Abstract
A ativação do peroxissoma proliferador-ativado receptor-γ (PPAR) inibe o crescimento de células de câncer, incluindo câncer de pulmão não-pequenas células ( NSCLC). Clinicamente, o uso de tiazolidinedionas, que são activadores de PPARy farmacológicas está associada com um risco mais baixo de desenvolver cancro do pulmão. No entanto, o papel da via em metástases de cancro do pulmão não foi examinado bem. O efeito sistémico da pioglitazona foi examinado em dois modelos de metástase de câncer de pulmão em ratos imuno-competentes. Num modelo ortotópico, células de cancro de pulmão de murino implantadas nos pulmões de ratinhos singeneicos metástase para o fígado e o cérebro. Como um segundo modelo, as células cancerosas injectadas subcutaneamente metástase para o pulmão. Em ambos os modelos de administração sistémica de pioglitazona aumentou a taxa de metástase. O exame de tecidos a partir do modelo ortotópico demonstraram aumento no número de macrófagos arginase I-positivo em tumores de animais tratados com pioglitazona. Em experiências de co-cultura de células cancerosas com os macrófagos derivados da medula óssea, pioglitazona promovido arginase I expressão em macrófagos e esta era dependente da expressão de PPARy nos macrófagos. Para avaliar a contribuição de PPAR em macrófagos para a progressão do câncer, os experimentos foram realizados em ossos animais transplantados de medula que recebem medula óssea de Lys-M-Cre + /PPAR
Flox /Flox ratos, em que o PPARy é excluído especificamente nas células mielóides ( PPAR-Mac
neg), ou controle de PPAR ratos
Flox /Flox. Em ambos os modelos, os ratinhos que receberam PPAR-Mac
medula óssea neg teve uma diminuição acentuada nos tumores secundários que não foi significativamente alterada pelo tratamento com pioglitazona. Isto foi associado com números reduzidos de células arginase I-positivos no pulmão. Estes dados suportam um modelo no qual a activação de PPARy pode ter efeitos opostos sobre a progressão do tumor, com efeitos anti-tumorigénica de células cancerosas, mas os efeitos pró-tumorigénica em células do microambiente, especificamente células mielóides
citação.: Li H, Sorenson aL, Poczobutt J, Amin J, Joyal T, T Sullivan, et al. (2011) A ativação do PPAR em células mielóides Promove Lung Cancer progressão e metástase. PLoS ONE 6 (12): e28133. doi: 10.1371 /journal.pone.0028133
editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemanha |
Recebido: 26 de agosto de 2011; Aceite: 1 de novembro de 2011; Publicação: 01 de dezembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do NIH (CA103618, CA108610, e CA58187), bem como um Grant piloto do SPORE sobre Câncer de pulmão ao Dr. Weiser-Evans. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer em homens e mulheres em todo o mundo, e as taxas de sobrevivência permanecem baixos [1]. A principal razão é que muitos pacientes apresentam doença avançada e metástases no momento do diagnóstico. Portanto, estudos translacionais destinadas a identificar fármacos que inibem a metástase são essenciais para melhorar os resultados clínicos. Apesar de alterações genéticas em células cancerosas dirige a iniciação do tumor, o microambiente do tumor desempenham um papel fundamental na progressão tumoral e metástase [2]. As interacções entre células tumorais e células no microambiente tumoral (células vasculares, por exemplo, células do sistema imunológico, fibroblastos) e angiogénese de tumor de controlo pode promover um fenótipo mais agressivo. Estas interacções célula-célula são mediadas através de citocinas e factores de crescimento inicialmente produzidas pelas células tumorais, que resultam no recrutamento das células imunes e vascular. O papel do microambiente do tumor no cancro do pulmão não tenha sido tão amplamente estudada como em outros tipos de cancro, tais como cancro da mama e da próstata, pelo menos em parte devido à falta de bons modelos animais. modelos de carcinogênese química têm sido importantes no estudo de iniciação do tumor, mas os tumores resultantes são geralmente adenomas que não metastatizam. modelos genéticos do rato, também têm sido empregados, mas embora estes adenocarcinomas forma, são muitas vezes fracamente metatastic [3]. Estudos com linhas de células de cancro do pulmão humano foram utilizados modelos de xenoenxerto de tumor, em que as células são inoculadas subcutaneamente em roedores imunocomprometidos. Assim, o ambiente no qual o tumor se desenvolve primário não é o pulmão, e o papel cheio de células imunes em progressão do tumor não pode ser avaliada. Por conseguinte, foi desenvolvido um modelo ortotópico em que as células tumorais de rato derivadas de tumores pulmonares em ratinhos C57BL /6 [4] são directamente injectados para dentro dos pulmões de ratinhos singeneicos [5], que permite uma avaliação da progressão de tumores e metástases em animais imunocompetentes. Isto proporciona um sistema no qual clinicamente relevante para testar a eficácia de novos produtos farmacêuticos /estratégias desenhadas para combater a progressão e metástase do cancro de pulmão.
