Abstract

O câncer colorretal (CCR) é a terceira neoplasia maligna mais comum no mundo. O risco de morte está estreitamente correlacionada com a fase de CRC, no momento do diagnóstico primário. Por conseguinte, existe uma necessidade premente para a identificação de biomarcadores de sangue que pode permitir a detecção precoce de CRC. Nós usamos uma abordagem proteômica quantitativa, com rotulagem isobaric (iTRAQ) para examinar as mudanças no proteoma do plasma de 10 pacientes com CCR em comparação com voluntários saudáveis. -Enzyme Linked Immunosorbnent Assay (ELISA) e Western blot foram utilizados para validação adicional. Na nossa análise quantitativa proteómica, foram detectados 75 proteínas de plasma humano com mais de 95% de confiança utilizando rotulagem iTRAQ em conjunto com microQ-TOF MS. 9 regulada para cima e para baixo as proteínas 4-regulados foram observadas no grupo de CRC. O nível no plasma ORM2 foi confirmado para ser significativamente elevados em pacientes que sofrem de CRC em comparação com os controlos. expressão ORM2 em tecidos CRC foi significativamente aumentada em comparação com a de correspondente mucosas normais adjacentes (

P Art 0,001). ITRAQ em conjunto com Q-TOF /MS é uma técnica sensível e reprodutível de proteómica quantitativos. A alteração na expressão de ORM2 sugere que ORM2 poderia ser utilizado como um biomarcador potencial no diagnóstico de CRC

citação:. Zhang X, Z Xiao, Liu X, Du L, Wang L, Wang S, et al. (2012) o papel potencial da ORM2 no desenvolvimento de cancro colorectal. PLoS ONE 7 (2): e31868. doi: 10.1371 /journal.pone.0031868

editor: Anthony W. I. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 07 de novembro de 2011; Aceito: 13 de janeiro de 2012; Publicação: 21 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Concessão contrato patrocinador: Fundação Nacional Clinical Key Especialidade. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em 2009, a American Cancer Society estima um total de 146.970 novos casos de cancro colorectal (CRC) e 40% de mortes nos Estados Unidos. CRC é esperado para ser o terceiro câncer mais comum nos Estados Unidos. Desde 1975, verificou-se uma melhoria notável em CRC taxas relativas de sobrevivência de 5 anos, como um resultado de diagnóstico precoce e melhorando tratamentos [1]. Sigmoidoscopia melhorou significativamente a taxa de detecção de CRC. No entanto, a sua ampla aplicação ainda é limitada devido aos altos custos e os inconvenientes. Assim, são necessários marcadores tumorais com base em soros específicos para o diagnóstico precoce e prognóstico.

marcadores de plasma /soro (por exemplo, antigénio carcinoembrionário, CEA) estão os marcadores de tumores mais amplamente utilizado e fiáveis ​​para CRC porque são facilmente medidos quantitativamente , reprodutível e de baixo custo. Embora as diretrizes atuais da Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) recomendam que os níveis de CEA deve ser monitorada a cada 2-3 meses por pelo menos 2 anos após o diagnóstico, não há um consenso claro sobre a validade da monitorização CEA [2]. Vários estudos [3] – [5] questionado o valor de CEA como um marcador de CRC recorrência, especialmente em pacientes com níveis de CEA pré-operatórios normais. Devido a estes problemas, os novos biomarcadores são necessárias para melhorar a detecção precoce e a predição da recorrência para todos os tipos de CRC. Diferentes padrões de proteômica no soro apresentam novas oportunidades para desenvolver novos, ferramentas de diagnóstico altamente sensível para a detecção precoce dos cancros [6].

