Abstract

Neste estudo um microRNA (miRNA) assinatura foi identificada em uma resistente adenocarcinoma ductal pancreático gemcitabina (PDAC) modelo de linhagem celular (BxPC3-GZR) e esta assinatura foi ainda examinado em amostras tumorais PDAC avançados do banco de dados Cancer Genome Atlas (TCGA). BxPC3-GZR mostrou um fenótipo mesenquimal, expressaram niveis elevados de CD44 e mostrou uma desregulação altamente significativa de 17 miARNs. Com base na relevância para o cancro, uma assinatura de sete miRNA (miR-100, miR-125b, miR-155, miR-21, miR-205, miR-27b e miR-455-3p) foi seleccionado para estudos posteriores. Uma correlação forte foi observada para seis das sete miARNs em 43 amostras de tumores avançados, em comparação com tecidos normais do pâncreas. Para avaliar a relevância funcional, inicialmente focada em miRNA-125b, que é sobre-expresso tanto no modelo BxPC3-GZR e espécimes avançados tumorais PDAC. Knockdown de miRNA-125b em BxPC3-GZR e células Panc-1 causou uma reversão parcial do fenótipo mesenquimal e resposta melhorada para gemcitabina. Além disso, os dados de RNA-seq de cada um dos 40 avançados amostras tumorais PDAC a partir da base de dados TCGA indicam uma correlação negativa entre a expressão de miRNA-125b e cinco dos seis genes alvo em potencial (

BaP1

,

BBC3

,

Neu1

,

BCL2

,

STARD13

). Até agora, dois destes genes alvo,

BBC3

e

Neu1

, que são genes supressores de tumor, mas ainda não estudado em PDAC, parecem ser alvos funcionais de miR-125b desde knockdown de miR125b causaram a regulação. Estes miRNAs e seus alvos moleculares podem servir como alvos para aumentar a sensibilidade à quimioterapia e reduzir a propagação metastática

Citation:. Bera A, VenkataSubbaRao K, Manoharan MS, Encosta P, Freeman JW (2014) A miRNA assinatura de resistente à quimioterapia mesenquimais Fenótipo Identifica Novel Molecular metas associadas com cancro do pâncreas avançado. PLoS ONE 9 (9): e106343. doi: 10.1371 /journal.pone.0106343

editor: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Abril de 2014; Aceito: 06 de julho de 2014; Publicação: 03 de setembro de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Foram utilizados os dados para nossa análise formar o repositório público – The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/. Isto proporciona uma plataforma para os investigadores a buscar, baixar e analisar conjuntos de dados gerados por TCGA. Ele contém informações clínicas, dados de caracterização genômica e análise da sequência de alto nível dos genomas de tumores

Financiamento:. O financiamento é fornecido pelo National Institutes of Health-RO1CA069122 para JWF, Veterans Affairs Merit Award 1I01BX000927 para JWF e William e Eula Owens Medical Research Foundation para JWF. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

PDAC continua a ter o pior prognóstico de qualquer tumor sólido. Em 2013, estima-se que mais de 45.000 novos casos serão diagnosticados nos Estados Unidos com a incidência de mortalidade proporção quase igual a uma [1]. A gemcitabina é a quimioterapia mais utilizada para o cancro do pâncreas, mas é significativamente metabolizado no plasma e, portanto, requer doses elevadas que levam à toxicidade de [2]. Muitos PDAC são inicialmente resistentes a gemcitabina e aqueles que respondem geralmente desenvolver resistência durante o curso do tratamento [3].

Permanece por determinar se o fenótipo resistente à quimioterapia é induzida como um resultado da terapia ou se houver uma subpopulação de células de cancro dentro do tumor que são inerentemente mais resistentes à terapia. Evidências recentes indicam que a maioria dos tumores sólidos, incluindo PDAC possuem uma subpopulação distinta de células estaminais do cancro (CSCs). Evidência também sugere que CSCs são inerentemente mais resistentes à quimioterapia e utilizar seu potencial de auto-renovação para regenerar novo tumor de crescimento [4]. Um estudo anterior liga CSCs com epitelial para mesenquimal (EMT) [5].

