Sumário
Devido à sua agressividade e a falta de terapias eficazes, adenocarcinoma ductal pancreático tem um prognóstico sombrio. são, portanto, urgentemente necessárias novas estratégias para melhorar o tratamento e sobrevivência. Numerosos antigénios fucosilados em soros servir como marcadores tumorais para detecção e avaliação da eficácia do tratamento do cancro. O aumento da expressão fucosiltransferases também foi relatado para câncer de pâncreas. Estas enzimas acelerar a transformação maligna através fucosila�o de precursores sialilados, sugerindo um requisito crucial para fucose por células de câncer pancreático. Com isto em mente, desenvolvemos nanopartículas ligadas a fucose como veículos para a entrega de drogas anticâncer especificamente a células cancerosas. lipossomas L-bound-fucose contendo Cy5.5 ou cisplatina foram efetivamente entregues em CA19-9 expressando células de câncer pancreático. O excesso de L-fucose decréscimo na eficiência de introdução Cy5.5 por lipossomas L-fucose ligados a, sugerindo entrega L-fucose mediada por receptores. lipossomas L-fucose ligada injectados intravenosamente cisplatina transportando foram entregues com sucesso a células de cancro do pâncreas, mediação da inibição do crescimento do tumor eficaz, bem como prolongar a sobrevivência em modelos de xenoenxerto de ratinho. Esta modalidade representa uma nova estratégia para a terapia-alvo de células de câncer pancreático
Citation:. Yoshida M, Takimoto R, Murase K, Sato Y, Hirakawa M, Tamura F, et al. (2012) Segmentação Anticancer Drug Delivery às células do cancro do pâncreas utilizando uma abordagem de nanopartículas ligadas-fucose. PLoS ONE 7 (7): e39545. doi: 10.1371 /journal.pone.0039545
editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center e Instituto de Pesquisas Beckman, Estados Unidos da América
Recebido: 15 Março, 2012; Aceito: 22 de maio de 2012; Publicação: 11 de julho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Yoshida et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi parcialmente financiado pelo Ministério da Educação, Ciência, Desporto e Cultura, Grant-in-Aid para a Investigação científica (B), 21.390.231 de 2009, a JK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
pâncreas adenocarcinoma ductal é um dos mais agressivos. malignidades e tem um prognóstico sombrio. Estima-se que a mortalidade por câncer de pâncreas ocupa a oitava posição no número de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A taxa de sobrevivência de 5 anos global de apenas 1% a 4% é devido à incapacidade de detectar a doença, numa fase precoce, a sua agressividade, e a falta de terapias eficazes conservadoras [1] – [4]. Mesmo os pacientes que são capazes de sofrer a ressecção cirúrgica principalmente recaída, resultando em um resultado desfavorável geral [3]. Apesar de quase 80% dos pacientes diagnosticados numa fase muito avançada inoperável (IV) são tratados com gemcitabina, gemcitabina em combinação com erlotinib, ou folfirinox, o tempo médio de sobrevivência é relatado para ser apenas 5,7 meses, 6,8 meses e 11,1 meses, respectivamente [1], [5], [6].
Uma explicação plausível para a fraca resposta do câncer de pâncreas avançado é que os resultados sistêmicos quimioterapia na entrega extremamente ineficiente de drogas anticâncer para o tumor por causa de sua hipovascularização [7 ]. Em um esforço para superar a fraca prestação de drogas anti-câncer, temos desenvolvido quimioterapia de infusão arterial com gemcitabina e 5-fluorouracil para o câncer de pâncreas avançado irressecável, após a redistribuição suprimento vascular via embolização superseletiva [8]. Numa fase I /II de ensaios, uma taxa de resposta global de 33,3% e um tempo de sobrevivência mediano de 22,7 meses (CI de 95%; 9,5-24,5) foi conseguida, um resultado melhor do que com a monoterapia com gemcitabina intravenosa [1]. No entanto, a sobrevida global de 2 anos ainda era apenas 25%, devido ao mau controle das lesões metastáticas [8]. Isto indica que ainda terapias mais eficazes são necessárias. entrega específica de drogas anticâncer a células cancerosas podem resultar na melhoria da eficácia.
