Abstract

induzida por estresse fosfoproteína 1 (STIP1) foi recentemente identificada como um biomarcador lançado em câncer de ovário humano. Além disso, STIP1 secretado por células de cancro do ovário humano foi mostrado para promover a proliferação de células tumorais através da ligação a ALK2 (receptor de activina A tipo II-like quinase 2) e activar as vias de sinalização Smad-ID3. Neste estudo, um total de 330 amostras de tumor de cancro do ovário foram avaliados quanto à expressão STIP1 por imuno-histoquímica e analisados ​​para uma possível correlação com as características do paciente e sobrevivência. A quantificação da imunoreactividade foi realizada por aplicação de um sistema de pontuação imuno-histoquímica (histoscore). Pacientes com alto nível de expressão STIP1 (histoscore ≥169) tiveram uma sobrevida significativamente pior (alta STIP1, tempo médio de sobrevivência = 76 meses; baixo STIP1, tempo médio de sobrevivência = 112 meses;

P Art 0,0001). Além disso, histoscores STIP1 foram significativamente maiores nos tumores de alto grau (grau 3) do que no de baixo grau (grau 1-2) malignidades (

P Art 0,0001), sugerindo que STIP1 pode ser um proxy para tumor agressividade. Os resultados da análise multivariada revelou que histoscores alta STIP1, estágios avançados, os tipos histológicos, e a presença de doença residual (≥2 cm) foram preditores independentes de mau prognóstico. A adição de histoscores STIP1 melhorou a previsão de taxas globais e sobrevida livre de progressão no modelo de riscos proporcionais de Cox multivariada. O tratamento de células de cancro do ovário com STIP1 recombinante estimulou a proliferação e migração celular, mas o co-tratamento com anticorpos anti-STIP1 revogados este efeito. Nossos resultados sugerem que a expressão STIP1 pode estar relacionado com o prognóstico e que o caminho STIP1 pode representar um novo alvo terapêutico para o câncer de ovário humano

Citation:. Chao A, Lai CH, Tsai CL, Hsueh S, Hsueh C, Lin CY, et al. (2013) Tumor Stress-Induced Phosphoprotein1 (STIP1) como biomarcador de prognóstico no câncer de ovário. PLoS ONE 8 (2): e57084. doi: 10.1371 /journal.pone.0057084

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de outubro de 2012; Aceito: 16 de janeiro de 2013; Publicação: 27 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência (NSC100-2314-B-182-016MY3 para THW), o Chang Gung Medical Research Foundation (CMRPG391451 /2 para AC, CMRPG 391461/2 para THW), e do Departamento de Saúde ( DOH101-TD-I-111-TM013 para THW, DOH101-TD-C-111-006 para AC e THW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial é uma das neoplasias mais letais que afectam as mulheres [1]. Cerca de 225.500 câncer de ovário novos casos estão ocorrendo em todo o mundo a cada ano, responsáveis ​​por 140.200 mortes [2]. carcinomas ovarianos são um grupo heterogêneo de neoplasias, os quatro subtipos histológicos mais comuns são serosa, endometrioid, de células claras, e mucinoso [3]. A medição do antígeno do câncer de soro 125 (CA125) níveis tornou-se prática padrão para a avaliação pré-operatória de tumores ovarianos [4]. Além disso, CA125 foi demonstrado ser útil para monitorizar a resposta terapêutica e na vigilância de pacientes com cancro epitelial do ovário [5]. No entanto, CA125 não é elevado em todos os tumores ovarianos e não tem valor preditivo positivo suficiente para a avaliação de risco de base populacional ou detecção precoce [6]. Devido às limitações de CA125 como um marcador de doença, há uma necessidade urgente de novos biomarcadores que podem ser usados ​​como indicadores de prognóstico no câncer de ovário para diferenciar de forma eficaz entre a doença agressiva e menos agressivo.