EMT representa um programa de trans-diferenciação que é necessária para a morfogénese do tecido durante diferente progressão do desenvolvimento celular [6]. O processo de EMT pode ser regulada por um conjunto diverso de citocinas e factores de crescimento, tais como TGF-β, cujas actividades são desregulado durante a progressão tumoral [7]. EMT indução em células de cancro resulta na aquisição de propriedades invasivo e metastático. Os estudos indicam também que EMT também contribui para quimiorresistência e que estas células possuem marcadores CSC [8]. O desenvolvimento de chemoresistance em células de câncer de drogas anticâncer, incluindo a gemcitabina pode ser regulado ou contribuiu para micro-RNAs (miRNAs). miARNs são pequenas moléculas de RNA não codificante (22 nucleótidos), que desempenham papéis cruciais na regulação de transcrição da expressão do gene. O desenvolvimento de quimioresistência através de um aumento no número de CCC tem sido atribuído a alterações no nível de miARN no pâncreas e outros tumores sólidos [9].

descobertas recentes indicam uma inter-relação entre miARNs, EMT fenótipo, CSCs e chemoresistance [10], [11]. Os estudos também sugerem que miARNs desempenhar um papel na regulação do processo de EMT [3], [11]. Por exemplo, miARNs têm sido mostrados para conduzir EMT regulando caderina 1 e moléculas relacionadas EMT adicional [12]. MiR-200a, miR-200b e miR-200c foram regulados em células de câncer de pâncreas gemcitabina-resistentes [13]. Os estudos indicam também que a re-expressão da família de miR-200 de miARNs acima caderina regulamentado 1 e ZEB1 regulada negativamente e vimentina [14]. Além disso, as células cancerosas com um fenótipo de EMT e que eram resistentes a gemcitabina mostrou baixo regulação da let-7 membros [5], [15], [16]. Os estudos in vitro de PDAC indicam uma ligação entre EMT, a invasividade e a resistência à quimioterapia e outros estudos suportam a noção de que miARNs desempenham um papel neste processo, a regulação da expressão do gene [3], [11].

Neste estudo buscou-se identificar uma assinatura miRNA de células PDAC que possuem resistente à quimioterapia e um fenótipo mesenquimal (CRMP). Como os pacientes com PDAC avançada tendem a mostrar mínima resposta à quimioterapia que ainda determinado se esta assinatura miRNA pode ser refletido em seus tecidos tumorais. Estes estudos mostram que o tratamento com gemcitabina induz uma população de células com CRMP in vitro e que a assinatura seleccionada para este miARN CRMP é compartilhada com tumores Espécimes de PDAC avançada. Além disso, este estudo foi capaz de estabelecer inicialmente uma relevância funcional de um sobre miRNA expressa (miR-125b) a partir desta assinatura e potenciais genes supressores de tumor alvo. Este estudo fornece a base para dissecar ainda mais os papéis de miRNAs no CRMP. Estes miRNAs e seus alvos moleculares podem fornecer novas estratégias terapêuticas para eliminar uma população de células de tumor que geralmente é resistente a gemcitabina e, possivelmente, outros tipos de quimioterapia.

Materiais e Métodos

Materiais

a gemcitabina comprado de LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN) foi dissolvido em solução de PBS estéril. reagentes de transcrição reversa e TaqMan PCR em tempo real master-mix foram adquiridos da Applied Biosystems /Life Technologies (cidade Foster, CA). Todos os outros produtos químicos foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

As linhas celulares

A linha de células de adenocarcinoma pancreático humano BxPC3, Capan-2, AsPC-1 e Panc-1 foram adquiridos a partir de ATCC e cultivaram-em meio DMEM (excepto BxPC3) com 1% de penicilina /estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS) numa incubadora humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C. BxPC3 foi cultivada em meio RPMI com 1% de penicilina /estreptomicina e 10% de FBS. Esta linha celular foi transitoriamente PDAC BxPC3 expostos durante quatro horas a cada sete dias com concentrações crescentes (50 ng para 1,5 ng /ml) de gemcitabina ao longo de um período de seis semanas. A linha de células resistentes gemcitabina resultante referida como BxPC3-GZR. Para a manutenção, as células BxPC3-GZR foram expandidas em meio de cultura e congelado em alíquotas. Para as experiências de células BxPC3-GZR foram descongeladas e deixou-se expandir em cultura durante dois dias e em seguida tratada com gemcitabina (1,5 ug /ml) durante quatro horas. A gemcitabina foi removido e as células BxPC3-GZR foram colhidas no dia seguinte para experiências de controlo de qualidade, incluindo manchas Westerns para demonstrar que o fenótipo de EMT adquirida foi mantida.