Anti-câncer de entrega da droga especificamente a células cancerosas continua a ser um grande desafio. Várias abordagens, tais como lipossomas, polímeros, polymersome, e micelas transportando drogas anti-cancro, têm sido utilizados para a administração de fármacos às células cancerosas, com a expectativa de passiva direccionamento por meio de efeitos de retenção (EPR) permeação melhorada e [9]. No entanto, os transportadores à base de lípidos têm sido relatados para ser rapidamente eliminado da corrente sanguínea pelo sistema reticuloendotelial (RES) [9]. De modo a ultrapassar este problema, a modificação química dos transportadores de droga com certos polímeros sintéticos tem sido frequentemente utilizado numa tentativa de aumentar a
In vivo
longevidade [10]. A modificação mais popular e bem sucedido é o revestimento com polietileno glicol (PEG) para obter o “estabilização estérica”, o que dificulta a interacção de componentes do sangue com a sua superfície e reduz a ligação de proteínas do plasma, toxicidade, imunogenicidade, e acumulação no RES [11 ], [12]. Um exemplo, é a doxorrubicina em lipossomas de PEG-revestidas (DOXIL ® e Caelyx®), que é amplamente utilizado na prática clínica para o tratamento de tumores sólidos em pacientes com carcinoma da mama [13]. No entanto, a evidência recente mostrou que o PEG, a qual foi anteriormente considerada biologicamente inerte, poderia ainda induzir certos efeitos adversos através da activação do sistema do complemento [14]. Outras abordagens utilizando nanopartículas à base de polímeros orgânicos ou (Abraxan®) são utilizados clinicamente, mas estes são limitados pela falta de libertação controlada de fármacos em locais específicos, devido à longevidade na corrente sanguínea, o que leva a efeitos adversos [15].
Outra forma de atingir activamente células cancerosas é através do uso de nanocarriers conjugados com moléculas que se ligam a antigénios ou receptores nas células cancerosas [17], [18]; no entanto, os obstáculos permanecem com esta estratégia, tais como a absorção não específica pelo RES e por células não-alvo [9], [16]. Por exemplo, quando os anticorpos são utilizados no seu estado nativo para a modificação de nanotransportadores, o domínio de Fe de um anticorpo monoclonal intacto pode também ligar-se aos receptores Fc em células normais, como ocorre com os macrófagos, o que leva a um aumento da immnunogenecity e captação pelo RES [ ,,,0],19], [20]. Embora a eficácia destes modificação foi comprovada, efeitos colaterais letais foram também observadas, provavelmente devido à ligação não específica [21] entre o agente e não-alvo porções de direccionamento na superfície da célula. Assim, um porta-alvo de células de câncer específico que não sofre trapping pelos RES ou sites não-alvo é urgentemente necessária.
Assim, nós nos concentramos sobre as características biológicas do cancro do pâncreas, antígenos especialmente fucosilados, tais como sialil Lewis XI (SLX) antigénio e de hidratos de carbono do antigénio 19-9 (CA19-9), que são encontrados no soro e tecidos dos pacientes de tumores [22] – [25]. Estes são utilizados como marcadores tumorais para detecção e avaliação da eficácia do tratamento do cancro. De vários desses antigénios fucosilados, CA19-9 foi identificado como um marcador tumoral amplamente útil para o adenocarcinoma do pâncreas devido a sua elevação frequente nesta doença (~ 80%) [26], [27]. Também tem sido mostrado que a taxa de sobrevivência pós-operatória é significativamente pior, em doentes com adenocarcinoma do pâncreas, cujos níveis são mais CA19-9 marcadamente elevada [28].
fucose, um açúcar deoxyhexose, desempenha um papel fisiológico na modificação de várias moléculas em mamíferos. Por exemplo, fucosilação desempenha um papel importante na determinação do grupo sanguíneo, reacções imunológicas, e vias de transdução de sinal [29]. Síntese de fucose ocorre através de duas vias principais [30]; isto é,
de novo
e salvamento. No primeiro caso, GDP-fucose é sintetizado a partir de GDP-manose através de duas reacções enzimáticas. Neste último fucose, livres derivados a partir de fontes extracelulares ou lisossomais [31], ou a partir de fontes dietéticas (ou meio de cultura
In vitro
) é transportada através da membrana plasmática para o citosol. Embora os mecanismos precisos permanecem obscuros, aumento dos níveis de fucose são frequentemente encontrados no soro e urina de pacientes com câncer, incluindo câncer pancreático, câncer colorretal e câncer gástrico [32] – [34], o que sugere que fucosila�o é aumentada no cancro células.
expressão aumentada de fucosiltransferases (fûts) também tem sido relatados em vários tipos de câncer. Para a síntese de CA19-9, Futs adicionar L-fucose na α (1,3) e α (1,4) de ligação aos precursores sialilados [35] – [37]. Fûts são enzimas-chave acelerando a transformação maligna através do fucosila�o de diferentes precursores sialilados [32], [35] – [37]. Tem sido relatado que a actividade aumentada de FUT3 está associada com aumento do potencial metastático de células de adenocarcinoma pancreático [38], sugerindo que fucosilação pode desempenhar um papel importante na progressão da doença. Estas observações indicam uma alta exigência de L-fucose por várias células de câncer [22], [24].