Recentes avanços tecnológicos, especialmente nas áreas de genômica e proteômica, são acelerar a descoberta de novos biomarcadores de câncer [7], [8]. Ao comparar os proteomas do fluido intersticial tumoral (TIF) e o fluido intersticial normal (NIF), que foram recentemente identificados fosfoproteína induzida pelo stress 1 (STIP1) como um biomarcador candidato para o cancro do ovário humano [9]. Os níveis séricos de STIP1 são significativamente mais elevados em pacientes com cancro do ovário do que em controlos saudáveis ​​de idade [9] e diminuem significativamente após a remoção cirúrgica do tumor [10]. Além disso, a medição combinada de CA125 e STIP1 foi mostrado para melhorar a detecção precoce do cancro do ovário [9], apoiar a utilidade clínica de STIP1 como um biomarcador neste malignidade [11].

STIP1, igualmente conhecida como Hsp70 /Hsp90-organização proteína (HOP), proteína sensível à transformação IEF SSP 3521 (IEF-SSP-3521), P60, STI1, STI1L, (GeneID 10963; HPRD 05.454), uma proteína de 62,6 kDa, contém três repeat tetratricopeptide (TPR) domínios [12], que são capazes de interagir com proteínas de choque térmico para formar complexos que participam em diversos processos biológicos variam de splicing de ARN, transcrição, o dobramento de proteínas, a transdução de sinal e na regulação do ciclo celular [13], [14]. Em tecidos neuronais, STIP1 extracelular liga-se a proteínas priões e desencadeia vias de sinalização diferentes – incluindo a proteína quinase activada por mitogénio endógena 1/2 (ERK1 /ERK2), proteína quinase A, e cascatas de sinalização fosfatidilinositol 3-cinase – levando a um aumento na proliferação celular [15], [16], [17]. No cancro do ovário, mostrámos que STIP1 se liga a uma proteína morfogenética óssea (BMP) do receptor – denominado Activina A do receptor, tipo II-like quinase 2 (ALK2) – para activar a via de sinalização SMAD e a activação da transcrição de ID3 (inibidor de ADN de ligação 3) [10]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que STIP1 secretado por células de cancro do ovário humano promove a proliferação de células de cancro, actuando de forma autócrina e /ou parácrina.

Embora a libertação de STIP1 de cancro do ovário humano foi confirmada por um independente grupo de pesquisa [18], alguns dados disponíveis sobre a utilidade da análise imuno-histoquímica STIP1 para avaliar o prognóstico no câncer de ovário [19]. Neste estudo, um total de 330 amostras de tumores de cancro do ovário foram avaliadas para a expressão STIP1 por imuno-histoquímica e analisados ​​para uma possível correlação com as características do paciente e sobrevivência.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado em conformidade com a declaração de Helsínquia e foi aprovado pelo Conselho de Administração do Chang Gung Memorial Hospital (CGMH-IRB # 99-0112B e # 97-1444C) Institutional Review.

os pacientes

Entre 2000 e 2005, um total de 403 pacientes consecutivos com diagnóstico de câncer de ovário no Linkou Centro Médico de Chang Gung Memorial Hospital foram incluídos no estudo. Os tipos histológicos foram como se segue: seroso (n = 160), mucinoso (n = 68), endometrióide (n = 73), carcinoma de células claras (n = 64), e o tipo celular mista (n = 38). Os critérios de exclusão foram os seguintes: (i) os pacientes que se submeteram à terapia neoadjuvante antes da cirurgia definitiva ou que foram encaminhados de hospitais fora após a cirurgia inicial; (Ii) pacientes submetidos à cirurgia laparoscópica como tratamento primário; (Iii) os pacientes que não foram acompanhados nos primeiros três meses após o tratamento primário; (Iv) pacientes com carcinomas indiferenciados provenientes de teratomas; e (v) os pacientes com blocos de parafina patológicas indisponíveis. sobrevivência livre de progressão (SLP) foi calculado como o intervalo de tempo (em meses) a partir da data da cirurgia para a data da progressão da doença documentada (retrospectivamente definida com base na elevação de CA125 no soro e /ou evidência radiográfica de progressão). A sobrevida global (OS) foi definido como o intervalo de tempo entre a data da cirurgia e a data da morte.