peroxissoma activado pelo proliferador do receptor-γ (PPARy) é um membro do receptor de hormona nuclear superfamília de factores de transcrição activados por ligandos [6]. A via clássica de PPARγactivation envolve a ligação como um heterodímero com o receptor de ácido retinóico X para seqüências específicas de DNA nos promotores de genes alvo. ligação ao ligando provoca uma alteração conformacional, que resulta na libertação de co-repressores e a ligação de co-activadores. PPARy também tem sido demonstrado que se ligam a outros factores de transcrição, resultando em transrepressão [6]. activadores de PPARy endógenos incluem poli-insaturados ácidos gordos e eicosanóides, enquanto activadores de PPARy sintéticas incluem as tiazolidinedionas (TZDs), tais como rosiglitazona e pioglitazona [7]. Tem sido bem documentado que a activação de PPARy tem um papel crítico na activação de adipócitos e diferenciação. Recentemente, no entanto, PPARy tem também sido implicada na regulação vários tipos de cancro, incluindo o cancro do pulmão. Análise de tumores pulmonares humanos relatou que a diminuição da expressão de PPARy é correlacionada com um mau prognóstico [8]. Importante, um estudo retrospectivo examinar a incidência de câncer em pacientes diabéticos em uso de TZDs demonstrou uma redução de 33% no risco de câncer de pulmão [9], com uma redução ainda mais dramática em pacientes diabéticos afro-americanos (75%). Esta diminuição do risco foi específica para o cancro do pulmão, sem efeito protetor observado para próstata ou câncer de cólon. Estudos pré-clínicos do nosso laboratório demonstrou que a activação de PPARy em linhas de células não-pequenas do pulmão (NSCLC) humanos inibiu o crescimento e invasividade transformada, e promoveu um fenótipo mais diferenciado [10], [11]. Além disso alvo sobre-expressão de PPARy em ratinhos para distal tipo II células epiteliais alveolares teve efeitos quimiopreventivos por inibição da iniciação do tumor pulmonar [12]. Colectivamente, estes estudos sugerem que a segmentação PPAR pode ter aplicações quimiopreventivos importantes para o cancro do pulmão. No entanto, o papel da activação do PPARy por administração sistémica de TZD na regulação da progressão tumoral e metástases de cancro do pulmão não tem sido bem estudada. Na verdade, o estudo clínico retrospectivo que mostrou diminuição da incidência de câncer de pulmão em diabéticos tratados com TZDs excluídos os indivíduos que tinham um diagnóstico pré-existente de câncer [9]. O objetivo do nosso estudo foi determinar o efeito da ativação do PPAR sistêmica na progressão do câncer de pulmão e metástase usando a pioglitazona TZD em nosso modelo imunocompetentes ortotópico. Em contraste com a nossa hipótese original que a pioglitazona exerceriam efeitos protectores nas metástases do cancro do pulmão, aqui referidos os achados inesperados que a administração sistémica de pioglitazona acelera a taxa de progressão do tumor de pulmão e metástase, e este é mediada através da activação de células mielóides PPARγin.