Com isto em mente, desenvolvemos G-Bound-fucose nanopartículas como veículos para a entrega de drogas anticâncer especificamente a estas células
via endocitose mediada por receptor. Nós modificámos o tamanho das nanopartículas para permitir a penetração através dos poros capilares menores dentro da vasculatura do cancro, mas não através da barreira hemato-encefálica, através de efeitos EPR [16]. Além disso, a fim de evitar aprisionamento não específico pelo RES, hidrofilização da superfície do lipossoma foi levada a cabo num esforço para prolongar a retenção sistémica e encapsulamento do fármaco anti-cancro, a cisplatina. Aqui nós relatamos que os lipossomas L-fucose-bound por via intravenosa injetada contendo cisplatina pode ser entregue com sucesso a células de câncer pancreático que expressam antígenos fucosilados. Isso resultou na inibição do crescimento tumoral eficiente, bem como a sobrevivência prolongada em ratinhos portadores de tumor.
Resultados
Produção e propriedades físico-químicas lipossomas L-bound-fucose
aminados L -fucose foi reticulado por meio de 3,3′-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) para os lipossomas preparados pelo método de diálise colato modificado para se conseguir uma concentração final de 25 ug /ml (F25) ou 50 ug /ml (F50). BS
3 e Tris foram então acoplados para hidrofilizar a superfície de lipossomas (Figura 1A), que pode impedir a absorção pelo RES no fígado e baço e por macrófagos e células endoteliais vasculares, e também pode prevenir a adsorção de opsonina proteínas plasma. Por conseguinte, a retenção sistémica dos liposomas é prolongada [39]. Exame por microscopia electrónica de transmissão revelou que quase todos os L-fucose ligados a lipossomas (Fuc-lipossomas) eram de forma esférica e, no caso de Cy5.5-encapsulação, foi de aproximadamente 80-90 nm de tamanho (Figura 1B, C, e Tabela S1). Este tamanho de partícula está de acordo com as medições efectuadas pela Zetasizer Nano-S90 (Figura 1C). O potencial zeta, que representa a carga eléctrica negativa da superfície do lipossoma, estava abaixo de -40 mV (Figura 1D, e a Tabela S1, S2), que é suficientemente hidrofilizada para a função discrição. distribuição de tamanho de partículas manteve-se estável após armazenagem a 4 ° C durante 6 meses.
(A) em lipossomas esquema de preparação, apresentando as cadeias de açúcar. HSA, BS
3, Tris, e DTSSP denotar o seguinte, respectivamente: albumina de soro humano; bis (sulfosuccinimidil) suberato; Tris (hidroximetil) aminometano; 3,3-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate). (B) Electron imagem microscópica de lipossoma L-bound-fucose. Barra de escala mostra 50 nm. (C, D) Caracterização físico-química de Fuc-lipossoma-Cy5.5. tamanho de partícula médio (C) e potencial zeta (D) de lipossomas que foram preparadas em água foi determinado por espectrofotometria de dispersão de luz dinâmica.
Transferência de Fuc-lipossoma-Cy5.5 e em -FAM as células cancerosas
in vitro
experimentos, avaliou-se a produção de CA19-9 em células de cancro do pâncreas e descobriram que BxPC-3, AsPC-1, PK59 e HuCCT1 secretado quantidades substanciais de esta molécula (Figura 2A). Além disso, a análise por citometria de fluxo revelou também que a quantidade de membrana CA19-9-ligado era elevada nas células que segregaram CA19-9 (Figura S1). CA19-9 ligada à membrana não poderia ser detectado por ELISA em linhas de células que não secretam CA19-9 (Figura S1). Com base nestes resultados, dividimos linhas celulares de cancro do pâncreas em dois grupos de acordo com o nível de CA19-9; isto é, alta produtores e não produtores células CA19-9.
(A) Concentração de CA19-9 secretada a partir de diferentes linhas celulares de cancro pancreático. Cinco milhões de células foram incubadas em meio isento de soro durante 48 horas e a concentração de CA19-9 foi medida por ELISA. (B) As células BxPC-3 foram incubadas com Fuc-lipossoma-FAM na presença ou ausência de excesso de L-fucose, durante 2 horas, em seguida, lavadas e observadas por microscopia confocal a laser. Barra de escala, 10