Imunohistoquímica

Os arquivos, cortes de tecido de câncer de ovário embebidos em parafina fixadas em formalina foram recuperadas como descrito anteriormente [9], [20], [21]. Os cortes foram corados com um anticorpo primário do rato anti-humano STIP1 monoclonal (Abnova Corp., Taipei, Taiwan; 1:1,800 diluição) utilizando um corante imunohistoquímica automatizada com a Ventana DAB básica (3,3-diaminobenzidina) kit de detecção (Tucson, AZ, EUA). As lâminas foram avaliadas de forma independente por dois patologistas (S. H. e C. H.) que estavam cegos aos dados clínico-patológicos e os patients’identities. A pontuação imuno-histoquímica global (histoscore) foi expressa como a percentagem de células tumorais positivas (0-100%), multiplicada pela sua intensidade de coloração (0 = negativo, 1 = fraco, 2 = moderada, 3 = forte). Portanto, o histoscore totais variou de 0 a 300 [22]. A validação da especificidade do anticorpo anti-STIP1 foi realizada através do bloqueio dos anticorpos com 400 nM de proteína STIP1 humana recombinante (rhSTIP1) durante o passo de incubação com anti-STIP1.

Cultura celular

ovário linhas celulares de cancro (BG1, MDAH2774) foram obtidos de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em 10% de FBS, penicilina (100 unidades /ml), estreptomicina (100 unidades /mL) e meio DMEM /F12 a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera.

Ensaio de migração celular

e células BG1 MDAH2774 (10

6 /poço) – tratados com rhSTIP1 (400 nM) ou o veículo por si só – foram cultivadas em meio livre de soro durante 24 h. As células foram então plaqueadas para dentro da câmara superior de um Transwell (24 poços, 8 mícrons de tamanho de poro; Corning Inc., Corning, NY, EUA). A câmara inferior foi preenchida com 800 ul de DMEM /F12 e 0,5 ug /mL de fibronectina (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Após 26 horas de incubação, as células que tinham migrado através de poros e aderidas à membrana inferior foram corados com fluoresceína e calceina-AM (4 ug /mL; BD Biosciences, San Diego, CA, EUA). O número de células viáveis ​​que tinham atravessado o filtro foi determinada por medição da fluorescência de cada amostra utilizando um leitor Tecan Infinito M200 Multiwell (Tecan, Männedorf, Suíça). A neutralização de STIP1 foi realizada utilizando um anticorpo anti-STIP1 (800 nm). Todos os ensaios foram repetidos pelo menos três vezes.

Wound Closure Ensaio

Para investigar o efeito da STIP1 sobre a migração celular, MDAH2774 células (10

6 /poço), que foram tratadas com 400 nM de rhSTIP1 ou o veículo foram semeadas em placas de 3,5 cm ao fim de 24 h de cultura em meio isento de soro. O meio foi então substituído por um que continha 0,4% de FBS. A migração celular foi observada através de uma abertura. imagens de contraste de fase das lacunas foram capturados no início e após 24 h de tratamento com um microscópio invertido (ampliação, 10 ×). O software WimScratch (Wimasis, Munique, Alemanha) foi utilizado para a análise de fecho de feridas [23].

Ensaio de viabilidade celular, utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5 difeniltetrazólio (MTT)

A conversão dos sais de tetrazólio amarelo para cristais formazon roxo por mitocôndrias foi usado como um proxy para a viabilidade celular. Em placas de 48 cavidades, 5 x 10

4 células foram cultivadas em 200 ul de meio por poço durante a noite. Vinte pi de MTT foram adicionados a cada poço, e depois de 4 h, a 200 ul de solução de solubilização (10% SDS em HCl 0,01 M) foi adicionado por poço, durante a noite. A absorvância foi determinada a 570 nm num espectrofotómetro de microplacas (Perkin Elmer Life Science). Para testar o efeito do knockdown de STIP1 sobre a viabilidade celular, as células de cancro do ovário foram transfectadas com 50 nM de ARNsi em cadeia dupla segmentação STIP1 ou ARNsi de controlo em RNAimas Lipofectamina (Invitrogen, Calsbad, CA), como relatado anteriormente [10]. Depois de 48 horas de transfecção, as células foram subcultivadas na placa por ensaios MTT.

