Sumário

TWIST1 superexpressão é frequentemente observada em vários tipos de câncer, incluindo câncer gástrico (GC). Embora a metilação do DNA do gene

TWIST1

foi avaliado em células de cancro, os mecanismos subjacentes a activação transcricional permanecem incertas. Neste estudo, examinamos primeiro as alterações epigenéticas do

TWIST1

usando

TWIST1

linhas de transcrição-positivas e celulares -negative que são derivados de nosso estabelecida do tipo difuso rato modelo GC. O tratamento com um agente de desmetilação de ADN activado re-expressão de 5-aza-dC TWIST1 em células de expressão de GC-negativo TWIST1. De acordo com a metilação específicas de PCR e análise de sequenciação de bissulfito, metilação na região rica em CpG dentro de

TWIST1

codificação do exão 1, em vez de a sua região promotora, foi firmemente ligado ao silenciamento transcricional do

TWIST1

expressão em células de rato GC. ensaios de imunoprecipitação de cromatina revelaram que marca histona ativa H3K4me3 foi enriquecida em células de expressão positiva TWIST1, e marca histona inativa H3K9me3 foi enriquecida em células de expressão negativa TWIST1. Os níveis de expressão

Suv39h1

e

Suv39h2

, metiltransferases histonas para H3K9me3, foram inversamente correlacionadas com o

TWIST1

expressão, e knockdown de

Suv39h1

ou

Suv39h2

induzida

TWIST1

expressão. Além disso, o factor de transcrição Sp1 ligado ao exão uma região rica em CpG em linhas celulares de expressão positiva TWIST1, e

TWIST1

expressão foi reduzido por mitramicina, que interfere com a ligação que Sp1 a sequências reguladoras ricos em CpG. Nossos estudos sugerem que o

TWIST1

transcrição em células de GC pode ser regulada por meio do potencial de cooperação de metilação do DNA, modificação da histona em complexo com ligação SP1 para regiões CpG-ricos dentro da região do exão 1.

citação: Sakamoto a, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA metilação no 1 Região Exon e do Regulamento Complexo de TWIST1 expressão em células de câncer gástrico. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630

editor: Tae-Young Roh, Universidade Pohang de Ciência e Tecnologia (POSTECH), República da Coreia

Recebido: 21 Setembro, 2015; Aceito: 06 de dezembro de 2015; Publicação: 22 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Sakamoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação Científica (C) (24.590.444) e (a) (25253081), e do Programa Foresight A3 (AA005) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS), ea Research Prático de Controle Innovative Câncer (15Ack0106017h0002) da Agência Japonesa para a Investigação e Desenvolvimento, AMED médica; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

competindo interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Abreviaturas:. BS, seqüenciamento bissulfito; CGI, ilha CpG; Chip, imunoprecipitação de cromatina; DCKO, o dobro do rato knockout condicional; DGC, difusa do tipo de câncer gástrico; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; GC, câncer gástrico; H3K4me3, histona H3 lisina 4 tri-metilação; H3K9me3, histona H3 lisina 9 tri-metilação; H3K27me3, histona H3 lisina 27 tri-metilação; MSP, reacção em cadeia da polimerase-metilação específica; RT-PCR, Reverse reação em cadeia de polimerase; qRT-PCR, RT-PCR quantitativo; ETG, genes supressores de tumores; TSS, local de início da transcrição; 5-aza-DC, 5-aza-2′-desoxicitidina

Introdução

TWIST1, atuando como um fator básico de transcrição hélice-alça-hélice, liga-se diretamente para elementos E-Box (NCANNTGN ) em genes alvo específicos [1]. TWIST1 é amplamente conhecida por ser essencial para a formação de mesoderme durante o desenvolvimento embrionário precoce de Drosophila e rato [2, 3]. Nos cancros humanos, a expressão ectópica TWIST1 é relatado para ser associado com a progressão maligna, invasão, a transição epitelial-a-mechencymal, metástase e stemness, indicando potenciais funções oncogénicas de TWIST1 [4-6]. Assim, é muito importante para clarificar os mecanismos reguladores da transcrição para TWIST1 em células cancerosas.