Na literatura, as tecnologias proteômicas foram usados ​​para estudar marcadores biológicos CRC. Nestes estudos, as estratégias de proteómica tais como bidimensional electroforese em gel de poliacrilamida (2-D PAGE), diferencial de fluorescência bidimensional em electroforese em gel (2-D DIGE), desadsorção por laser melhorada da superfície tempo /ionização de espectrometria de massa de voo (SELDI -TOF MS) de tecnologia e proteínas matrizes têm sido utilizados, mas ninguém pode avaliar com precisão o nível de cima ou para baixo-regulação dos biomarcadores propostas. Portanto, é difícil de determinar as suas especificidades e validade em estudos cegos das amostras de [7], [8]. Para descobrir novos biomarcadores de plasma, uma nova abordagem com isobáricas Tags relativa e absoluta quantificação (iTRAQ) foi aplicado [9]. A incorporação de isótopos estáveis ​​em um reagente amina de marcação está envolvido neste processo de marcação química. Utilizando espectrometria de massa, as proteínas podem ser detectados de forma segura e permitir a quantificação de uma forma comparativa multiplex. O núcleo desta metodologia é um conjunto multiplexado de reagentes isobáricos que produzem peptídeos amina derivatizado. Os peptídeos derivados são indistinguíveis em MS, mas exibem intensas íons de assinatura de baixa massa MS /MS que suportam quantificação. Este método dá uma diferença de massa como a base para a quantificação por medição das áreas relativas dos picos de MS e /ou espectros de massa MS /MS. Hoje em dia, os reagentes 4-plex e 8-plex disponíveis comercialmente podem ser utilizados para marcar as amostras de proteína de interesse após digestão com tripsina. Diferentes etiquetas isobárico, este método sugerem que, em uma única análise de espectrometria de massa, até 4 ou 8 amostras diferentes, uma das quais é uma referência, pode ser simultaneamente analisada. Dada esta razão, a abordagem iTRAQ é proposto como muito promissores na descoberta de biomarcadores em amostras com uma vasta gama de plasma, fluidos corporais e tecidos.

Neste estudo, foi acoplado com iTRAQ microQ-TOF /MS para detectar proteínas expressas diferenciais no plasma de pacientes e controlos de CRC. Entre as proteínas que foram elevados no CRC plasma, 9 proteínas foram up-regulada, e 4 foram regulados negativamente. Discutimos as suas possíveis funções e verificado ORM2 que pode ser um potencial biomarcador sorológico para (as) pacientes de CRC. A função específica da proteína ainda não foi determinada; No entanto, ORM2 parece funcionar na modulação da actividade do sistema imunitário durante a reacção de fase aguda, que talvez desempenhar um papel potencial no desenvolvimento precoce da CRC. Evidências crescentes indicam que a inflamação associada a tumores pode promover o desenvolvimento e progressão do tumor, enquanto o desenvolvimento e progressão do tumor poderia induzir a inflamação, que podem desempenhar um papel fundamental em todas as fases da tumorigénese. Tais moléculas inflamatórias podem ser detectados em amostras de sangue de pacientes cancaer e pode ser ter um papel potencial na detecção precoce do cancro. Neste estudo, o aumento da regulação do ORM2 foi confirmada por ELISA no plasma de pacientes com doença do sistema intestinal.

Resultados

identificação de biomarcadores candidatos por microQ-TOF MS

para profiling proteína microQ-TOF MS, amostras de plasma de 10 pacientes CRC e 10 indivíduos do grupo controle foram coletados (2 ml de plasma de cada indivíduo) e depois misturados para formar um pool de amostra para teste adicional. 100 pi de amostras obtidos a partir de cada grupo foi de 12 Imunodeprimido proteínas do plasma abundantes por técnica de coluna de imunoafinidade tal como descrito em Métodos.

amostras de plasma Imunodeprimido foram digeridas com tripsina, marcado com um marcador isobárica único, combinadas e analisadas simultaneamente pela microQ-TOF MS. grupo CRC foi marcado com iTRAQ-114 e o grupo de controlo saudável foi marcado com iTRAQ-117 e, em seguida, separado por cromatografia de permuta catiónica forte e C18 fraccionamento. 75 proteínas foram identificadas por microQ-TOF MS com ≥95% de confiança. Entre este grupo, foram seleccionadas 13 proteínas diferencialmente expressas com base em 1,5 vezes a sobre-expressão e 1,5 vezes sob-expressão em pacientes com CCR, em comparação com os voluntários saudáveis. Nove das 13 proteínas de proteínas diferencialmente expressas foram regulados positivamente (Tabela 1). Três proteínas foram encontrados para ser significativamente elevada no grupo de CRC (com razões de 1,3-4,4). Quatro proteínas foram regulados negativamente em pacientes de CRC, e os seus níveis de expressão são apresentados na Tabela 2. A variância estatística de tumor contra proporções normais estava dentro do nível de confiança de 95 (P = 0,05).