Bromodeoxiuridina (BrdU) Ensaio de Incorporação de

Para investigar o efeito de STIP1 sobre a proliferação celular, e BG1 MDAH2774 células (10

4 células /cavidade) foram cultivadas em meio completo durante 24 h, seguido por 72 horas de privação de soro. As células foram então tratadas com 400 nM de rhSTIP1 ou veículo durante 24 h. a síntese de ADN foi ensaiada com a proliferação celular ELISA, BrdU Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) utilizando a detecção colorimétrica de acordo com o protocolo do fabricante [21], [23]. A neutralização de STIP1 exógeno foi realizada usando o anticorpo anti-STIP1 (800 nm).

Ki67 imunocitoquímica Ensaio

e BG1 MDAH2774 células foram privadas de soro durante 72 h e depois tratadas com 400 nM de rhSTIP1 ou veículo durante 24 h. A actividade proliferativa foi testada por coloração imunocitoquímica de Ki67 utilizando um anticorpo monoclonal contra Ki67 (NeoMarker, Fremont, CA, EUA).

Análise estatística

As diferenças na histoscore entre dois grupos foram comparados usando o Mann-Whitney

U

teste. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para a comparação de mais de dois grupos. A capacidade de STIP1 histoscores para discriminar entre o sobreviveram e os pacientes falecidos foi avaliada através da representação gráfica das características de operação do receptor (ROC), que associa a verdadeira taxa positiva (sensibilidade) para a taxa de falsos positivos (1-especificidade) e pelo cálculo do área sob a curva (AUC). As curvas ROC dependentes do tempo foram utilizados para avaliar as AUCs em diferentes pontos de tempo [24]. A análise de regressão de riscos proporcionais de Cox foi utilizada para identificar os preditores independentes de sistema operacional e PFS. Todas as variáveis ​​com associações univariadas em

P Art 0,05 foram introduzidas no modelo multivariável. Para investigar o impacto da adição STIP1 ao modelo de Cox prognóstico para pacientes com câncer ovariano invasivo, subtraído o desvio do modelo com a adição de STIP1 do desvio do modelo sem STIP1. A diferença foi então testada contra uma distribuição do Qui-quadrado com graus de liberdade igual à diferença entre os graus de liberdade dos dois modelos (com ou sem STIP1) [25]. Os resultados são apresentados como ratio ajustado de risco (HR) e intervalos de 95% de confiança (IC). Todas as análises foram realizadas utilizando o pacote estatístico SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Utilizou-se o pacote de R

survivalROC

(R versão 2.15.1; A fundação R para Statistical Computing, Viena, Áustria) para o cálculo das curvas ROC dependentes do tempo. Bicaudal

P

valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Uma Expressão alta STIP1 imuno-histoquímica é associado com alta etapa, de alta qualidade, e Invasiva cancro do ovário

os resultados de imuno-histoquímica (IHC) mostrou que o tratamento com uma quantidade em excesso de STIP1 recombinante revogada completamente a imuno-reconhecimento de STIP1 tecido por anti-STIP1, confirmando a especificidade do anticorpo anti-STIP1 utilizados neste estudo (Figuras 1A-D). Para o anticorpo anti-STIP1 idêntico utilizado no IHC ao longo deste estudo, a análise Western blot de linhas múltiplas de células de cancro do ovário, também confirmou a sua especificidade para reconhecer STIP1 (Figura S1). As diferenças de coloração imuno-histoquímica STIP1 são mostrados nas Figuras 1E-L.