análises Western blot e imunofluorescência

? Western blot? a análise foi realizada como descrito anteriormente [17]. Os anticorpos primários utilizados foram como se segue: E-caderina e Neu1 da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA); CD44, beta-actina e PUMA (

BBC3

) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA), vimentina da Life Technologies (Carlsbad, CA). Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram adquiridos a Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Para imunofluorescência (IF) de coloração, as células cultivadas na tampa redonda desliza numa placa de 24 poços. Fixação e imunocoloração seguido pela captura de imagens foram realizadas como descrito anteriormente [18].

Matrigel de células Os ensaios de invasão

O comportamento invasivo das células foi analisada por ensaios de invasão de Matrigel, tal como descrito anteriormente [17], [18].

O perfil de expressão dos miRNAs

O RNA total, incluindo as pequenas miRNA não codificante foi isolado a partir BxPC3 e BxPC3-GZR usando kit mirNeasy (Qiagen) por procedimentos fabricante. Análise da expressão de miRNA em ambos os BxPC3 de controle e células BxPC3-GZR foram realizadas por Ciências LC (Houston, TX) usando uma tecnologia biochip microfluídico proprietária μParaflo. Alterações significativas na expressão de miARN foram analisados ​​por teste-t, conforme previsto por LC Sciences (Houston, TX). Somente as mudanças mais altamente significativo, tanto sobre e sob miRNAs expressos foram consideradas para análise posterior (Tabela 1).

A transcrição reversa e quantitativos PCR

ensaios TaqMan gene-expressão TaqMan ( Life Technologies, Carlsbad, CA) foram usadas para quantificar os níveis de ARNm tanto de expressão e amadurecer miARN. O ARN total extraído por miRvana (Life Technologies, Carlsbad, CA) e kit de isolamento de ARN seguida por iniciadores específicos de miR-estrutura haste-laçada RT transcrito numa mistura reaccional contendo iniciadores hexâmeros aleatórios (para ARNm por RT-PCR) e reverso (por miARN RT- PCR). PCR quantitativa foi realizada em triplicado com as reacções contendo iniciadores de ADNc amplificados e TaqMan Universal Master Mix em AmpErase UNG sem (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) seguindo o protocolo do fabricante. Todos os dados de ARNm e dados de miARN são expressas em relação a 18S e U6 respectivamente por TaqMan PCR realizada nas mesmas amostras, a menos que especificado de outra forma. expressão Dobre foi calculado a partir da triplicado de C

valores T após a

-ΔΔC

método T.

geração linha celular 2 Estável por miR-125b knockdown

A gemcitabina células BxPC3-GZR e Panc-1 resistentes foram usados ​​no miR-125b derrubar estudo. miRZipTM miRNAs anti-sense são expressos sistema de Biociências da (SBI, Mountain View, CA) de forma estável hairpins RNAi que inibem a atividade de miRNA. O miRZip shRNAs produzir curtas, anti-miRNAs de cadeia simples que se ligam competitivamente seu alvo miRNA endógeno e inibem a sua função. Os RNAs curto hairpin miRZip são clonados no vector de expressão de pGreenPuroTM shRNA da SBI, uma expressão lenti-vector-based HIV melhorou terceira geração. O vector lentiviral que contém os elementos genéticos responsáveis ​​pela embalagem, transdução e integração estável da construção virai no ADN genómico, induzir a expressão da sequência de efector anti-miARN. Para a produção de um título elevado de partículas virais, foi utilizado o Kit de ViraPowerTM Lentivirus Suporte (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) para transfectar os vectores miRzip em células HEK-293T. Como as células infectadas de modo estável expressar GFP e puromicina, bem como a anti-miARN clonado no vector miRZipTM, foi utilizado para seleccionar puromicina para as células infectadas portadoras do miRzip. Depois de rastreio isolámos BxPC3-GZRΔmiR-125b ou células Panc-1ΔmiR-125B. No modo semelhante, também gerou controle Zip de ambas as linhas celulares com miRZipTM vetor. Para determinar a sensibilidade ao fármaco, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de gemcitabina, durante 96 h e MTT Os ensaios foram realizados como previamente descrito [19].

