verificar a reprodutibilidade dos resultados.
Análise estatística
A significância estatística foi determinada por ANOVA de uma via seguido por Bonferroni pós teste hoc para comparações múltiplas ou teste t de Student. Para todos os testes, P 0,05 ou 0,01 foi considerado significativo ou altamente significativa estatisticamente
Resultados
Geração e caracterização de Colonospheres
Ambos HCT116 e HT29 células cancerígenas do cólon. cresceu em grande redondo, colónias esferóides flutuante não acopladas (colonospheres denominados) quando eles foram cultivadas em meio livre de soro suplementado com 1 × B27, 20 ng /mL de EGF, 10 ng /ml de bFGF (Figura 1). A frequência de células formadoras de esfera foi determinada através da realização de uma análise de diluição limitante extrema (ELDA) para as células HCT-116 parentais e colonospheres-derivados. A frequência de modo a formar esferas verificou-se ser 5,5 vezes mais elevada em células derivadas de colonospheres do que aqueles a partir das linhas celulares parentais.
Ambos HCT116 e HT29 podem formar grandes redondo, colonsphere flutuante solto de 50-100 uM quando cultivadas em SFM. Quando as células esferóides foram cultivadas em 10% de FBS contendo meio, as células esferóides flutuante ligado ao plástico, gradualmente migrado de colonspheres e transformado em células aderentes.
As células esferóides apresentaram maiores níveis de CD133 e Lgr5 (conhecido como marcadores cólon CSC), mas níveis mais baixos de diferenciada CK20 marcador de células epiteliais do que as células parentais correspondentes. A proporção de células positivas CD133 verificou-se ser inferior a 1% em linhas celulares parentais, mas mais de 80% observada em células esferóides (Figura 2). Quando os colonospheres foram submetidas a coloração por imunofluorescência para Lgr5, coloração Lgr5 óbvio foi observada na superfície da maioria das células de esferóides que indicam a presença de CSCs em colonosphere (Figura 2). Quando as células esferóides foram cultivadas em FBS a 10% contendo meio, eles ligado ao plástico, gradualmente migraram a partir de esferas de cólon e transformado em células aderentes morfologicamente. A citometria de fluxo e análise de imunofluorescência mostrou expressão CD133 e Lgr5 regulada negativamente com a cultura sobre-regulada CK20 após 4 semanas (Figura 2). Os resultados sugerem que CSCs foram eficientemente enriquecida em células esferóides, e eles têm a capacidade de se auto-renovar e multi-diferenciação.
CD133 (conhecido como marcador de células-tronco do câncer) expressão sobe de ≤1.2% até 60 % -80%, quando cultivadas em SFM, mas reduzida para 5% -10%, quando o colonsphere mudado de volta para as células aderentes. A mesma mudança de Lgr5 (conhecido como marcador de células-tronco crypt) expressão pode ser encontrado enquanto expressão CK20, o marcador de células epiteliais diferenciadas, mostrou a mudança adversa.
Células Spheroid exibição de maior capacidade de proliferação e Formação clone
Nós ainda determinado se as células esferóides tem capacidade de maior proliferação celular utilizando um ensaio de CCK-8. As proliferações de células esferóides foram maiores do que a do seu homólogo parental após um período de adaptação ao meio contendo soro (Figura 3A e 3B). E a capacidade de formação de colónias em células grupos esferóides era maior do que a sua congénere dos pais (Figura 3C e 3D).
(A-B) A proliferação de células HCT116 e HT29 esferóides foram maiores do que a sua parental homólogos após um período de adaptação ao meio contendo soro. (C-D) A capacidade de formação de colónia em grupos de células esferóide foi maior que a do seu homólogo dos pais.