STIP1 expressa no citoplasma de células de cancro do ovário é corado castanho. A imunorreactividade de STIP1 para o anticorpo anti-STIP1 em tecidos de cancro (A, C) foi anulada através da adição de 15 ug de STIP1 humano recombinante durante a incubação (B, D); estes resultados confirmam a especificidade do anticorpo anti-STIP1. A intensidade da coloração foi classificada como STIP1 1 (E), 2 (M), e 3 (G). Todos os slides aqui apresentados foram de carcinomas serosos ovarianos. As barras de escala representam 100 mm (A, B) ou 20 mm (C-G)

Um total de 330 pacientes com câncer de ovário (idade média, 50,7 anos;. Intervalo, 17-90 anos ) foram incluídos no estudo. As características gerais dos pacientes do estudo são apresentados na Tabela 1. Dos 50 pacientes com tumores borderline de ovário (BOT), 49 (98%) estavam em estágio I ou II. Por outro lado, 146 (52,1%) dos 280 pacientes com câncer invasivo estavam no estágio III ou IV. carcinoma seroso foi o tipo histológico mais comum. histoscores STIP1 mais elevados foram significativamente associados com idade mais avançada (≥ 50 anos), estágio avançado, a presença de cancros não-mucinoso (, células claras serosa, ou carcinomas endometrióides), grau 3, câncer invasivo, níveis de CA125 mais altas (≥35 U /mL), e citorredução cirúrgica primária abaixo do ideal (doença residual ≥2 cm) (Tabela 1).

Uma Expressão alta STIP1 imuno está associada à redução sobrevida global (OS)

A duração média do acompanhamento foi de 69,3 meses (variação, 4-130 meses). Para investigar a utilidade potencial de expressão imuno STIP1 como biomarcador em cancro do ovário, foi utilizada a curva ROC para quantificar a forma como diferentes histoscores poderia ser usado para a predição de sobrevivência. Porque era necessário um acompanhamento mínimo de 3 anos para a análise de sobrevivência determinado pela curva ROC, um total de 245 pacientes foram incluídos nesta análise. O corte ótimo para o histoscore STIP1 para discriminar entre pacientes que sobreviveram (n = 191) e aqueles que morreram (n = 54) foi de 169 (sensibilidade = 0,889, especificidade = 0,492). Na análise de todos os pacientes estudados, incluindo ambos os casos invasivos (n = 280) e limítrofes (n = 50), o sistema operacional cumulativa dos pacientes com STIP1≤169 (n = 119) foi significativamente maior (

P

0,0001) do que aqueles com uma pontuação 169 (n = 211) na análise de Kaplan-Meier. Os períodos de sobrevida média foram 112 e 76 meses, respectivamente (Figura 2A)

análises de Kaplan-Meier para a sobrevida global mostrou que as mulheres com um STIP1 histoscore . 169 (linha vermelha) apresentaram uma sobrevida global significativamente menor do que aqueles com um histoscore ≤169 (linha azul) STIP1. significância estatística (

P Art 0,0001) foram detectados nas análises de (a) todos os casos (n = 330), incluindo o cancro invasivo e tumor limítrofe (BOT), (B) cancros do ovário invasivos de todos os tipos de células (n = 280) e (C) tipo de serosa única invasiva de cancro do ovário (n = 107).

Como os tumores borderline de ovário são geralmente caracterizados por um bom prognóstico e não são incluídos em ovário ensaios clínicos de câncer, o significado prognóstico independente dos níveis STIP1 foi analisado apenas no subgrupo de doentes com cancro do ovário invasiva (n = 280). Os resultados da análise multivariada indicou que STIP1 histoscores 169 foram fator independente, significativamente prognóstico para OS (

P Art 0,005) e para PFS (

P Art 0,05) (Tabela 2 ). Kaplan-Meier análises também revelou que STIP1 histoscores 169 foram significativamente associados com a má OS tanto em todos os casos invasivos deste estudo (n = 280) (Figura 2B) e em cancros do ovário seroso invasoras (n = 170) (Figura 2C) .

uma Expressão alta STIP1 imuno-histoquímica é associado com tumores de alto grau

classificação histológica é um parâmetro importante para a avaliação do risco de pacientes com câncer de ovário. Como mostrado na Tabela 1, os histoscores STIP1 foram significativamente maiores em alto grau (grau 3) em tumores de baixo grau (grau 1-2) malignidades (

