Abstract

A via de sinalização /β-catenina Wnt é importante para a iniciação e progressão tumoral. A relacionada com o receptor de lipoproteína de densidade baixa de proteína-6 (LRP6) é um co-receptor de Wnt essencial para a sinalização de Wnt /β-catenina e representa um alvo promissor anticancro. Recentemente, a droga anti-helmíntico, niclosamida foi encontrado para inibir a sinalização de Wnt /β-catenina, embora o mecanismo não foi bem definido. Descobrimos que niclosamida foi capaz de suprimir a expressão LRP6 e fosforilação, bloquear acumulação β-catenina induzida por Wnt3a, e inibir a sinalização de Wnt /β-catenina em células HEK293. Além disso, os efeitos inibidores de niclosamida sobre LRP6 expressão /fosforilação e a sinalização /β-catenina Wnt foram conformados em PC-3 da próstata humano e células de cancro da mama DU145 e MDA-MB-231 e T-47D. Além disso, mostrámos que o mecanismo pelo qual niclosamida suprimida LRP6 resultou de um aumento da degradação, como é evidente por uma meia-vida mais curta. Finalmente, foi demonstrado que niclosamida foi capaz de induzir apoptose de células de cancro, e exibida uma excelente actividade anti-cancro com IC

50 valores de menos de 1 uM para PC-3 da próstata e células cancerosas DU145 e da mama MDA-MB-231 e T-47D . Os sub

50 valores de IC são comparáveis ​​àqueles mostrados para suprimir as actividades de sinalização de Wnt /β-catenina em células da próstata e cancro da mama. Os nossos dados indicam que niclosamida é uma molécula pequena de Wnt /β-catenina inibidor da sinalização único alvo a LRP6 co-receptor de Wnt na superfície da célula, e que niclosamida tem um potencial para ser desenvolvido um quimiopreventivo romance ou um agente terapêutico para a próstata humana e do cancro da mama .

Citation: Lu W, Lin C, Roberts MJ, Waud WR, Piazza GA, Li Y (2011) niclosamide Suprime Cancer Cell Growth induzindo Wnt co-receptor LRP6 Degradação e inibindo a Wnt /β-catenina pathway. PLoS ONE 6 (12): e29290. doi: 10.1371 /journal.pone.0029290

editor: Lin Mei, Medical College of Georgia, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de setembro de 2011; Aceito: 24 de novembro de 2011; Publicação: 16 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (RO1CA124531, para YL). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a sinalização de Wnt /β-catenina desempenha um papel importante no desenvolvimento embrionário e pode levar à formação de tumor quando aberrantemente activadas. Uma característica da activação /β-catenina sinalização Wnt é a estabilização de citosólica β-catenina, que entra no núcleo para activar genes alvo Wnt por ligação factores de transcrição do factor de reforço do factor de células T /linfóide (TCF /LEF) familiar [ ,,,0],1], [2]. Na ausência de Wnt ligandos, os níveis de β-catenina são eficientemente regulada por um complexo supramolecular contendo polipose adenomatosa coli (APC), axina, e glicogénio-sintetase quinase 3β (GSK3β). Este complexo promove a fosforilação de β-catenina por caseína-quinase 1 (CK1) e GSK3β. Fosforilada β-catenina torna-se multi-ubiquitinada (Ub) e degradado pelo proteassoma 26S. A acção deste complexo é inibida mediante a ligação de Wnt aos seus receptores na superfície da célula [1], [2]. Uma variedade de genes alvo de Wnt /β-catenina têm sido identificadas, incluindo as que regulam a proliferação celular e a apoptose, mediando assim a iniciação e progressão do cancro [3] – [5]. provas convincentes indicou que há um anormal aumento da regulação desta via na tumorigênese de muitos tipos de câncer, e que a interrupção da sinalização de Wnt /β-catenina representa uma grande oportunidade para desenvolver novos medicamentos para quimioprevenção e terapia do cancro [6] – [8].