Resultados
a pioglitazona alimentados ratos apresentam aumento progressão do câncer de pulmão e metástase
Para avaliar o efeito da pioglitazona administrada sistemicamente na progressão e metástase de câncer de pulmão em camundongos imuno-competente que usamos CMT /167 células, de uma linha celular de adenocarcinoma de pulmão derivados de ratinhos C57BL /6 [13]. Nós mostramos anteriormente que a injecção destas células nos pulmões de singeneicos C57BL /6 ratos resulta em um tumor primário, que, subsequentemente, progride para formar tumores pulmonares secundárias, e metástases para os nódulos linfáticos e órgãos distantes [5]. Experiências in vitro demonstraram que a pioglitazona inibe a capacidade de invasão dessas células (Figura S1), e promove um fenótipo mais diferenciado em 3-dimensional culturas Matrigel (Figura S1), de acordo com o que temos observado com a ativação do PPAR em NSCLC humana [10]. Para examinar o papel sistémico de PPARy in vivo de tipo selvagem C57BL /6 murganhos foram colocados no controle ou ração impregnada de pioglitazona 7 dias antes das injecções de células de cancro e ao longo do curso do experimento. Após 7 dias, as células cancerosas que expressam estavelmente luciferase (CMT /167-Luc) suspensas em Matrigel (BD Biosciences) foram injectados através da caixa torácica no lóbulo esquerdo de ratinhos, como descrito anteriormente [5]. a formação do tumor primário foi analisada 3 dias após as injeções por in vivo imagiologia bioluminescente; ratos que não mostram o desenvolvimento de um tumor primário foram retirados do estudo. A vários tempos após injecção, os ratinhos foram sacrificados e os pulmões, coração, fígado e cérebro removido por ex vivo imagem de bioluminescência e análise histológica. Exame de H E coradas secções de pulmão revelou grandes tumores primários e a presença de células de cancro intravasamento em vasos sanguíneos adjacentes aos tumores primários, bem como o extravasamento de células de cancro a partir de vasos sanguíneos em outros lobos pulmonares (Figura 1A). O crescimento do tumor primário não foi significativamente diferente entre os dois grupos de ratinhos (Figura 1B). Em contraste, os ratinhos alimentados com pioglitazona exibiram acentuadamente um aumento do número de metástases pulmonares secundários, que foram determinadas por contagem do número de tumores em H E secções de pulmão (Figura 1C). A incidência de metástases do fígado e cérebro foi quantificada em 25-30 dias após a injecção por ex vivo a imagem de bioluminescência. A incidência de metástases no fígado em ratos tratados com a pioglitazona foi duas vezes superior à do grupo de controlo (Figura 1D, E). No grupo tratado com a pioglitazona, aproximadamente, 10% dos animais desenvolveram metástases cerebrais, enquanto não há metástases cerebrais foram detectados no grupo de controlo (Figura 1D, F). A sobrevivência global não foi diferente entre os dois grupos de ratinhos (Figura 1G). Para validar que os ratos ração impregnada de pioglitazona alimentados recebeu a droga e que PPARy estava a ser activado, o soro foi recolhido e os níveis de adiponectina foram medidos por ELISA. Como foi publicado anteriormente [14], os níveis de adiponectina de soro foram aumentadas no prazo de 7 dias de administração de pioglitazona e permaneceram elevados após 23 dias (Figura 1H).
Quer dieta normal
de tipo selvagem C57BL /6 ratos foram alimentados Chow ou impregnado com a pioglitazona (0,05%) durante 1 semana antes da implantação de células de tumor e ao longo do curso do experimento. células CMT /167-luc (10
5) foram ortotopicamente injectado no pulmão esquerdo, tal como descrito na secção de Métodos. Pulmões, fígado e cérebro foram colhidas 25-30 dias após a injecção.
A
.
Hematoxilina-eosina secções coradas de pulmões portadores de tumor. As setas indicam os tumores pulmonares primárias ou secundárias, bem como tumores em intravasating ou extravasar para fora de um vaso sanguíneo.
B
.
Quantificação do diâmetro do tumor primário no controle (n = 17) e (n = 16) animais tratados com pioglitazona medidos usando paquímetro digital.
C.
Número de tumores pulmonares secundárias em camundongos C57BL /6 alimentados com ração normal ou pioglitazona ração foram determinados por meio da quantificação tumores em secções coradas por hematoxilina-eosina pelo meio dos pulmões. Os dados são médias e S.D. de contagens de 12-16 animais em cada grupo.
D.
Percentagem de camundongos C57BL /6 alimentados com ração normal (n = 17) ou ração impregnado com pioglitazona (n = 16) com metástases hepáticas e cerebrais. metástases fígado e cérebro foram identificados por
ex vivo
bioluminescente imagiologia de órgãos no momento do sacrifício e foram confirmados por histologia.
E.
Imagens bioluminescentes representativos de metástases hepáticas em camundongos alimentados com ração normal (painel superior esquerdo) ou ração impregnado com pioglitazona (painel superior direito). imagens bioluminescentes representativas dos cérebros de ratos alimentados com ração normal (painel inferior esquerdo) ou ração impregnado com pioglitazona (painel inferior direito).
F
.
Kaplan-Meier curva de sobrevida de camundongos C57BL /6 injectados com células /167-luc CMT alimentados controlo ou comida impregnado com pioglitazona.
concentrações G.