P

0,0001). Nós investigamos ainda mais o significado clínico da STIP1 imunoexpressão em cancros do ovário de acordo com seu tipo histológico e grau. A maioria dos tumores de grau 3 mostrou um STIP1 histoscore 169; em particular, de 92,8% (77/83), do tipo seroso, 92,3% (12/13) de endometrióide, e 76,5% (13/17) dos carcinomas de tipo misto mostrou uma expressão elevada STIP1. Dos 57 cancros de células de ovário claras, que geralmente não são classificados [3], 40 (70,2%) exibiu um STIP1 histoscore 169. As taxas OS cumulativas de pacientes com baixo grau (grau 1-2) malignidades foram significativamente maiores do que os dos pacientes com grau 3 malignidades (

P Art 0,0001). Os períodos de sobrevivência médios foram 102 e 66 meses, respectivamente (Figura S2). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que histoscores alta STIP1 estão associados a um comportamento particularmente agressivo no câncer de ovário.

A adição de STIP1 Histoscores Melhora o prognóstico estratificação de pacientes com câncer de ovário invasivos

Para testar se histoscores STIP1 fornecidas informações, além de atualmente usado classificação do tumor e estadiamento, analisamos o impacto dos níveis de STIP1 na sobrevivência clínica apenas em pacientes com as mesmas notas ou mesmos estágios clínicos. Em pacientes com grau 3 do cancro do ovário, pacientes com STIP1 169 (n = 102) teve um significativamente (P = 0,022) pior taxa de sobrevida em 5 anos de 44,5% de 63,6% naqueles com STIP1≤169 (n = 11). Em pacientes com cancro do ovário grau 1-2, os casos com STIP1 169 (N = 62) tinham uma taxa de sobrevivência de 5 anos pior do que 73,8% 85,3% naqueles com STIP1≤169 (n = 48), embora a diferença não atingiu significância estatística ainda (P = 0,197). Além disso, nos doentes com estádios avançados (III e IV), de carcinoma seroso e grau indeterminado 2-3 (n = 8), todos eles tinham STIP1 169 e sete deles (87,5%) sucumbiram à doença durante o acompanhamento -se deste estudo.

Nós também realizada uma análise de desvio e construídas as curvas ROC dependentes do tempo (com ou sem STIP1) para examinar se a adição de histoscores STIP1 poderia melhorar a estratificação prognóstica de pacientes com invasiva cancros do ovário. Nestas análises, outros preditores potenciais incluídos no modelo foram estádio, tipo, CA125 no soro, e a presença de doença residual. O modelo de adicionar o histoscore STIP1 a outros fatores prognósticos superou significativamente o modelo sem STIP1, mostrando ambos AUC mais elevados e desvios menores em ambos OS (Figura 3A,

P

= 0,0008) e PFS (Figura 3B,

P

= 0,014). Colectivamente, estes resultados indicaram que STIP1 histoscoring tumor tinha um valor de prognóstico para além da classificação e estadiamento.

A AUC dependente do tempo (área sob a curva ROC) do modelo, incluindo STIP1 é relatado como um sólido vermelho a linha, enquanto que a AUC do modelo sem STIP1 é mostrada como uma linha pontilhada azul. Outros parâmetros incluídos estágio, tipo, CA125 no soro e doença residual. (A) A sobrevida global, (B) a sobrevivência livre de progressão.

STIP1 estimulou a proliferação e migração de células de câncer de ovário

Para investigar as funções biológicas de STIP1, nós tratados BG1 e MDAH2774 células de cancro do ovário com rhSTIP1 (400 nM). O tratamento com rhSTIP1 induzida uma estimulação de 1,9 vezes na incorporação de BrdU em ambas as células de cancro do ovário (Figura 4A). Além disso, o tratamento com rhSTIP1 resultou num aumento da Ki-67 imunocoloração, sugerindo que STIP1 induz a proliferação de células de cancro humano do ovário (Figura 4B)

.

Duas linhas celulares de cancro do ovário (BG1 e MDAH2774) foram tratadas com 400 nM de rhSTIP1 e analisadas por incorporação de BrdU (A) e Ki67 imunocoloração (B). células Ki67-positivas são mostrados na cor marrom; barras de escala representam 20 μ.