Medição da ORM2 em amostras de plasma

Como se mostra na Fig. 1, os níveis ORM2 plasma em uma escala logarítmica em parcelas box-and-suiça, as concentrações ORM2 plasma medianas foram significativamente maiores no CRC em relação ao colorectum normal, pólipo hiperplásico e adenoma (todos em P 0,001, respectivamente). O nível ORM2 plasma foi significativamente maior em pacientes com DII do que no colorectum normal, pólipo colorretal hiperplásico e adenoma (todos em P 0,001, respectivamente) e foi significativamente maior em pacientes com DII do que no CRC (

P Art . 0,05)

a estrela (estrelas) na figura significa um sinal para análise estatística. Uma estrela significa P 0,05 e o sinal com três estrelas significa P 0,001. CRC é estatisticamente diferente da colorectum normal, pólipo hiperplásico e adenoma (todos a P 0,001, respectivamente); DII é estatisticamente diferente do normal do pólipo hiperplásico colorectum e adenoma (todos a P 0,001, respectivamente). IBD é estatisticamente diferente de cancro colorectal (P 0,05).

Foi avaliado se ORM2 plasma poderia distinguir CRC de doenças colorretais benignos. Temos procurado por correlação (idade, sexo, estágio TNM e grau histológico) entre os níveis ORM2 plasma e os parâmetros clínico do paciente CRC (Tabela 3). Nenhuma associação significativa foi encontrada entre as concentrações ORM2 plasma e idade, sexo, estágio TNM ou grau histológico.

Medição da ORM2 em amostras de tecido

análise de Western blot foi utilizada para determinar a expressão de ORM2 em tecidos. Quando a expressão da proteína foi medida por densitómetro, o valor médio do densitómetro ORM2 em tecidos de cancro da BF foi significativamente maior do que em tecidos de mucosas normais adjacentes correspondentes (

P

0,01). (Fig. 2)

Discussão

Nos últimos anos, proteômica baseados biomarcador descoberta do soro /plasma ganhou impulso. Um número de estudos tentaram utilizar abordagens proteomic para a descoberta de novos biomarcadores para pacientes de CRC [10] – [14]. Estudos realizados por Yong-Kim Sam [10] revelou 26 candidatos a biomarcadores para CRC por combinado 2-DE e nano-LC-FT-ICR /LTQ MS. Ma et al [11] identificadas 4 proteínas com potencial diagnóstico por SELDI investigando o proteoma do soro de 62 pacientes CRC e 31 indivíduos não-cancerosas. No entanto, as questões relativas à complexidade e alcance dinâmico de proteínas constituintes têm tornado difícil obter dados significativos para interpretação. Tanto o soro e plasma mostram enorme variação na abundância da proteína individual. LC-MS /MS abordagens para a análise de soro /amostras de plasma proporcionam muito melhor dinâmica capacidades de intervalo. Além disso, os reagentes iTRAQ ganharam interesses neste campo como uma ferramenta útil na descoberta de biomarcadores de proteínas. É o primeiro estudo para combinar iTRAQ com Q-TOF /MS em amostras de plasma de pacientes com CCR para descobrir potenciais biomarcadores para CRC. 13 proteínas com diferentes padrões de expressão em CRC plasma foram identificados com sucesso. Entre estes 13 proteínas, houve diversas proteínas de interesse, tais como ORM2, inibidor da peptidase Serpina (subtipo D), NADH subunidade desidrogenase 5 (ND5) e retinol proteína de ligação 4 (RBP4), que foram seleccionados como candidatos benéficas e podem ser ainda mais investigada. ORM2 (glicoproteína alfa-1-ácido), um membro da família de proteínas de fase aguda encontrado para ser relacionado com a doença sistema intestinal [15] – [18], foi seleccionado para posterior investigação e verificação

. sabe-se que os cancros são acompanhadas por numerosas mudanças fisiológicas e bioquímicas sistémicas, incluindo glicosilação que é uma das mais importantes modificações pós-traducionais das proteínas. Mais e mais as atenções estão sendo pagos em estudar glicosilação aberrante durante vários estados fisiopatológicos, incluindo a inflamação [19], artrite [20], [21], e câncer [22], [23]. Durante a organização dos nossos dados, encontramos várias proteínas glicosiladas sorológicos como ORM2, EpCAM mudando em níveis durante o desenvolvimento do câncer. Nesta pesquisa preliminar, que relatou ORM2 como um novo membro dessas glicoproteínas associados ao câncer. Wandall [24] utilizado um romance microarray O-glicopéptido para rastrear perfis seromic de pacientes com cancer.Dai colorrectal [25] trabalhada individualmente a mudança de glicoproteínas indirectamente. Estes relatórios incentivar um outro ângulo para descobrir biomarcadores clínicos para diagnóstico e prognóstico