Células Spheroid display inferior Adesão, mas Superior
in vitro
Migratórias /invasiva capacidade
para investigar o perfil maligna das células esferóides, realizamos ensaios in vitro para avaliar a aderência e capacidade migratória /invasiva de células esferóides em comparação com os seus homólogos aderentes. Os resultados do ensaio de adesão de células demonstraram que as células esferóides têm capacidades inferiores de ambos os adesão a FN (um dos componentes chave de ECM) e a aderência aos seus vizinhos homogéneos, em comparação com as suas células parentais (Figura 4A e 4B). Em seguida, a expressão de CXCR4 e ICAM-1 em células HCT116 esferóides /HT29 foi examinado e comparado com as suas células paternas. O nível de ICAM-1 foi modestamente regulada para baixo, enquanto que a expressão de CXCR4 foi regulada em células HCT116 esferóides /HT29, quando comparado com células em monocamada HCT116 /HT29, respectivamente (Figura 4C).
(A-C) esferoidal células têm capacidades inferiores de ambas as aderências a FN (a) e para os seus vizinhos homogéneos (B), em comparação com as células parentais. A expressão de ICAM-1 em células speroid era modestamente regulada para baixo, enquanto que a expressão de CXCR4 foi regulado para cima em comparação com as células em monocamada HCT116 /HT29, respectivamente, (C). (D e E) Células HCT116 esferóides /HT29 mostrou um 3,8 vezes (p 0,01) e quatro vezes maior (p 0,001) aumento do potencial quimiotáctica às 24 h (D). Mais células esferóides foram, obviamente, observados para invadir Matrigel, em comparação com os seus homólogos dos pais (p 0,001 e p 0,05, respectivamente, E).
Usando câmaras de migração Transwell, descobrimos que as células esferóides exibir uma aumento significativo da motilidade celular. Em comparação com células aderentes HCT116 /HT29, células de esferóide HCT116 /HT29 mostrou um 3,8 vezes (p 0,01) e quatro vezes maior (p 0,001) aumento do potencial quimiotáctica às 24 h, respectivamente (Figura 4D). Estas células também demonstraram maior capacidade de invadir inserções Matrigel-revestidas em câmaras de migração Transwell. Mais células HCT116 /HT29 esferóides foram, obviamente, observados para invadir Matrigel, em comparação com células aderentes correspondente (p 0,001 e p 0,05, respectivamente) (Figura 4E). Estes resultados indicam que as células esferóides são dotados de aderência menor, mas maior capacidade migratória /invasiva, um fenótipo funcional associada com a agressividade do tumor.
Células Spheroid promove a proliferação, migração e formação do tubo de EPCs Através Up-regulação VEGF Expressão
EPCs purificados foram obtidos a partir de sangue do cordão umbilical humano. A citometria de fluxo mostrou que a análise EPCs em fase posterior exibida uma certa expressão de CD34 e CD133, mas a expressão de alto nível de VEGFR2 (Figura 5A-5C). A proliferação celular e migração de CPE induzidos por sobrenadantes de células esferóides foram mais elevados do que os seus homólogos (Figura 5D e 5E). O ensaio de formao de tubo mostrou que mais tubos formados no grupo de células que o grupo esferóide células aderentes. Além disso, quando 0,25 mg /ml de bevacizumab (Avastin, um anticorpo monoclonal de VEGF) foi adicionado em sobrenadante de células de esferóides, a capacidade de formação de tubo de EPCs foi suprimida (Figura 6A). Em seguida, as secreções de VEGF nos sobrenadantes das células aderentes /esferóides foram detectadas utilizando ELISA. Os resultados mostraram que a concentração de VEGF no sobrenadante de células aderentes foi menor do que as células de esferóide (Figura 6B). A expressão de células de esferóide /aderentes foram avaliadas por transferência de Western (Figura 6C). Os resultados ilustraram que o VEGF pode desempenhar um papel importante no efeito de esferóides sobre células EPCs, o que sugeriu que as células esferóides possam promover a angiogénese através de CPE para cima a regulação da expressão de VEGF.