O tratamento com rhSTIP1 estimulou significativamente a migração de células de câncer de ovário (aumento de 2,4 vezes em células BG1 e aumento de 1,6 vezes na MDAH2774 células, respectivamente) (Figura 5A). De acordo com os dados obtidos no ensaio de migração Transwell, os resultados do ensaio de encerramento de feridas (Figura 5B) analisados ​​utilizando o software WimScratch indicou um aumento de 1,8 vezes na taxa de migração de MDAH2774 células tratadas com rhSTIP1 (dados não mostrados).

O tratamento com rhSTIP1 promoveu a migração de células de acordo com os resultados de ambos migração Transwell (a) e o fechamento da ferida (B) os ensaios. A análise quantitativa da percentagem de migração de células MDAH2774 utilizando o software WimScratch mostraram que a exposição a rhSTIP1 induziu um aumento de 1,8 vezes na migração (B). Os resultados são representativos de três experiências independentes.

importante, os aumentos observados na proliferação e migração celular induzida por rhSTIP1 foram anulados pelo co-tratamento com anticorpos anti-STIP1 (Figuras 6A e 6B). Estes resultados não só confirmam que os efeitos observados foram induzidas por STIP1, mas também fornecem evidências preliminares para suportar o potencial terapêutico de anticorpos anti-STIP1 no cancro do ovário.

Quando foram adicionados anticorpos anti-STIP1 (800 nm) para células cancerosas previamente expostas a 400 nM de rhSTIP1, a proliferação de células (a) e migração (B) foram inibidas. Os dados são apresentados como médias ± erros padrão das médias de três experiências independentes.

Nas células de cancro do ovário tratados com rhSTIP1, siRNA knockdown de STIP1, ou anticorpos anti-STIP1, nós também utilizado para ensaios de MTT avaliar a viabilidade celular como um proxy para o número de células, com o entendimento de que o número de células é moldada pelas forças de tanto a proliferação celular e da apoptose. De acordo com os resultados apresentados na Figura 4 e na Figura 6A, o tratamento com rhSTIP1 significativamente (P 0,01) aumento do número de células do cancro do ovário com base no ensaio com MTT (Figura S3A), ao passo que knockdown de STIP1 significativamente (P 0,005) suprimiu as células de cancro do ovário (Figura S3B). Em contraste com o efeito neutralizante de anti-STIP1 sobre a proliferação de células rhSTIP1-estimulada (Figura 6A), o tratamento directo de células de cancro do ovário com vários clones de anti-STIP1 não alterou as leituras MTT (Figura S3C).

Discussão

Este estudo mostra pela primeira vez que STIP1 é um biomarcador de prognóstico no câncer de ovário humano. De acordo com as suas características moleculares individuais, biomarcadores foram recentemente agrupados nas seguintes categorias: biomarcadores carcinogénese, biomarcadores divulgados, biomarcadores de resposta, e biomarcadores de risco [11]. Com base na sua aplicação na caracterização de doenças, biomarcadores também podem ser classificados como, e marcadores de risco preditivos de prognóstico [19]. Nos nossos estudos anteriores [9], [10], que demonstram que é secretado por STIP1 cancros do ovário na corrente sanguínea, o que sugere que esta molécula pode servir como um biomarcador libertado de cancro do ovário. Notavelmente, nossos achados indicam que uma expressão alta STIP1 está relacionada à má OS (Figura 2; Tabela 2). E pobres taxas de PFS (Tabela 2) e pode, assim, representar um novo marcador de prognóstico

Um importante fator prognóstico no câncer de ovário é o grau histológico (Figura 2B); Infelizmente, classificação só pode ser subjetivo, mesmo entre patologistas experientes e alguns tumores não se encaixam perfeitamente em um determinado grau [26]. Por exemplo, uma significativa variação inter-observador entre os patologistas na classificação do câncer de mama tem sido relatada [27]. Para abordar esta ressalva, a classificação de cancro da mama em subtipos moleculares com assinaturas de expressão de genes distintos tem sido proposto como um meio para a compreensão da base molecular do grau histológico [28]. Neste estudo, demonstrámos que os histoscores STIP1 pode ser útil em suplementar graus histológicos do patologista de cancros do ovário, fornecendo objectivos, as avaliações quantitativas. Em particular, STIP1 histoscores pode ser útil para predizer o prognóstico em pacientes com câncer de células claras (que geralmente não é classificada) [3]. Nossas análises revelaram ainda que, mesmo em pacientes com o mesmo grau do tumor, um nível STIP1 maior foi associado com pior evolução clínica.