Há vários relatos de ORM2 em doenças do sistema intestinal e câncer [15] -. [18], [26]. ORM2 foi considerado estar relacionado com a permeabilidade capilar [15]. A função de orosomucoide foi relatado para ser ligada com a inflamação e cancro. A concentração de S-orosomucoide foi encontrado para ser aumentada em pacientes com doença de Crohn [16]. Comparando pacientes com câncer de bexiga com controles saudáveis, houve diferenças significativas, com muito mais orosomucoide expressa no grupo de câncer [17]. Fenômeno semelhante pode ser encontrado também em pacientes com carcinoma brônquico [18]. Usando a 2-D DIGE e posteriormente analisado por espectrometria de massa MALDI-TOF em pacientes com polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, significante sobre-regulação de alfa-1-glicoproteína ácida, um precursor foi identificado [26]. Os estudos indicaram que CEA, semelhante ao alfa 1-glicoproteína ácida (orosomucoide) em imunologia é postulada como um precursor biossintético de alfa 1-glicoproteína ácida [27].

Este é o primeiro relatório de um aumento da regulação ORM2 de CRC em plasma. Além disso, a sobre-regulação de ORM2 foi confirmada por ELISA no plasma de pacientes com doença do sistema intestinal. Verificou-se que ORM2 estavam significativamente aumentados em pacientes que sofrem de DII CRC e comparados com os indivíduos normais e pacientes com pólipos hiperplásico e adenoma. ORM 2 é uma proteína de fase aguda do plasma chave na inflamação, assim que esta proteína é classificado como um reagente de fase aguda. A função específica da proteína ainda não foi determinada, no entanto, ORM2 parece funcionar na modulação da actividade do sistema imunitário durante a reacção de fase aguda. Esta pode servir como um mediador potencial de fuga imune em CRC e a detecção de ORM2 pode ser significativa na carcinogénese colorrectal distintiva de IBD.

Para determinar a fonte da ORM2, o tecido tumoral e CRC correspondentes tecidos normais adjacentes mucosas foram avaliadas por transferência de Western. Os resultados mostraram que o nível de expressão de ORM2 em tecidos de cancro da BF foi encontrada para ser mais elevada do que no tecido normal. Por isso, propõe-se que ORM2 podem estar envolvidos na carcinogénese em pacientes com cancro da CRC.

Este estudo também fornece evidências de que os níveis de ORM2 em pacientes de CRC pode ser útil como um biomarcador para diagnóstico. ensaios de soro CEA não são recomendadas para triagem de pacientes assintomáticos para o câncer. Uma razão é que o ensaio de CEA no plasma não é suficiente de diagnóstico para discriminar entre tumores malignos e distúrbios benignos localizados. Em nosso estudo, a detecção de ORM2 usando ELISA e Western blot é promissor. As concentrações plasmáticas de ORM2 foram significativamente maiores no CRC em comparação com o colorectum normal, pólipo hiperplásico e adenoma (P 0,001). Portanto, utilizando ORM2 para monitorizar potenciais pacientes de CRC pode ser uma boa maneira para validar se ORM2 pode ser usado para o rastreio de pacientes assintomáticos. No entanto, é importante analisar ainda mais o significado diagnóstico de ORM2 por um grande número de pacientes em vários centros antes da aplicação clínica final para o diagnóstico CRC.

inibidor Serpin peptidase, clade D (heparina cofactor), o produto codificado cofactor de heparina que partilha homologia com a antitrombina III e outros membros da alfa 1-antitripsina superfamília pode inibir rapidamente a trombina na presença de heparina. Defeitos em SERPIND1 são a principal causa de deficiência de cofactor II da heparina, e deficiência de cofactor II da heparina pode levar ao aumento da geração de trombina e um estado a-hipercoagulabilidade. Isto é desvantajoso para o desenvolvimento de cancro. Há vários relatórios sobre clade A e E em cânceres [28], [29], mas poucos no subtipo D. proteína semelhante também foi identificado como um precursor de alfa-1-antiquimotripsina. Alfa-1-antiquimotripsina pertence à família das serpinas, é altamente expresso em astrócitos e tem sido encontrado para desempenhar papéis na patogénese de placas clássicas com a doença de Alzheimer. Como um factor de fase aguda, que pode inibir a actividade de macrófagos ectoenzimas e metaloproteinase de matriz-9 durante a cicatrização de feridas [30], mas induz a produção de TNF-α no estudo de linhas celulares microgliais [31]. Este tipo de inibidor de protease foi relatado para formar complexos com a família das calicreínas, tais como hK3 (também conhecida como um antigénio específico da próstata), hK2 e HK6, e pode ser aplicado no diagnóstico de cancros da próstata [32].