miARN e perfilamento transcriptoma de dados de tumor a partir do genoma do cancro Atlas (TCGA)

miRNA: dados de sequência

Nível 3.1.1.0 miRNA de portal de dados TCGA foi baixado por 43 amostras de tumor com um tecido normal. Um matriz de dados foi preparado combinando as contagens de leitura em bruto de 1046 miARNs de 44 [43 tumor e normais 1] amostras. Partindo do pressuposto de que os dados de sequência de miRNA seguem uma distribuição binomial negativa [20], [21] as contagens de leitura foram tamanho de fator normalizados utilizando DESeq versão 1.10.1 [22] pacote em R versão 2.15.3. Os dados da contagem de leitura normalizada foi usado para calcular a mudança log2 vezes entre tumor e amostras normais

transcriptoma:.

Nível 3.1.1.0 dados de sequência de RNA de portal de dados TCGA foi baixado por 40 amostras de tumores com uma tecido normal como controlo. Utilizou-se o software RSEM para determinar a quantidade de transcritos de ARN a partir de dados-Seq. RSEM superior quartil normalizados contagens ler dados de 41 (40 tumores e 1 normais) Amostras de tecido foram usados ​​para calcular a mudança log2 vezes entre amostras tumorais e normais.

A análise estatística

t- não pareado de Student teste foi utilizado para comparar as médias individuais do grupo. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os valores nas figuras e texto foram expressos como a média ± SD

Resultados

Geração de um modelo de linha de células de câncer pancreático CRMP

A linha de células PDAC BxPC3 foi transitoriamente exposta a concentrações crescentes de gemcitabina ao longo de um período de seis semanas. As células BxPC3-GZR resistentes resultante gemcitabina foram comparados com as células BxPC3 parentais para as diferenças na morfologia, resposta a gemcitabina, expressão de mesenquimais, marcadores epiteliais e CD44. Comparações para mostrar a morfologia que as células BxPC3 pais cresceram em áreas bem embalado e mostrou uma aparência plana e arredondada, característica de um epitelial como morfologia; Considerando que, as células BxPC3-GZR cresceu como células fracamente associados com uma morfologia característica fusiforme de um fenótipo mesenquimal (Fig. 1A). A sensibilidade ao tratamento com gemcitabina foi comparada entre as células parentais BxPC3 BxPC3-GZR e. células BxPC3-GZR mostrou maior do que uma dupla diminuição na resposta à gemcitabina em comparação com as suas células paternas BxPC3 (Fig. 1C). Para determinar se as células-BxPC3 GZR também são resistentes a atravessar um outro composto quimioterapêutico, as células foram tratadas com paclitaxel e ensaios MTT foram realizadas. Enquanto as células BxPC3-GZR mostrou mais do que uma dupla diminuição na sensibilidade a gemcitabina, estas células apresentaram apenas uma modesta diminuição na sensibilidade ao paclitaxel (Fig. S1). Estas observações sugerem que diferentes vias de sinalização pode ser responsável pela resistência contra diferentes drogas. Um estudo recente com a população de células lado PDAC com propriedades de células estaminais de cancro e que foram seleccionadas para resistência a gemcitabina não eram resistentes a 5-FU [23]. A análise de transferência de Western de células colhidas em cada semana ao longo das seis semanas de aumentar a gemcitabina revelou que o nível de células epiteliais marcador de E-caderina diminuiu gradualmente com o aumento concomitante nos níveis de vimentina marcador mesenquimais e o CD44 marcador de células estaminais (Fig. 1B) .

A. diferenças morfológicas entre parental BxPC3 e chemoresistance mesenquimais células BxPC3-GZR. B. mancha Ocidental mostrando que as células BxPC3-GZR possuir um fenótipo de EMT, o que é demonstrado por um aumento da expressão de vimentina e uma diminuição de E-caderina e expressam o marcador de células estaminais CD44. C. ensaio de MTT comparando o crescimento do BxPC3 parental e BxPC3-GZR às 96 horas após tratamento com diferentes concentrações de gemcitabina. D. de Western blot comparando a expressão de CD44, E-caderina, Zeb-1 e vimentina após quatro passagens de BxPC3 e BxPC3-GZR. E e imagens de microscopia confocal de imunofluorescência F. mostrar a expressão diferencial de CD44 e vimentina em células BxPC3 e BxPC3-GZR.