Experiências realizadas em Drosophila [9], Xenopus [10] e ratinhos [11] demonstraram que a proteína relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade 5 (Lrp5) /LRP6 (denominado seta em Drosophila) actua como um co-receptor para os ligandos de Wnt, que interagem tanto com o receptor sete transmembranar da família Frizzled (Fz) e Lrp5 /6 para activar a via de sinalização Wnt canónica. As caudas citoplasmáticas de Lrp5 /6, mediante a ativação do receptor pelo ligando Wnt, são fosforilada, e recrutar o axina proteínas scaffold citosólica para a membrana. LRP6 é expresso em linhas celulares de cancro humano e sobre-reguladas em tecidos malignos humanos [12] – [16]. Estudos realizados nos últimos anos têm demonstrado que LRP6 é um alvo terapêutico promissor para o desenvolvimento de novos fármacos anti-cancerígenos [6] -. [8], [15], [17], [18]

niclosamida (comércio nome Niclocide) é um teniacide na família anti-helmíntico que é especialmente eficaz contra cestóides, que infecta seres humanos. Niclosamida tem sido aprovado pela FDA para tais indicações e tem sido utilizada em seres humanos para quase 50 anos [19] – [21]. Acredita-se que niclosamida inibe a fosforilação oxidativa em mitocôndrias de cestóides; um metabolismo aeróbico, no qual muitos cestódeos são dependentes. Recentemente, tem sido demonstrado que niclosamida pode regular negativamente a expressão β-catenina citossólica para inibir a via Wnt /β-catenina sinalização [22], [23], e suprimir o crescimento do cancro colo-rectal e metástases [23], [24]. Uma vez que o mecanismo não foi bem definido, nós ainda estudado este. Nós demonstramos pela primeira vez que niclosamide pode inibir a sinalização de Wnt /β-catenina, induzindo a degradação LRP6, e que esta actividade está intimamente associada à sua antiproliferativa e apoptose actividade de indução.

Resultados

Niclosamide sinalização de blocos de Wnt /β-catenina induzida por Wnt3a LRP6 e suprimindo a expressão em células HEK293 LRP6

não complexado β-catenina citossólica (livre β-catenina) é a forma activa da β-catenina que é translocado para a célula núcleo para activar os factores de transcrição da família TCF /LEF, que conduz à transcrição de genes alvo Wnt. Para determinar se niclosamida podem inibir a sinalização de Wnt /β-catenina, células HEK293 que foram tratadas para com Wnt3a meio condicionado (CM) na presença de niclosamida ou veículo (DMSO). Os níveis de citosólico livre β-catenina e β-catenina celular total foram então examinados por transferência Western. Como mostrado na Figura 1A, niclosamida foi capaz de bloquear induzida por Wnt3a citosólico livre β-catenina e a acumulação celular total β-catenina em células HEK293 em concentrações tão baixas como 0,6 uM (Figura 1A).

(A) células HEK293 em placas de 6 poços foram tratadas com Wnt3a cm (20%) e niclosamida nas concentrações indicadas, durante 24 h. Foram examinados os níveis de citosólico livre β-catenina, β-catenina celular total, fosfo-LRP6 e LRP6 (p-LRP6). Todas as amostras foram também sondadas com anticorpo anti-actina para verificar a carga igual. (B) As células HEK293 em placas de 24 poços foram transfectadas transitoriamente com o plasmídeo LRP6 ou o vector de controlo correspondente, juntamente com TOPFlash construir e β-galactosidase expressam vector em cada poço. Após ser incubada durante 24 h, as células foram tratadas com niclosamida ou mais niclosamida Wnt3a CM nas concentrações indicadas, durante 24 h. A actividade da luciferase foi então medida 24 h mais tarde, com a normalização da actividade da β-galactosidase. Os valores são médias de três determinações com os desvios padrão indicados por barras de erro. ** P 0,01 em comparação com as células de controlo sem tratamento niclosamida

LRP6 é um co-receptor de Wnt essencial para a via de sinalização Wnt /β-catenina, e a fosforilação é crítica para LRP6 Wnt /β. -catenina sinalização activação induzida por proteínas Wnt [25] – [28]. Para explorar o mecanismo molecular subjacente a inibição de sinalização Wnt /β-catenina por niclosamide, examinamos a expressão LRP6 e fosforilação após o tratamento niclosamide. Como mostrado na Figura 1A, o tratamento de Wnt3a CM induzida marcadamente a fosforilação LRP6 endógeno em células HEK293, que foi abolida por tratamento niclosamida. Importante, também descobrimos que o nível celular total de LRP6 endógena foi muito diminuída após o tratamento niclosamida em células HEK293 (Figura 1A).