Epigenetic alterações, tais como a metilação do DNA e a modificação da histona, estão intimamente ligados ao silenciamento de genes [7-9]. Embora as alterações na epigenética CGI (ilha CpG) a região promotora dos genes supressores de tumor (ETG) são bem conhecidos para ser associado com a sua inactivação de genes [10], os mecanismos de regulação epigenética de oncogenes são mal compreendidos. Vários grupos mostraram que

TWIST1

foi re-activado por tratamento com uma droga de-metilação, 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC), em células cancerosas [11, 12]. metilação do DNA aberrante no promotor CGI em humanos

TWIST1

tem sido frequentemente detectada em cânceres primários, incluindo a de câncer gástrico (GC) [11-14]. No entanto, há um grande número de descobertas que a metilação de ADN no

TWIST1

região promotora não está correlacionada com a expressão do gene em diferentes tipos de cancro [12, 14]. Enquanto

TWIST1

metilação pode ser um biomarcador útil para prever os resultados clínicos quanto à recorrência e sobrevida em pacientes com cânceres [12, 13, 15], continua a ser controverso ou não o

TWIST1

metilação na região promotora leva ao silenciamento do gene.

a regulação transcricional de genes está correlacionada com padrões de lisina (K) na cauda de metilação das histonas que consistem em três estados lisina metilação diferentes (mono-, di- e tri-). Tri-metilação de H3K4 (H3K4me3) está relacionada com a activação de genes, e que de H3K9me3 H3K27me3 e a repressão do gene [7-9]. Embora esses padrões H3-methyaltion três histonas estão ligados a metilação CGI, bem como, os mecanismos reguladores da transcrição para

TWIST1

subjacente a modificação da histona são mal compreendidos em células cancerosas.

GC é a segunda mais frequente causa de morte por câncer no mundo [16]. GC é classificada em dois tipos histológicos principais; difusa e intestinal, que são duas vias distintas carcinogénicas [17]. cancro gástrico do tipo difuso (DGC) é conhecido por exibir invasão e metástase frequente, resultando em um prognóstico pobre [18]. Perda de E-caderina e p53 tem sido relatada na carcinogênese gástrica do tipo difuso [19-21]. Vários relatos demonstraram a superexpressão frequente de TWIST1 no PED humanos [22, 23].

Nós já projetou um double knockout condicional rato linha (DCKO) como a E-caderina e p53, que são especificamente inativado no estômago [ ,,,0],19]. Todos os ratos DCKO desenvolvido PED fatais dentro de um ano, os fenótipos sendo alta capacidade de invasão e metástase frequente para os gânglios linfáticos. Vale ressaltar que os padrões de expressão gênica de PED nos ratos DCKO detectados na análise microarray foram muito semelhantes aos dos outros do que os intestinais PED primários humanos. Assim, o nosso modelo de rato DCKO é uma ferramenta poderosa para investigar o papel da função do gene em DGC carcinogênese e para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica. No presente estudo, nós estabelecemos linhas de células DGC TWIST1 expressão positivos e negativos, que são derivados a partir de ratinhos DCKO. Como consequência da análise das alterações epigenéticas, o mecanismo de regulação comum de

TWIST1

foi elucidado, e avaliados em ambos os PED murino e humanos neste estudo.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos

in vivo

procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal de Tokyo Medical and Dental University (permissão No. 0160073A). Quanto a amostras de mucosa gástrica humana normais, consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos, eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Tokyo Medical and Dental University (No.1115).

celular culturas e amostras de tecido

Nós previamente estabelecido um E-caderina /p53 DCKO (

Atp4b-Cre

+

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

) mouse modelo [19]. De seus tecidos cancerosos, estabelecemos cinco linhas de células de rato DGC e nomeou-os MDGCs (Shimada S, observação não publicada). MDGC-1 e células MDGC-3 foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) contendo alto teor de glucose suplementado com soro fetal bovino a 10%, e MDGC-7, MDGC-8 e MDGC-9 foram cultivadas em meio F12 de Ham suplementado com 5% de soro de cavalo. A análise do DNA foi realizada a fim de detectar a truncado