Entre as proteínas reguladas de deslocamento, ND5, uma subunidade essencial do conjunto complexo mitocondrial I [33], [34], desempenha um papel importante no processo de fosforilação oxidativa, bem como na carcinogénese. Alguma literatura indicou que ND5 poderia induzir hepatomas [35]. DNA mitocondrial (mtDNA) têm sido relatados em muitos tipos de cânceres. defeitos genéticos mtDNA podem estar envolvidos nos mecanismos patogênicos de manifestação fatal [36]. mutação frame-shift em genes ND5 foi reportado no carcinoma hepatocelular, e também em lesões pré-neoplásicas do tracto gastrointestinal [37]. Neste estudo, identificaram-ND5 (67 kDa) como um candidato potencial, mas o seu papel preciso na carcinogénese ainda necessita de mais investigação, especialmente as mutações.

RBP4, uma citocina secretada pelo tecido adiposo, é um romance adipocina ligada com a obesidade e resistência à insulina de diabetes tipo 2. RBP4 também foi demonstrada para ser envolvida, em certa medida, no desenvolvimento de inflamação e cancro. Por exemplo, RBP4 metilação foi investigada em carcinoma epidermóide de esôfago [38]. No carcinoma colorrectal, o nível de RBP diminui [39]. Em nosso estudo, identificamos RBP4 como um candidato potencial, mas uma investigação mais aprofundada da sua função na patogênese de desenvolvimento de câncer é necessária.

Neste estudo preliminar de prova de princípio, a Tabela 1 e Tabela 2 lista de 13 candidatos biomarcadores para CRC. A maioria destes não têm sido relatados como biomarcadores de câncer, que mostraram que iTRAQ juntamente com Q-TOF /MS é uma técnica sensível, reprodutível, robusto para identificar diferenças estatisticamente significativas de pacientes betweenCRC expressão de proteínas e amostras de controlo de plasma saudáveis. A partir da verificação de ORM2, verificou-se que ORM2 pode ser um potencial biomarcador para distinguir CRC do IBD. Em estudos futuros, as populações de amostras maiores serão necessários para confirmar esses biomarcadores potenciais. Em nossa pesquisa, ORM2 é primeiramente identificada como uma proteína diferente regulamentada em pacientes com CCR, em comparação com controles normais com triagem proteómica. No entanto, isso requer uma grande quantidade de experiências de bancada e ensaios clínicos antes ORM2 pode ser utilizado como um biomarcador fiável. Vamos continuar nosso estudo sobre ORM2 em dois aspectos. Em primeiro lugar, estamos a estabelecer uma plataforma para distinguir e analisar as relevâncias de níveis distintos sobre modificações padrão glicosil a várias fases de desenvolvimento de doenças com base em ORM2. Ao mesmo tempo, estamos também muito interessados ​​na função de ORM2 na progressão do tumor devido a ela regula a homeostase de lipídios e proteínas de controle de qualidade na membrana do retículo endoplasmático.

Métodos

A preparação das amostras

Este estudo foi aprovado e monitorado pela Comissão de Ética da Qilu Hospital, Universidade de Shangdong. As amostras de plasma para proteômica de 10 CRC grupo pacientes e 10 controles saudáveis ​​foram coletadas (Tabela 4). Para cada pessoa, 2 mL de sangue foi obtido por punção venosa e recolhidos num tubo com EDTA e o plasma foi preparado tal como recomendado pelo HUPO proteoma do plasma Projecto [40]. Houve um total de 419 temas para ELISA, que foram classificados em cinco categorias por, endoscópica radiológica clínica padrão e critérios histológicos: o controlo normal (n = 65), pólipo hiperplásico (n = 59), doença inflamatória intestinal (DII) (n = 62), adenoma (n = 53) e CRC (n = 180). Para Western blot, com um total de 41 pacientes diagnosticados como CRC sequenciais foram avaliadas. espécimes de tumor e tecidos correspondentes mucosas normais adjacentes ( 5 cm da margem do tumor) foram recolhidas e armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. Nenhum paciente neste studyreceived qualquer tipo de terapia, tais como a radiação ou quimioterapia.