(Ac) EPCs aderir a FN balão revestido após 72 horas e os clones EPCs pode ser vista depois de uma semana (A), e presente como sinal de calçamento-depois de duas semanas (B). EPCs em fase posterior exibir uma certa expressão de CD34 e CD133, mas a expressão de alto nível de VEGFR2 (C). (D, E) A proliferação celular (D) e migração (E) de EPCs tratadas por sobrenadantes de células esferóides foram maiores do que suas contrapartes.
(A) a formação do tubo de EPCs tratadas por sobrenadantes de esferóide células foi maior do que os seus homólogos. E a formação do tubo de EPCs foi suprimida quando bloquear a função de VEGF por bevacizumab. (B) As concentrações de VEGF nos sobrenadantes das células esferóides foram mais elevados do que aqueles das células aderentes. (C) maior expressão VEGF foi observado nas células esferóides em comparação com os seus homólogos.
Células Spheroid possuem maior Oncogenia e potencial metastático
in vivo
e EPCs podem aumentar essas capacidades
As células esferóides tumorigencity mostraram significativamente maior do que as células aderentes (Figura 7a, 7b e 7e). Quando 2 × 10
6 células foram inoculadas em pequenos ratos nús, todos os ratinhos desenvolveram tumores. tumores transplantados foram confirmados como cancros do cólon com coloração hematoxilina-eosina. E os volumes de tumor subcutâneo em grupos de células esferóides foram significativamente maiores do que a dos grupos de células aderentes. Além disso, os volumes de tumor subcutâneo em células esferóides mais grupos 1/10 EPCs foram maiores do que a de células puras grupos esferóides (Figura 7C, 7D e 7F). Mas nenhuma diferença significativa foi encontrada entre as células esferóides puros e células esferóides mais 1/100 EPCs (dados não mostrados). Em seguida, a densidade dos vasos sanguíneos em tecidos de tumor foram avaliados utilizando imunofluorescência CD31 coloração. Mais vasos sanguíneos foram encontrados no grupo células esferóide comparado com o grupo de células aderentes, e ainda mais angiogénese no tecido do tumor foi observada no grupo combinado de esfera HCT116 mais 1/10 EPCs (Figura 7G-7J). E o MVD foram contadas de acordo com o anticorpo policlonal CD31 não específica. A fim de determinar a contribuição EPCs, foi realizada se a coloração utilizando um anticorpo monoclonal específico para CD31 humana. O resultado mostrou mais vasos sanguíneos no grupo combinado de esfera HCT116 mais EPCs do que as células esferóides puros (Figura 7K-L).
(A-F) O esferóide células mostraram tumorigenecity significativamente maior do que as células aderentes (A, ESTAR). E os volumes dos tumores subcutâneos em esferóides grupos de células mais EPCs foram maiores do que os dos grupos de células esferóides (C, D, F). (G-J), a densidade microvascular (MVD) de tumor desenvolvidos por células HCT116 esferóides (H) foi maior do que a de HCT116 (L). A maior MVD entre estes grupos foi encontrado no tecido do tumor desenvolvido a partir de esfera HCT116 mais 1/10 EPCs (i, j). E mais dos vasos sanguíneos desenvolvidos a partir de EPCs humanos na esfera HCT116 mais EPCs grupo (G) foram encontrados do que a de células pura grupo esferóides (K). (M) As células HCT116 esferóides desenvolvido focos mais metastático fígado do que HCT116.
Como a metástase hepática estava em causa, quatro ratos (4/5) desenvolveram metástases hepáticas no grupo células esferóide, mas apenas um rato (1/5) fez em grupo aderente. Os tumores metastáticos também foram confirmados como cancros do cólon com coloração hematoxilina-eosina (não figura mostrada). O resultado da contagem hepático metastático focos mostraram os resultados semelhantes (Figura 7M). As condições gerais dos ratos no grupo de células esferóide são piores do que os do grupo de células aderentes, e alguns deles desenvolveram ascite e caquexia grave. E não houve diferença significativa entre as células esferóides mais EPCs (com proporção de 10:01 e 100:1) grupos e grupos de células esferóides (dados não mostrados).