Para confirmar o efeito inibidor na expressão de niclosamida LRP6 e fosforilação, foi realizada uma Wnt /β-catenina sinalização ensaio de repórter para testar se niclosamida é capaz de inibir a activação do sinal Wnt /β-catenina por LRP6 e Wnt3a. As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente com LRP6 juntamente com Wnt /β-catenina repórter sinalização TOPFlash, e tratou-se com Wnt3a CM e niclosamida. Como mostrado na Figura 1B, a expressão LRP6 aumentou a actividade TOPFlash em células HEK293, o qual foi ainda aumentada quando as células foram transfectadas com LRP6 e tratou-se com Wnt3a CM (Figura 1B). Além disso, o aumento da actividade induzida pelo TOPFlash LRP6 LRP6 ou mais Wnt3a CM foi bloqueada por niclosamida (Figura 1B).

niclosamida suprime a expressão e fosforilação LRP6 e blocos de Wnt /β-catenina sinalização em células da próstata e cancro da mama

Para determinar se niclosamida pode bloquear a sinalização de Wnt /β-catenina em células de cancro, nós examinamos o nível de citosólico livre β-catenina após o tratamento niclosamida. Nós descobrimos que os níveis citosólicos β-catenina livre em células de cancro da próstata humano PC-3 e da mama MDA-MB-231 foram significativamente reduzidos após o tratamento niclosamida (Figura 2A). Além disso, quando as células PC-3 e MDA-MB-231 foram transientemente transfectadas com o /β-catenina repórter sinalização TOPFlash Wnt, verificou-se que o tratamento niclosamida reduziu grandemente a actividade TOPFlash em PC-3 e nas células MDA-MB-231 ( Figura. 2B).

(a), o cancro da próstata PC-3 e de cancro da mama MDA-MB-231 células em placas de 6 poços foram tratadas com niclosamida, nas concentrações indicadas, durante 24 h. Os níveis de citosólico livre β-catenina foram então examinados por ensaio de ligação de GST-E-caderina. (B) o cancro da próstata PC-3 e cancro da mama MDA-MB-231 células em placas de 24 poços foram transfectadas transitoriamente com a construção de luciferase e TOPFlash β-galactosidase expressam vector em cada poço. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com 2,4 uM niclosamida. A actividade da luciferase foi então medida 24 h mais tarde, com a normalização da actividade da β-galactosidase. Os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro. ** P . 0,01 em comparação com as células de controlo

é bem reconhecido que axin2 é um alvo transcricional específico da via de sinalização /β-catenina Wnt, e que o nível de expressão é o axin2 assinatura da activação da via Wnt /β-catenina sinalização [29] – [32]. A ciclina D1 é um alvo de transcrição da sinalização de Wnt /β-catenina, e é crítica para a proliferação de células de cancro [33], [34]. Para determinar os efeitos inibidores da sinalização de Wnt na niclosamida /β-catenina em células de cancro humanas, examinámos axin2 e expressão de ciclina D1 em PC-3 da próstata humano e células de cancro da mama DU145 e MDA-MB-231 e T-47D. Como mostrado na Figura 3, niclosamida suprimiu significativamente axin2 e expressão da ciclina D1 em todas as quatro linhas celulares de cancro.

DU145 e células cancerosas da próstata PC3 e MDA-MB-231 e T-47D células de cancro da mama (A) nas placas de 6 poços foram tratadas com niclosamida nas concentrações indicadas, durante 24 h. Os níveis celulares totais de LRP6, p-LRP6, Dvl2, Axin2 e Ciclina D1were examinada em seguida. Todas as amostras foram também sondadas com anticorpo anti-actina para verificar a carga igual. (B) células de cancro da próstata PC-3 e DU145 e células de cancro da mama MDA-MB-231 e T-47D em placas de 6 poços foram tratadas com niclosamida nas concentrações indicadas, durante 24 h. Os níveis citosólicos de Dvl2 foram então examinados. Todas as amostras foram também sondadas com anticorpo anti-actina para verificar a carga igual.