Média séricos de adiponectina em camundongos C57BL /6 alimentados com ração normal ou ração impregnado com pioglitazona. Para todos os gráficos * P . 0,05 vs controlo
pioglitazona administrado sistemicamente aumenta o número de arginase I-positivos macrófagos dentro tumores
recrutamento de células derivadas de medula óssea, e em especial monócitos /macrófagos, contribui para o microambiente tumoral e está associada com tumores mais agressivos, malignas [15]. Para caracterizar os efeitos da activação de PPARy sistémica induzida por pioglitazona no recrutamento de células de medula óssea e a progressão do tumor, os ratinhos receberam WT transplantes de medula óssea de UBI-EGFP /dadores B6 transgénicos, que expressam EGFP em todas as células. Depois de permitir que 6 semanas para a recuperação, os animais foram colocados na ração apropriada durante 7 dias, e em seguida injectados com células /167-luc CMT. Os animais foram mantidos em ambos impregnado de pioglitazona ou controlo de comida ao longo do curso do experimento. secções de pulmão foram examinadas para GFP, e mac3 expressão arginase I por imunofluorescência triplo para verificar o recrutamento de macrófagos derivados de medula óssea e para determinar se os macrófagos recrutados são polarizados para expressar uma alternativa M2, fenótipo anti-inflamatória. Ambos os grupos de murganhos exibiram notáveis números de GFP (+) MAC3 (+) células vizinhas do tumor (Figura 2A; imagem representativa da secção de pulmão pioglitazona-FED), indicando que a maioria das células da medula óssea são recrutados macrófagos. Além disso, verificou-se que a grande maioria das células arginase I-positiva dentro e tumores circundantes foram macrófagos MAC3 (+) (Figura 2A). macrófagos associados a tumores (TAMs) foram quantificados por contagem MAC3 (+) células de tumores primários de ambos os grupos de ratinhos. Embora nenhuma diferença no número total de macrófagos em torno de tumores primários de pulmão foram encontradas entre os dois grupos de ratinhos utilizados no nosso experimento pulmão ortotópica (dados não mostrados), o número de macrófagos arginase I-positiva dentro de tumores primários foi significativamente aumentada em ratinhos alimentados Chow impregnado de pioglitazona 16 dias após o implante de células tumorais (Figura 2B).
a.
coloração de imunofluorescência Representante para GFP (a), mAC3 (b), arginase I (c), e a sobreposição de todos os três com DAPI (d) num tumor primário e tecidos circundantes 16 dias após injecção de células de cancro a partir de um rato receptor tratados com pioglitazona que recebeu um transplante de medula óssea de um dador transgénico UBI-EGFP. O asterisco indica o tumor.
B.
Quantificação da arginase células I-positivos dentro dos tumores 16 dias após a injecção. Os dados são médias e S.E.M. de contagens de 11-13 animais em cada grupo, utilizando 1-2 diapositivos por animal e contando 4 campos aleatórios por lâmina. * P 0,05 vs controlo.
C. Macrófagos derivados de medula
osso isolados como descrito na secção de Métodos foram estimuladas durante 18 horas, quer com IFN-y /LPS ou de IL-4 e analisadas quanto à expressão da arginase I.
D.
células idênticas a partir de (C) foram cultivados sozinhos ou em co-cultura com CMT /167 células durante 3 dias na ausência ou na presença de pioglitazona (10 uM). Os lisados celulares foram coradas imunologicamente para arginase I.
E.
lisados de células inteiras de WT, PPAR
Flox /Flox (Fl /Fl), ou PPAR-Mac
neg (KO) macrófagos foram analisadas para PPARγexpression.
F.
WT, PPAR
Flox /Flox, ou PPARy-Mac
neg macrófagos foram co-cultivadas com CMT /167 células na presença ou ausência de pioglitazona (10 uM). Os lisados celulares foram analisados quanto à expressão da arginase I. medições de densitometria mostrando níveis normalizados relativos ao controle são exibidos abaixo do western blot (média de três experiências independentes). A análise densitométrica foi efectuada utilizando o software ImageJ (NIH, Bethesda, MD) como descrito na secção de Métodos. * P 0,05 vs controlo WT, ** P 0,05 vs WT PIO. Para todos os Westerns, b-actina foi usado como um controle de carga.