Clinical Evidence para câncer de células estaminais promover a angiogénese in Human cancros do cólon
Para apoiar os nossos achados experimentais, examinamos se as células-tronco do câncer de cólon promover a angiogênese dentro de cancros do cólon humanos, ea mucosa normal do mesmo paciente como controle. A coloração de imunofluorescência de CD133 /Lgr5 (marcador de células-tronco de câncer de cólon) e dos vasos sanguíneos CE marcador CD31 foram realizados. Como todos sabemos, há mais microvasos no tecido canceroso do que o tecido normal. Além disso, descobrimos que a maior densidade de microvasos na área enriquecer células-tronco cancerosas na amostra frescos de cancro do cólon humano (Figura 8).
(A) foram observados Mais microvasos no tecido câncer do que o tecido normal por coloração de imunofluorescência de CD133 e CD31 de mucosa normal e câncer de cólon. E maior MVD foram encontrados na área enriquecendo CD133
+ células-tronco cancerosas em tecido de câncer de cólon. (B) MVD Superior (CD31
+) foram encontrados na área enriquecendo Lgr5
+ células-tronco cancerosas em tecido de câncer de cólon.
Discussão
Na década de 70 do século passado, Fidler IJ et al. [32] proposto o conceito de heterogeneidade do tumor, que presumimos que havia diferentes fenótipos no tecido do tumor. A teoria de células-tronco do câncer foi moldado com base neste conceito. células-tronco do câncer é geralmente definida como uma pequena subpopulação de células tumorais de rolamento auto-renovação e potencial de diferenciação multi-direccional [11]. Até agora, a existência de células estaminais de cancro foi confirmada em vários tumores sólidos, incluindo o cancro do cólon. De acordo com esta hipótese, a pequena sub-população de células estaminais de cancro foi rolamento toda a característica de malignidade, incluindo infinita proliferação, invasão e metástase, recaída e resistência à terapia.
Hoje em dia, o método amplamente utilizado para isolar ou enriquecer as células-tronco do câncer de cólon é separação de células com base em marcadores da superfície celular, tais como CD133, Musasai-1, CD44, EpCAM, Lgr5, etc. Ricci-Vitiani L et al. relatou os CD133
+ células que representa cerca de 2,5% das células tumorais são células tumorgenic em câncer de cólon [33]. A injecção subcutânea de câncer de cólon CD133
+ células prontamente reproduzido o tumor original em ratinhos imunodeficientes, enquanto CD133
– células não desenvolveram tumores. No entanto, ainda havia muitas opiniões diferentes sobre estes marcadores de células-tronco do câncer. Por exemplo, Shmelkov SV proposto que a expressão de CD133 não se restringe às células-tronco, e tanto CD133
+ e CD133
– células metastáticas do cancro do cólon iniciar tumores [12]. Alguns pesquisadores relataram que as células da população side-effluxing corante expressando ABCG2, um ATP vinculativo cassete meio transportador, pode ser isolado como células-tronco do câncer [34], [35], [36]. No entanto, vários estudos mostraram evidência contra uma associação entre as células da população SP e tronco cancerosas. As células SP isoladas a partir de células de cancro gástrico MKN28 não produziu tumoral num modelo de xenoenxerto de [37]. Além disso, as células de linhas de células de cancro do cólon SP e não-SP demonstrar capacidade de diferenciação multipotencial equivalentes e tumorigenicidade semelhante no modelo de xenotransplante [38].
No presente estudo, obtivemos esferas tumorais de HCT116 e células do cancro do cólon HT29 linhas por cultura destas células em meio isento de soro [39], [40]. E a seguinte análise indicou que a expressão de CD133 e Lgr5 destas células esferóide foi maior do que a sua contraparte parental, enquanto que a expressão CK20 foi menor que representa a célula endotelial diferenciada. Os fenótipos contraditórias foram detectados quando as células esferóides foram induzidas para se diferenciarem em FBS contendo meio.