Para determinar se o efeito inibidor de niclosamida na sinalização de Wnt /β-catenina está relacionado com a expressão LRP6, examinámos a expressão LRP6 e fosforilação após o tratamento niclosamida. Como mostrado na Figura 3A, niclosamida foi capaz de suprimir a expressão LRP6 e fosforilação em todas as quatro linhas celulares de cancro, o que indica que niclosamida pode reprimir a sinalização de Wnt /β-catenina em células da mama e cancro da próstata através da supressão de expressão LRP6.

niclosamide Induz LRP6 Degradação

Para definir o mecanismo molecular subjacente ao efeito de niclosamide no nível de proteína LRP6, estudamos volume de negócios LRP6. Células PC-3 foram tratados com niclosamida a 1,2 M para 0, 3, 6, 10 e 24 h na presença de ciclo-heximida, um inibidor da síntese de proteína. Como mostrado na Figura 4, na ausência de tratamento niclosamida, LRP6 foi degradada com uma meia-vida de cerca de 6,9 ​​h. O tratamento com niclosamida aumentou significativamente o volume de negócios LRP6 com uma meia-vida de cerca de 2,3 h (Figura 4A). Este encurtamento dos LRP6 meia-vida niclosamida sugere que pode estimular a degradação LRP6. Para testar se niclosamida regula a expressão LRP6 ao nível da transcrição também, analisámos os níveis de ARNm por LRP6 em tempo real de RT-PCR. Como mostrado na Figura 4B, os níveis de ARNm LRP6 não foram significativamente alterados após tratamento niclosamida em PC-3 e nas células MDA-MB-231. Portanto, a supressão LRP6 induzida por niclosamida é principalmente devido à degradação aumentada LRP6.

células PC-3 (A) foram incubadas com 10 ug /ml de ciclo-heximida na presença de niclosamida (1,2 uM) ou veículo durante 0, 3, 6, 10 ou 24 h. As células foram então colhidas, e o nível de LRP6 endógena foi analisada por Western blotting. As amostras também foram sondadas com anticorpo anti-actina para verificar a carga igual. Os pixels para cada banda foram medidos, normalizado e plotados. Os dados são valores médios de três experiências independentes com os valores SD indicados por barras de erro. * P 0,05, ** P 0,01 versus valor de controlo correspondente. As células PC-3 e MDA-MB-231 em placas de 6 poços (B) foram tratadas com niclosamida durante 24 h. As células foram então colhidas e os níveis de ARNm foram determinados por LRP6 em tempo real de RT-PCR e normalizadas para os níveis de mensagem do ARNm de GAPDH. Todos os valores são a média das determinações triplas com o S.D. indicado por barras de erro.

Niclosamide não tem efeito sobre Expression Dishevelled-2 (Dvl2) na próstata e do cancro da mama células

foi relatado que niclosamide regula negativamente componentes da via Wnt , expressão Dvl2 especificamente citosólico, resultando em diminuição da sinalização de Wnt /β-catenina jusante no cancro colorectal [23]. Para testar se Dvl2 também está envolvida na inibição da sinalização de Wnt /β-catenina induzida por niclosamida em células da próstata e cancro da mama, examinámos ambos os níveis totais celulares citosólicos e de expressão Dvl2. Inesperadamente, descobrimos que niclosamida não teve efeito sobre ambas expressão Dvl2 celular e citosólica total nas células cancerosas PC-3 e DU145 e da mama MDA-MB-231 e T-47D humanas da próstata (Figura 3), enquanto que a expressão LRP6 foi significativamente suprimida em o mesmo tratamento (Figura 3A). Estes resultados indicam que LRP6 regulação negativa é o mecanismo chave subjacente induzida por niclosamida Wnt /β-catenina inibição em células MDA-MB-231 e T-47D células cancerosas PC-3 e DU145 e da mama humano da próstata sinalização.

niclosamida induz próstata e cancro da mama celular apoptose e inibe cancer Proliferação celular

O caminho /β-catenina Wnt é importante para a apoptose de células de câncer [35], [36]. Tendo estabelecido que niclosamida é um potente inibidor da sinalização de Wnt /β-catenina em células da próstata e cancro da mama, que, em seguida, testou-se se niclosamida é capaz de induzir apoptose. Como mostrado na Figura 5A, a exposição a niclosamida de 1,2 e 2,4