imunodepleção de proteínas do plasma de alta abundância

Plasma amostras de 10 pacientes CRC e 10 indivíduos no controle grupo foram recolhidas (2 ml de plasma de cada indivíduo) e, em seguida, misturadas para formar uma piscina de amostras para teste adicional. amostras de plasma reunidas foram esgotados dos 12 melhores proteínas mais abundantes (albumina, IgG, IgA, IgM, transferrina, fibrinogênio, α

2-macroglobulina, α

1-antitripsina, haptoglobina, α

1-ácido glicoproteína, apolipoproteína AI, e apolipoproteína a-II), utilizando a 2 ml de coluna de afinidade LC Seppro ™ MIXED12 pré-embalado (Genway Biotech, San Diego, CA) em um 1100 sistema de séries de HPLC Agilent (Agilent, Palo Alto, CA) de acordo para o procedimento recomendado pelo fabricante.

Após o esvaziamento, as proteínas precipitadas foram dissolvidos por tampão de lise (Ureia 6 M, 4% de CHAPS, 1 mM de PMSF, 2 mM de EDTA). As concentrações de proteína foram determinadas pelo kit 2D Quant (GE Healthcare, EUA), utilizando albumina como padrão de referência (1 ug /uL-10 ug /ul). As concentrações foram medidas a 4,83 mg /mL (o grupo CRC) e 2,27 mg /mL (o grupo saudável)

Trypic digeston e iTRAQ reagente de rotulagem

Após redução (DTT 10 mM, 100. NH4HCO3 mM, 56 ° C, 45 min) e alquilação (IAA 55 mM, 100 mM NH4HCO3, 45 min), cada amostra (100 ug) foi digerido com tripsina e marcadas com reagentes iTRAQ. Estas amostras foram digeridas no tampão de dissociação (trypsin:protein = 01:30) durante a noite a 37 ° C. Os péptidos foram marcadas com reagentes iTRAQ 114 (para o grupo de CRC, 117 para o grupo saudável).

cromatografia de permuta catiónica forte e C18 coluna de fraccionamento

cromatografia de permuta catiónica forte foi usada para remover o redundante reagentes iTRAQ e substâncias interferentes que podem afectar a análise MS. As amostras marcadas foram adicionadas a 10 × tampão A (KH2PO4 10 mM em acetonitrilo a 25%, pH 3,0). cromatograf ia de permuta catiónica de alta resolução, em seguida, foi executada para separar as amostras marcadas em 10 fracções. Os péptidos foram eluídos com um gradiente linear de KCl 0~500 mm (25% v /v de ACN, 10 milímetros de KH2PO4, pH 3) ao longo de 15 min a uma velocidade de fluxo de 1 ml /min, com fracções recolhidas em 1 min intervalos. As amostras foram dessalinizadas e ainda fraccionado utilizando uma coluna C18 de HPLC à escala nanométrica (PROXEOME, América), seguido por análise de MS. O gradiente foi 5~40% ACN em 70 min.

Matrix assistida a laser dessorção de ionização de tempo de voo (MALDI-TOF) /TOF e microQ-TOF análise

Os parâmetros da máquina foram definidos como , fonte de íons de 25 kV para fatoração positiva matriz (PMF) e 8,0 kV para o conjunto MS /MS reflector 26,3 kV para PMF e 29,5 kV para TANDEM MS /MS, lente de 9,5 kV para PMF e 3,5 kV para o conjunto MS /MS, levante 19,0 kV e os espectros foram adquiridos em modo de reflexão em MALDI TOF /TOF com faixa de massa 700~4000. Os picos com uma proporção de S /N superiores a 5 foram marcadas automaticamente por FlexAnalysis (Bruker, Alemanha). Foram selecionados os picos com intensidade PMF massa de mais de 5000 para mais de MS /MS. Os espectros foram adquiridos em modo de ião positivo em microQ-TOF com intervalo de massa 50~3000, e o gás seco e o gás nebulizador foram definidos como de 3 L /min, e 2 L /min, respectivamente. A temperatura da câmara de spray foi fixada a 150 ° C, e a força do campo eléctrico foi definido como 1400 V, a energia de colisão foi definida como 35% de temporização para baixo de massa de iões e 65% de temporização para massa elevada de iões. Outros parâmetros foram definidos como padrão.