CDH1

e

Trp53

alelos (S1 FIG). Oito linhas de células humanas de GC (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, e NUGC4 HSC60) também foram utilizados neste estudo. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY e KATO-III foram adquiridos a partir de banco de células RIKEN (Tsukuba, Japão). células NUGC4 e AGS foram obtidos a partir da pesquisa da ciência Banco de Recursos Humanos (Osaka, Japão) e a ATCC (American Type recolha de células). HSC60 células foram obtidas do Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Câncer Research Center, Tóquio, Japão) [24]. células KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS e HSC60 foram cultivadas em meio RPMI 1640, e GCIY foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco, ambos os quais foram complementados com soro bovino fetal a 10%. Para os estudos de-metilação, murino e células GC humanos foram tratados diariamente com 500 nM de 5-aza-desoxicitidina (5-aza-dC, Sigma; # A3656) durante 72 horas. Tratamos essas células GC com 100nM tricostatina A (TSA, Wako; # 200-11993) durante 24 horas ou 100 nM mitramicina A (Wako; # 132-17101) durante 24 horas

Dezoito tecidos GC primárias e correspondente. mucosas gástricas cancerosas não foram obtidas de 15 ratos DCKO. Quanto aos tecidos do estômago humanos, usamos três mucosa gástrica não-cancerosas de pacientes do GC. Também obtivemos cinco mucosa gástrica normal a partir de

Atp4b-Cre

–

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

ratos que foram utilizados como controlos negativos em nosso estudo anterior [19]. Neste estudo, chamado de “mucosas normais gástrica” ​​Se as amostras foram obtidas de camundongos de controle, e “mucosa gástrica não-cancerosas” se as amostras foram obtidas de camundongos DCKO e pacientes GC humanos neste estudo.

A transcrição reversa (RT) -PCR e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

o ARN total foi isolado com um kit RNeasy Mini (Qiagen; # 74134) e o ADNc foi preparado a partir de RNA usando um kit SuperScript III (Invitrogen; # 18080044) de acordo com os protocolos do fabricante. ponto final RT-PCR realizada com vários números de ciclo, 28-35 ciclos. Como um controlo interno, da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (

GAPDH) foi amplificado com 21 ciclos para garantir a qualidade e quantidade de ADNc para cada RT-PCR. Os produtos amplificados foram carregados para geles de agarose a 2% ou quantificados por RT-PCR quantitativo utilizando LightCycler ADN mestre SYBR Green I (Roche Diagnostics; # 04707516001). Os programas de amplificação para PCR foram repetidos para 40 ciclos para GAPDH e 45cycles para outros genes, excepto para GAPDH. Os produtos de PCR foram clonados no vector de T-pMD20 usando um kit de clonagem TA poderoso (Takara BIO INC; # 6028), e, em seguida, sequenciados directamente. As sequências dos iniciadores e tamanhos de produtos PCR são mostrados na Tabela S1.

análise de metilação

extraiu-se DNA genómico a partir de células de murídeo e linhas GC humanos pelo método de fenol-clorofórmio, e, em seguida, levada a cabo bissulfito modificação e o procedimento MSP. tratamento com bissulfito de ADN foi realizada com o EZ Metilação de DNA-ouro (Zymo Research; # D5006), e em seguida de PCR (MSP) específicos para a metilação foi conduzido. Resumidamente, a reacção de PCR foi realizada durante 35 ciclos em 25 ul de uma mistura compreendendo ADN modificado com bissulfito, 2.5μl de 10x tampão PCR, 1,25 ul de 25 mM de dNTPs, 25 pmol /l de cada iniciador e 1 U de polimerase JumpStart RedTaq (Sigma ; # D0563). As condições de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 5 minutos; 35 ciclos de 95 ° C durante 1 minuto, 53 ° C durante 2 minutos, e 72 ° C durante 1,5 minutos; e uma extensão final a 72 ° C durante 5 minutos. Tal como para os tecidos do rato GC, o DNA foi extraído de tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina (FFPE). ADN bissulfito foi amplificada com iniciadores de PCR que flanqueiam e MSP, em seguida, foi realizado aninhados [25, 26]. As sequências dos iniciadores e tamanhos de produtos de PCR são apresentados na Tabela S2

cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

O ensaio ChIP foi realizada utilizando um kit ChIP-IT Express (Motif ativa; # 53008). de acordo com o protocolo do fabricante. enriquecimento ADN imunoprecipitado foi normalizada como para a entrada. Os anticorpos utilizados neste estudo foram anti-histona H3K4me3 (Motif ativa; # 39915), (Motif ativa; # 39765) anti-H3K9me3, anti-H3K27me3 (Motif ativa; # 39155), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-SP1 (Abcam; # ab13370), e (motivo Activo; # 39163) anti-Histona H3 anticorpos. IgG normal de coelho (Cell Signaling Technology, # 2729s) foi utilizado como um controlo negativo para o chip. As sequências dos iniciadores e tamanhos de produtos de PCR são mostrados na Tabela S2.

análise Knockdown usando pequenos RNAs de interferência

knockdown à base de siRNA de

Suv39h1

e

Suv39h2

foi realizada utilizando um (sistema de transfecção de néon, Invitrogen), a electroporação de acordo com as instruções do fabricante. células DMLU foram transfectadas com 50nM siRNA de Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226) ou controle negativo siRNA (Missão siRNA Universal Negative Control, Sigma). Após 48 horas de cultura, as células foram colhidas para RT-PCR, análises de Western blot, a migração, invasão e ensaio de proliferação.

Análise Western Blot

GC células foram lisadas com tampão RIPA Pierce (Thermo Scientific; # 89900). As proteínas foram separadas em géis de SDS-poliacrilamida e, em seguida, transferido para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas, seguido por incubação com anticorpos dissolvidos em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 2% de leite desnatado e 10% de Tween 20. Os anticorpos primários utilizados neste estudo foram monoclonal de ratinho anti-TWIST1 (1: 100, Santa Cruz Biotecnologia; # SC-81417), anticorpos policlonais de coelho anti-SP1 (1: 200, motivo Activo; # 39058), e anticorpo monoclonal de ratinho anti-α-tubulina ( 1: 200, Santa Cruz; # sc-8035) anticorpos. Os anticorpos secundários eram anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (1: 3000, Bio-Rad Laboratories; # 1706518) e anti-IgG de ratinho (1: 3000, Bio-Rad Laboratories; # 1706520). As manchas foram desenvolvidos com ImmunoStar AP Substrato (Bio-Rad Laboratories; # 1.705.018)

Imunohistoquímica

seções FFPE (4 mm) foram desparafinados em xileno, reidratados em soluções de etanol classificados e, em seguida, a recuperação Antigen. foi realizada em tampão de ácido cítrico 10 mM, por microondas. A imuno-histoquímica foi realizada utilizando anticorpos anti-TWIST1 (Santa Cruz, 1:20), como descrito anteriormente [19]. Expressão de TWIST1 foi definida como a coloração nuclear positiva em mais de 10% das células, e a intensidade foi marcado como- (negativo), + (fraco) e ++ (moderada a forte) por três investigadores independentemente.