Mais importante, nós também monitorizados e comparados os níveis de mesmas proteínas de BxPC3 expressão e células BxPC3-GZR que onde expandidas e passadas para as gerações sucessivas em cultura. A estabilidade do fenótipo BxPC3-GZR foi confirmada em culturas de curto prazo com células BxPC3-GZR mostrando um nível mais baixo de E-caderina, a regulação da expressão de vimentina e expressão elevada de marcadores de células estaminais CD44 (Fig. 1D). De acordo com os dados de Western blot, a análise de imunof luorescência indicou uma coloração muito mais forte tanto de CD44 e vimentina em células BxPC3-GZR em comparação com o homólogo BxPC3 parental (Fig. 1E, F).

Identificação de uma assinatura miARN associado com CRMP no PDAC

Os estudos indicam que vários miRNAs como miR-100, miR-21, let-7, miR- 34a e miR – 200c desempenhar papel crítico na regulação tumorigênese e chemoresistance em diferentes tipos de câncer, incluindo pâncreas cancro [24] – [26]. Os estudos também demonstraram um papel para miARNs no desenvolvimento de resistência aos fármacos em uma variedade de doenças malignas [11]. O nível de miRNA expressão foi comparada em células BxPC3 e BxPC3-GZR por μParaflo miRNA chip microfluídico profiling. Após o cálculo e eliminando miARNs não significativas (em termos de expressão), um perfil altamente significativa miARN foi estabelecido que as células distintos BxPC3-GZR de células BxPC3 parentais (Fig. 2,

Tabela 1

). Este perfil mostrou que a maioria significativos nove miRNAs que foram até regulados em células BxPC3-GZR comparação com BxPC3 (miR-125b, miR-155, miR-100, miR-4324, miR-21, miR-15b, miR-25, miR- 424 *, miR-99b) e oito que foram regulados (miR-1246, miR-205, miR-4443, miR-30d, miR-27b, miR-4485, miR-378 *, miR-455-3p).

A. análise de dados de mapa de calor dos ensaios de microarray miRNA comparando células parentais BxPC3 e células BxPC3-GZR resistentes aos medicamentos. Apenas miARNs foram escolhidos, que tinham significativamente acima ou abaixo expresso em comparação com as células parentais (alterações alta vezes com base em valores de log2 e p-valores muito baixos) foram levados para uma validação adicional. Os valores estatísticos estão representados no

Table 1 |. B. Validação de dados de microarray miRNA foi feito por oito miRNAs diferencialmente expressos utilizando o ensaio TaqMan qPCR. Em cada linha de células, o nível de expressão de miARN indicado foi comparada entre as células parentais e células BxPC3 BxPC3-GZR. RNU43 ou U6 foi usada como um controlo interno miARN. C. Análise dos dados TCGA que mostra que 6 dos 7 miARNs validados para ser desregulado nas células BxPC3-GZR também apresentaram expressão diferencial em amostras de tumor de pacientes com PDAC avançada. amostras de tumores de 43 pacientes com PDAC avançado foram analisadas para a expressão miRNA comparação com o tecido do pâncreas normal.

Com base na relevância para o cancro e chemoresistance, foram selecionados sete desses miRNAs para um estudo mais aprofundado. Real-Time PCR TaqMan utilizando ensaios foram realizados para validar sobre ou sub-expresso miARNs identificados por matrizes de miARN (Fig. 2B). Finalmente identificamos quatro dos miRNAs sobre-expressos (miR-125b, miR-155, miR-100, miR-21) e três sob miRNAs expressos (miR-27b, mir-205 e miR-455-3p) por miRNA microarrays foram validados por PCR em Tempo real (Fig. 2B).

a assinatura miRNA do modelo de linha de células CRMP também é detectada em amostras clínicas de doentes com doença avançada PDAC