Os níveis séricos de STIP1 não se mostraram significativamente diferentes entre os pacientes com 4 estágios clínicos do ovário cancro [9], mas neste estudo tumorais histoscores STIP1 foram significativamente maiores em fases III-IV (n = 147) do que as fases I-II (n = 183) (Tabela 1). Essa discrepância pode ser simplesmente causada pelo pequeno número do processo (n = 43) em nosso estudo anterior [9]. As descobertas que histoscores alta STIP1 foram significativamente associados aos estágios elevados clínicos (III-IV) e alto grau (3) (Tabela 1) também levantou a possibilidade de que altas histoscores pode ser uma função de grades de alta tumorais e /ou estágios clínicos elevados, que continua a ser provado em estudos futuros de maior número de caso. No entanto, tumor STIP1 histoscoring exerce claramente um valor prognóstico em adição aos parâmetros vulgarmente utilizados, clínicos (Figura 3). Estes resultados suportam a utilidade de colectivamente STIP1 histoscore como biomarcador de prognóstico.

Como uma fosfoproteína, STIP1 sofre uma fosforilação da cinase cdc2, o que é acompanhado pela translocação citoplasmática de STIP1 [14]. A expressão de STIP1 em vários tipos de cancro [15], [29], [30], [31] sugere que esta molécula tem uma função anti-apoptótica e /ou promove a sobrevivência de células de cancro. O knockdown de STIP1 foi mostrado para suprimir a invasão das células cancerígenas pancreáticas [31]. Descrevemos previamente que STIP1 é secretada por células do cancro do ovário no microambiente tumoral e a circulação sistémica [9]. Também descreveram os mecanismos moleculares pelos quais secretadas STIP1 estimula a proliferação de células de cancro do ovário [10]. Os resultados do presente estudo (Figuras 4 e 5) não só confirmam o papel de STIP1 na promoção tumorigênese mas também sugerem que essa molécula pode servir como um biomarcador de prognóstico (Figuras 2 e 3, Tabela 2).

As bloqueio eficaz da proliferação celular estimulada por rhSTIP1 e migração de células do ovário provocadas por anticorpos anti-STIP1 (Figura 6) indica que STIP1 segregadas a partir de tecidos de cancro pode ser um alvo para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos no cancro do ovário. STIP1 representa um candidato atraente para a terapia do cancro. Por exemplo, um composto que impede a Hsp90 de interagir com STIP1 foi recentemente concebido e mostrado para danificar a via de dobragem Hsp90-dependente, em última análise, exercendo efeitos citotóxicos sobre células de cancro da mama [32]. Além disso, um inibidor de C-terminal derivada de Hsp90-novobiocina, KU135, foi mostrado para inibir a proliferação e induzir a apoptose em células de melanoma [33]. Finalmente, um

in vitro

estudo de Horibe et al. [34] tem relatado que um péptido anti-TPR que bloqueia a interacção de Hsp90 com o domínio de TPR2A STIP1 é capaz de induzir a morte celular em pancreática, renal, do pulmão, da próstata, e linhas celulares de cancro gástrico.

apesar das melhorias incrementais em cirurgia e quimioterapia, a maioria dos pacientes com cancro do ovário morrem da doença dentro de cinco anos após o diagnóstico [3]. Para os pacientes apropriados, acrescentando a terapia dirigida para a quimioterapia pode aumentar tanto a possibilidade de que o tumor responderia bem ao tratamento, bem como aumentar o tempo que o tumor pode ser suprimida; em conjunto, isto pode levar a alguma prolongamento da vida. Se corroborada por outros estudos, nossos dados sugerem que STIP1 pode servir como um alvo promissor para a terapia do cancro do ovário baseada em anticorpos.

Informações de Apoio

Figura S1.