Banco de Dados de pesquisa

Os espectros foram processados ​​com controle microQ-TOF 3.0 (Bruker, Alemanha) usando as configurações padrão, exceto que os parâmetros de RF funil de transferência e de colisão celular de RF foram definidos como 120 Vpp e 600 Vpp, respectivamente. A análise dos dados subsequentes foi realizada utilizando a análise dos dados Biotools 4,0 3,0 (Bruker, Alemanha), deformar-LC 2,0 (Bruker, Alemanha), e 2,2 Mascot (Matrix Ciência, Londres, Reino Unido), respectivamente. identificação de proteínas foi realizada através de pesquisa no banco de dados Swiss-Prot Human2009-12 com um ião precursor e tolerância massa fragmento tanto definido como 0,04 Da. Carbamidomethylation de cisteínas foi definido como modificação fixo, e a oxidação de metioninas, iTRAQ 8 Plex de modificação do terminal N, K e Y foram considerados como modificações variáveis, respectivamente. Um máximo de mis-clivagem foi aceito. Os pontos de corte da contagem de iões foram criados a 25, para peptídeos e proteínas para 68. identificações de peptídeos foram aceitos se eles poderiam ser estabelecida a mais de 90,0% de probabilidade, conforme especificado pelo algoritmo PeptideProphet. identificações de proteína foram aceites se poderia ser estabelecida a mais de 90,0% de probabilidade ou continham pelo menos 2 peptídeos identificados. As proteínas que continham péptidos semelhantes e não podiam ser diferenciados com base na análise por MS /MS sozinho foram agrupados de modo a satisfazer os princípios de parcimónia. Para a classificação, os símbolos ontologia gênica (GO) das proteínas identificadas foram curadoria usando o banco de dados XRef e consultado no banco de dados ontologia gene usando a ferramenta GoMiner (https://discover.nci.nih.gov/gominer/index.jsp ). Previsão da origem das proteínas com localização celular desconhecido foi realizada utilizando o PSORT II (https://www.psort.org/).

Todos proteína rácios iTRAQ foram transformados basear 2 valores de logaritmos. Na base 2 espaço logaritmo, uma mudança de 2 vezes nos níveis foi relatado como 1 ou -1 para up-regulada e mudanças regulada para baixo, respectivamente.

Elisa para ORM2

níveis

ORM2 em no plasma foram quantificados utilizando um kit ELISA disponível comercialmente (Fundamentação Biotecnologia diagnosticar, San Diego, CA), de acordo com as instruções do fabricante.

Western blotting para ORM2

os tecidos tumorais e correspondentes tecidos normais adjacentes mucosas foram re-suspensas em radioimunoprecipitação (RIPA) de tampão arrefecido com gelo para a lise. Um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, Biotecnologia, China) foi utilizado para o ensaio de proteína. Cerca de 25 ug de proteína de amostras foi carregado, separadas em géis de poliacrilamida a 9,0% de Tris-glicina-SDS e depois electro-transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno. Após o bloqueio com leite magro a 5%, as membranas foram incubadas com Ab ORM2 (1:150, tecnologia biológica Yueyan, Xangai, China) ou anticorpo monoclonal de murganho anti-actina-β (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante a noite a 4 ° C. As membranas foram incubadas adicionalmente com rato policlonal anti-cabra conjugado com HRP de anticorpo secundário (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou de cabra policlonal anti-murganho de anticorpo secundário conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 2 h a temperatura do quarto. As bandas foram detectadas utilizando um kit de detecção por quimioluminescência (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). A intensidade de cada banda foi quantificada utilizando ImageJ 1,32 software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) após a digitalização densitométrica dos filmes.

A análise estatística

O teste de Kolmogorov-Smirnov foi realizado para determinar a distribuição das amostras de cada grupo. Os dados foram expressos como (intervalo inter-quartil, 1IQR) mediano. Um teste não-paramétrico (teste de Kruskal-Wallis) foi aplicado para analisar as diferenças entre CRC e outros grupos. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise estatística foi realizada com SPSS versões de software 13.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, EUA).

Reconhecimentos

Graças ao Dr. Edward C. Mignot, anteriormente da Universidade de Shandong, para o conselho linguística .