Para estabelecer o potencial relevância da assinatura CRMP miRNA validado com miRNAs encontrados em PDAC avançado, análises transcriptoma inteiros (miRNA e mRNA-seq, os níveis de expressão) foram realizados com a amostra do paciente dados PDAC dos conjuntos de dados TCGA. No banco de dados TCGA há um total 43 amostras dos pacientes PDAC contendo nível de expressão dos miRNAs com um tecido pâncreas normal. Quarenta dos fragmentos tumorais desses pacientes tiveram os dados de ambos os níveis de expressão de miRNA mRNA e. Uma comparação da sobre e sob miARNs expressos na TCGA com aqueles no nosso matriz miARN é apresentado em

Tabela 2

. Como mostrado na

Quadro 2

, dos dezessete miRNAs que compreendem os miRNAs aberrante desregulados em BxPC3-GZR (9 mais expressa e 8 sob expressos) dados de miRNA para 14 destes estavam disponíveis na TCGA analisa e para todos os sete dos miARNs validados. Uma comparação adicional foi feito sobre a assinatura de seis miRNA validado a partir dos dados de matriz e para os quais havia dados para espécimes PDAC avançados correspondência. A análise destes dados é mostrada na Figura 2C. Curiosamente houve uma correlação significativa com os níveis de expressão comuns de miRNAs em amostras tumorais avançados PDAC com a assinatura CRMP miRNA validado para cinco dos seis miRNAs (Fig. 2C,

Quadro 2

). É importante notar que os dados de miR-125b para os espécimes tumorais é dada como ambos miR-125b-1 e isoformas de miR-2-125b, enquanto que em linhas celulares de apenas determinada miR-125b-1 isoforma (designado como miR- 125b). Curiosamente, os precursores de miR-125b-1 e miR-125b-2 isoformas foram conhecida para originar, independentemente, a partir de diferentes loci cromossómico embora as suas sequências e alvos estão maduros mesmo [27]. Os miRNAs mais notáveis ​​sobre expressas em ambos os espécimes BxPC3-GZR e clínicos foram miR-100, miR-21, miR-125b-1, miR-125b-2 enquanto que miR-205, miR-27b e miR455 foram sub-expressas.

miR-125b desempenha um papel na regulação do CRMP no PDAC

os estudos iniciais foram realizados para determinar se os miRNAs identificados em células BxPC3-GZR e que eram comuns a amostras clínicas desempenhou um papel na CRMP. O miR-125b que era geralmente sobre-expressa em ambos os espécimes clínicos avançados e PDAC em células BxPC3-GZR (Fig. 2) foi escolhido para estas análises. Para outros estudos, três linhas de células PDAC (AsPC-1, Capan-2, Panc-1) Em adição ao BxPC3 foram rastreados para níveis de marcadores EMT expressão, juntamente com miR-125b e miR-30d (Fig. 3 A, B) . Mir-30d foi utilizado para comparação de expressão diferencial de miRNA, uma vez que mostrou nível de expressão igual em ambas as células parentais (BxPC3) e resistentes por análise qPCR. Nestas linhas de células o marcador epitelial E-caderina está inversamente relacionada com a expressão de miR-125b; Considerando que, a vimentina marcador mesenquimais e o marcador de células estaminais CD44 foram proporcionalmente relacionada com a expressão de miR-125b (Fig. 3A, B). Estes dados sugerem ainda que o fenótipo de EMT pode ser regulada em parte pela expressão constitutiva de miR-125b em células Capan-2 e BxPC3 mostram um fenótipo epitelial como e expressam baixos níveis de miR-125b; No entanto, as células AsPC-1 e Panc-1 são mesenquimais e como mostram os níveis mais elevados de miR-125b (Fig. 3 A, B). Além disso, também têm monitorado a expressão de miR-125b em células BxPC3 após tratamento com gemcitabina. Os dados indicam que o tratamento com gemcitabina 72 horas induziu a expressão de miR-125b em células BxPC3 de um modo dependente da dose (Fig. 3C). Portanto, estes resultados indicam que os dois fenótipos quimiorresistência e mesenquimais são regulados pela expressão diferencial do miR-125b.