Resultados

expressão TWIST1 em murino e linhas de células GC humanos

A partir de tecidos de camundongos DGC DCKO,

TWIST1

linhas celulares de transcrição-positivas (DMLU-7, MDGC- 8 e MDGC-9) e linhas de células negativas (MDGC-1 e MDGC-3) foram estabelecidos (Figura 1A e Figura S2A), e a expressão de proteína TWIST1 foi confirmada em cada linha celular (Figura 1B). TWIST1 expressão foi aumentada aos níveis de mRNA e proteína em células MDGC expressão negativa TWIST1 após o tratamento com o agente de ADN desmetilação 5-aza-dC (Fig 1C e 1D), enquanto que a sua expressão não foi mudado após o tratamento com TSA inibidor da desacetilase de histona (S2B FIG). Em oito linhas de células humanas examinadas GC,

TWIST1

expressão foi regulada negativamente em quatro linhas de células (Fig 1E, esquerda), três (KATO-III, e GCIY AGS) dos quais demonstrou a re-activação de

expressão TWIST1

após o tratamento com 5-aza-dC por RT-PCR (exemplo, a Fig 1E, direita). Quanto a

TWIST1

linhas celulares GC expressão positiva, depois de 5-aza-dC tratamento, 2.1- e 3,2 vezes aumento da regulação do

TWIST1

foi detectado em MKN45 e MKN7, respectivamente, por qRT-PCR, enquanto que a expressão TWIST1 não foi alterado em MDGC-9 células (Figura 1F).

(a) a análise de RT-PCR de

TWIST1

expressão de ARNm em linhas de células de ratinho GC cinco MDGC-1, 3-MDGC, MDGC-7, 8-MDGC e MDGC-9) a partir de ratinhos DCKO. Rato

GAPDH

foi usado como um controlo interno. (B) Expressão da proteína em células TWIST1 MDGC por Western blot. α-tubulina foi utilizada como um controlo interno. (C e D) Efeito de um agente de desmetilação de ADN em células MDGC. Após o tratamento com 5-aza-DC,

TWIST1

expressão foi regulada para cima no mRNA (C) e os níveis de proteína (D) em TWIST1 células DMLU-1 e DMLU-3 expressão negativa, mas não em TWIST1 células MDGC-9-expressão positiva. M, simulada; A, 5-aza-dC. Análise (E) por RT-PCR de

TWIST1

expressão de ARNm em linhas de células humanas de GC (KATO-III, GCIY, AGS, MKN74, MKN7, MKN45, e NUGC4 HSC60) (à esquerda).

TWIST1

expressão foi regulada para cima no nível do mRNA em células GCIY KATO-III e após o tratamento 5-aza-dC (direita). Human

GAPDH

foi usado como um controlo interno. Análise (F) qRT-PCR de

TWIST1

expressão de ARNm em MDGC-9, MKN7 e células MKN45 com e sem 5-aza-dC tratamento (** P 0,01).

metilação CGI e expressão de

TWIST1

em linhas celulares GC

TWIST1

tem uma região CGI densa a partir do promotor de todo o exão 1, esta região ser altamente conservado entre os vertebrados, incluindo rato e humano (S3 Fig). Para esclarecer o CGI no rato e humano

TWIST1

, foi realizada a análise computacional utilizando UCSC Genome Browser de (https://genome.ucsc.edu/index.html) e MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), que é amplamente utilizado como identificação de CGI e primers MSP [27]. Foram analisados ​​aproximadamente região de 1,4 kb incluindo o promotor e todo o exão 1. UCSC Genome Browser no rato e humano exibiu uma análise CGI na região examinada (dados não mostrados). No entanto, dois locais putativos CGI foram detectados na região em ambos rato e humano, quando foram utilizados os critérios de CGI com teor de GC de 50% e observada /esperada proporção de CpG de 0,8 por MethPrimer (Fig 2A e 2C). Estas duas regiões CGI putativos foram localizados no promotor e do exão 1. Uma vez que a metilação na região promotora foi descrita em vários cancros humanos [12, 14], que inicialmente examinados o estado de metilação da região em murino e linhas de células humanas GC pelo MSP. No entanto, o estado de metilação na região promotora de

TWIST1

não correspondia à sua expressão em todas as linhas de células GC examinados (P1 região, Fig 2A). Para determinar as regiões criticamente metilados associadas à expressão TWIST1 em células DMLU, realizamos mais MSP na região do CGI no exão 1 (E1-1, E1-2 e E1-3), eo site costa CpG previu localizado a cerca de 1,6 kb a partir de TSS (local transcrição início, S1) (Fig 2A). Como resultado, a metilação CGI na região (E1-1 e E1-2) em torno do TSS em