. As análises de transferência de Western que mostra os níveis de marcadores de células de EMT em PDAC em que foi determinada a expressão de miR-125b expressão. B. Análise de TaqMan qPCR que mostra a expressão relativa da miARN (miR-125b e miR-30d) em células PDAC diferentes. MiR-30d é usado como um controlo. C. Indução de expressão de miR-125b em BxPC3 mediante tratamento de gemcitabina. PCR quantitativa (TaqMan) foram realizadas após 72 horas de incubação com a droga, a fim de controlar o nível de expressão de miR-125b em células BxPC3. Os dados indicam que a expressão de miR-125b é aumentada pelo tratamento de gemcitabina de uma forma dependente da dose.

De modo a determinar se a expressão de miR-125b está directamente relacionada com CRMP, que derrubado a expressão de miR-125b usando tecnologia de fecho de correr e as linhas de células estáveis ​​gerado e ensaiado quanto à expressão de miR-125b em ambos BxPC-GZR-Zip-Ctrl e em células BxPC3-GZR-ΔmiR-125b (Fig. 4a). A morfologia das células knockdown miR-125b também foi avaliada e knockdown de miR-125b restaurou o epitelial como morfologia (Fig. 4A). TaqMan qPCR ensaio indicou um knockdown 80% aproximada de miR-125b em células BxPC3-GZR (Fig. 4B). Knockdown de anti-miR125b invertida marcadores EMT como mostrado pelo aumento da expressão do marcador de E-caderina epitelial e diminuiu a expressão da vimentina mesenquimais marcador e também diminuiu a expressão de CD44 (Fig. 4C). Knockdown de miR-125b diminuiu a migração de células (Fig. 4D, E) e parcialmente revertida a resistência de células de gemcitabina BxPC3-GZR (Fig. 4F).

. Estabelecer as células estáveis ​​com base Lenti-virais que expressam anti-miR-125b em BxPC3-GZR (Zip-controle e miR-125b knock-down). ensaios B. TaqMan qPCR mostrando a knockdown de miR-125b em células ctrl BxPC3-GZR-Zip em comparação com células BxPC3-GZRΔmiR-125b. C. Expressão de anti-miR-125b (tecnologia Zip, SBI) diminui a expressão de EMT e marcador stemness monitorados por ensaios parafuso ocidentais. Painéis D e E mostram a atenuação da migração celular por derrubando a expressão de miR-125b. As imagens foram tiradas após coloração com cristal de violeta de células que migraram e os dados foram representados graficamente como um gráfico (Barra = 50 uM). F. Knockdown de miR-125b aumenta resposta a gemcitabina. células BxPC3-GZRΔmiR-125b BxPC3-GZR-Zip-Ctrl e foram tratados com gemcitabina em diferentes concentrações e os ensaios MTT foram realizadas após 96 horas de tratamento. G. knockdown de miR-125b em células Panc-1. células estáveis ​​com base Lenti-virais foram gerados para inibir a expressão de miR-125b (tecnologia Zip,). ensaios TaqMan qPCR foram realizadas para medir a expressão de miR-125b nas células de controle Zip Panc-1 e derrubar células (Panc-1 ΔmiR-125b). H. Inibidor miR-125b diminui CD44 e vimentina expressão enquanto se regular a expressão de E-caderina. I. knockdown de miR-125b aumenta a resposta de Panc-1 a gemcitabina. ensaios MTT foram feitos após 96 horas de tratamento gemcitabina. valores de significância estatística * P 0,05 e ** p 0,01 foram calculados usando t-testes do aluno

A fim de confirmar que este efeito de knockdown miR-125b não foi o único a células BxPC3-GZR. , miR-125b também foi derrubado em células Panc-1. Semelhante ao observado em knockdowns miARN-125b para células BxPC3-GZR, Western blot e dados de ensaio de MTT indicaram que knockdown de expressão de miR-125b em Panc-1 de células parcialmente revertida o fenótipo mesenquimal (Fig. 4G, H) e resposta a uma maior gemcitabina (Fig. 4I).

genes alvos de

miR-125b

Desde miRNAs ato por qualquer repressor ou clivagem seus mRNAs alvo, foi realizada análise de diversos alvos a jusante conhecidos de miR expressão gênica -125b. Diversos estudos indicam que os alvos de mRNA de miR-125b são

BBC3

(PUMA),

ITCH

,

BAK1

,

BCL2

,

Neu1

,

PPP1CA

,

PPP2CA

[28] [29];

STARD13

(DLC2) [30];

AP1M1

,

STK11IP

,

PSMD8

,

TBC1D1

,

TDG

,

MKNK2

,

DGAT1

, BaP1,

GAB2

,

SGPL1

[28]. Analisou-se os dados clínicos para estes tumores níveis de expressão de ARNm de cima (fig. 5). RNA-seq de TCGA mostrou que as expressões de alguns destes genes (

BaP1

,

BBC3

ou PUMA,

BCL2

,

Neu1

,

STARD13

) está negativamente correlacionada com a expressão de miR-125b. Foram analisadas quer a tendência expressão geral dos genes alvo no PDAC espécimes do banco de dados TCGA (Fig. 5A), bem como o nível de expressão do gene alvo em relação à expressão de miARN-125b dentro dos mesmos espécimes de tumor (Fig . 5B). Em seguida, temos monitorado o nível de p53-regulada modulador da apoptose (PUMA) expressão. PUMA também conhecido como Bcl-2 de ligação do componente 3 (BBC3) é uma proteína pro-apoptótica e membro da família de proteínas Bcl-2 [31], [32]. PUMA está envolvido na via de apoptose tanto p53-dependente e independente de induzida por uma variedade de sinais [33]. Estudos recentes também indicam que

Neu1

salidase Neu1 produto é importante na regulação da integrina a sinalização mediada pelo β4, levando a supressão de metástase do cancro [34]. No entanto, um estudo separado que indica Neu1 salidase aumenta a sinalização de EGFR e, assim, poderia ser tumoral promover [35]. Os achados, juntamente com o alvo miRNA baseado na web dados de varredura sugerem que miR-125b atinge diretamente os 3’UTRs de PUMA (BBC3) e Neu1 (Fig. 6. F, G). Em apoio a esta, as expressões de mRNA para

BBC3

(PUMA) e

Neu1

foram inversamente correlacionadas com a expressão de miR-125b (Fig. 6A) em células BxPC3-GZR.

A. mRNA alvo perfil de expressão análises para miR-125b. Determinado a expressão de alvos de miR-125b conhecidos (

BBC3

(PUMA),

BCL2

,

STARD13

,

BAK1

,

BaP1

,

ITCH

e

Neu1

). B. Uma correlação directa do ARNm alvo e o nível de expressão de miR-125b foram medidos no mesmo tumor de adenocarcinoma pancreático [PDAC] amostra do paciente. Primeiro painel explica os diferentes quadrantes, que inclui aumento da regulação (+ sinal de Ve) ou regulação para baixo (- sinal VE) de níveis de expressão de mRNA e miRNA. Outros painéis estão representando nível de mRNA diferente expressão (

BBC3, Neu1 e BAK1

) em comparação com a expressão de miR-125b no mesmo tumor.

A. PUMA (

BBC3

) e Neu1 são alvos de mRNA mais proeminentes de miR-125b. As análises foram realizadas qPCR TaqMan para validar os dados clínicos. Os resultados qPCR que indicam o nível de mRNA diferente expressão (

BBC3, Neu1 e BAK1

) que são alvo direto de miR-125b comparação entre as células parentais BxPC3 e células GZR resistentes. B. Comparação do nível de expressão de mRNA de

BBC3, Neu1 e BAK1

em células BxPC3-GZR e células BxPC3-GZR estáveis ​​que expressam anti-miR-125b. C. Ocidental apaga análise para monitorar o nível de expressão da PUMA e Neu1 em BxPC3, BxPC3-GZR e miR-125b células knockdown. D e E. Inibição miR-125b restaura BBC3 e Neu-1 em células Panc-1, qPCR (D) e Western blot (E). F, conservação G. Espécies e correspondência da sequência de semente no 3’UTR de

BBC3

e

Neu1

mRNAs com sequência de miR-125b foram monitoradas usando TargetScan software gratuito baseado na web.

em seguida, comparou-se a expressão de três diferentes potenciais genes alvo miR-125b PUMA (

BBC3

) (mais sub-expresso do gene em amostras de pacientes),

Neu1

e

BAK1

(up-regulada de genes) mRNAs entre BxPC3 parental e as células BxPC3-GZR (Fig. 6B).