TWIST1

exão 1 foi encontrada para corresponder a expressão do gene em células MDGC, embora não houvesse nenhuma correlação entre -los na região prevista costa (S1) e a extremidade da região do exão 1 (E1-3) (figura 2B, esquerda) em células MDGC. Sem metilação foi detectado em quaisquer regiões CpG em três mucosa gástrica normal, sem expressão TWIST1 de

Atp4b-Cre

–

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

camundongos (Fig 2B). Na mucosa gástrica humana, nenhuma

TWIST1

metilação foi também encontrada em três mucosa gástrica não-cancerosas de pacientes GC (Fig 2D), um dos quais mostraram muito fraco

expressão TWIST1

(dados não mostrados ). Examinámos também quatro mucosa gástrica não-canceroso adicional de pacientes de GC, enquanto que a metilação não foi detectada na região E1-2 em todos os casos (dados não mostrados). sequenciação de bissulfito (BS) demonstraram que a região do CGI no exão 1 mostrou metilação densa em células MDGC-3 Expressão-negativo TWIST1 mas não em TWIST1-positiva MDGC-9 células (BS-C, Figura 2A e 2B, à direita), enquanto há houve diferença nos padrões de metilação entre eles na costa de CpG e regiões promotoras (BS-a-B e BS, S4A FIG). Entre as linhas de células GC humanos, KATO-III e GCIY sem

TWIST1

expressão mostrou metilação CGI densa na região do exão 1 (E1-2) que é consistente com os de rato

TWIST1

(Figura 2C e 2D, esquerda). Ambos metilação e unmethylation na região de E1-2 foram detectados em células MKN45 MKN7 e por sequenciação de MSP e bissulfito (Figura 2D), que são expressas TWIST1 basal, mas os seus níveis de expressão aumentaram após o tratamento com 5-aza-dC (Figura 1F). Assim, os nossos dados indicam que a metilação na região do exão 1 de

TWIST1

detectado neste estudo está correlacionada com a sua expressão.

(A) Representação esquemática da estrutura genómica e a CGI previsto com MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/) do mouse

gene TWIST1

. Dois CGIs (regiões finas azuis, esquerdo, -358 a -149; direita, -96 a 759) foram observados na região do promotor para toda exão 1 (Obs /Exp = 0,8,% GC 50%). A seta curvada indica o local de início da transcrição (TSS). locais CpG individuais são indicados como linhas verticais alaranjadas. As caixas representam o exão. As setas de duas pontas pretas indicam as regiões (S1, P1, E1-1, E1-2 e E1-3) examinados por metilação PCR específico (MSP). As setas azuis de duas cabeças indicam as regiões analisadas pelo ensaio ChIP. As barras vermelhas indicam as regiões analisadas por seqüenciamento bissulfito (BS). (B) Análise de MSP de linhas celulares DMLU e três mucosa gástrica normal a partir de

Atp4b-Cre

–

;

CDH1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

ratos nas cinco regiões (à esquerda). L: alelos não metilados; M: metilado alelos. BS da região 322-670 (BS-c) em DMLU-3 e DMLU-9 (direita). BS-A e BS-b são mostrados na Fig S3. A região MSP de E1-2 e BS-c correspondem a expressão

TWIST1

. círculos pretos representam o site CpG metilado; círculos brancos representam os locais CpG não metiladas. (C) Representação esquemática da estrutura genómica e a CGI previsto com MethPrimer do gene humano

TWIST1

. Dois CGI (esquerda, -369 a -138; direito, 91-742) foram observados (obs /Exp = 0,8,% GC 50%). (D) MSP e BS análises de linhas de células GC humanos e três mucosa gástrica não-cancerosas de pacientes do GC. Foram avaliados quatro regiões (esquerda, P1, E1-1, E1-2 e E1-3) e exão 1 (direita, 315 a 651, BS-c) no ser humano

Torção 1