A pioglitazona promove uma “M2” fenótipo de macrófagos pró-tumorigénico em co-culturas de células cancerosas e macrófagos
Para determinar se o PPARy desempenha um papel em macrófagos M2 polarização, células de medula óssea isoladas a partir de ratinhos de tipo selvagem C57BL /6 machos foram cultivadas na presença de M-CSF recombinante para promover a diferenciação em macrófagos [16]. Estas células têm a morfologia dos macrófagos, são 95% F4 /80 positiva, e não expressam níveis notáveis de qualquer de iNOS ou arginase I, marcadores de M1 e M2 fenótipos de macrófagos, respectivamente [17]. A estimulação destas células com IL-4 expressão I induzida arginase, consistente com um fenótipo M2 (Figura 2C). Para examinar os efeitos da pioglitazona sobre as interacções entre as células e macrófagos cancerosas, macrófagos derivados de medula óssea foram co-cultivadas com células CMT /167 durante três dias na ausência ou na presença de pioglitazona (10 uM) utilizando Transwells que permitem que os mediadores difundíveis para agir em cada tipo de célula. células CMT /167 induzida selectivamente a expressão de arginase I em macrófagos (Figura 2D), com nenhum efeito na expressão de iNOS (não mostrado). Pioglitazona como agente único não afectou a expressão de qualquer arginase I ou iNOS. No entanto, a expressão da arginase I foi melhorada em co-culturas tratadas com pioglitazona (Figura 2D).
Para definir a contribuição de PPARy em macrófagos para indução da arginase I, macrófagos derivados de medula óssea foram isoladas a partir de H-Lys -Cre × PPAR
Flox /Flox ratos, em que o PPARy é excluída seletivamente em linhagens mielóides (PPAR-Mac
neg), ou ratos de controle (PPAR
Flox /Flox) ratos. Expressão de PPAR não foi detectada em macrófagos de PPAR-Mac
camundongos NEG, enquanto WT e PPAR
Flox /Flox tinham níveis comparáveis de expressão (Figura 2E). Importante, co-culturas de CMT /167 células com PPARy-Mac
macrófagos neg resultou em níveis mais baixos de expressão que arginase nestes macrófagos em comparação para controlar macrófagos (Figura 2F). Estes dados indicam que a activação de PPARy em macrófagos colabora com os sinais a partir de células cancerosas para promover o fenótipo M2. Note-se que a pioglitazona ainda modestamente aumento da expressão arginase I nos PPAR-Mac
macrófagos neg, sugerindo alguma contribuição de efeitos PPAR-independentes “off-alvo”.
eliminação sistemática de PPAR em macrófagos inibe metástase
Para avaliar o papel do PPAR em macrófagos in vivo, foram realizados transplantes de medula óssea, em que ratinhos WT receberam transplantes de medula óssea a partir de qualquer PPAR-Mac
neg ou controlar PPAR
Flox /Flox doadores. Seis semanas após o transplante, os animais foram colocados em impregnado de pioglitazona ou controlo Chow durante 7 dias, seguido de implantação de 10
5 CMT células /167-luc para o pulmão. Os animais foram mantidos em ambos impregnado de pioglitazona ou controlo Chow, até que foram sacrificados 4 semanas após a implantação do tumor. tumores pulmonares secundárias foram quantificados por contagem de metástases visíveis sob um microscópio de dissecação e confirmado por histologia. Como mostrado na Figura 3A, o número de tumores pulmonares foi grandemente inibida secundárias em todos os ratinhos que receberam medula óssea de PPARy-Mac
ratinhos Neg. Pioglitazona aumentaram tumores pulmonares secundárias em ratos de controle, de acordo com os nossos resultados em camundongos untransplanted. No entanto, a pioglitazona não aumentou significativamente o número de metástases do pulmão em ratinhos transplantados com medula óssea de PPARy-Mac
ratinhos NEG (Figura 3A). Representante histologia dos tumores pulmonares secundárias é mostrado na Figura 3B. O tamanho médio das metástases não foi significativamente diferente em qualquer um dos quatro grupos (dados não apresentados). Foram examinados os macrófagos positivos a arginase I nos pulmões de animais portadores de tumores. A pioglitazona não alterou o número de células I-positiva arginase no controle PPAR
Flox /Flox pulmões. No entanto, os pulmões de PPAR-Mac
camundongos neg na ração controle apresentou uma redução estatística na arginase I células positivas; pioglitazona aumentou o número destas células para níveis observados em PPAR
Flox /Flox ratinhos (Figura 3C e D). Em todos os casos, a grande maioria das células positivas da arginase I coradas positivas para marcadores de macrófagos (dados não mostrados).
A seguir à irradiação letal, WT C57BL /6 ratos recebeu medula óssea a partir de qualquer PPARy-Mac
NEG ( camundongos doadores KO) ou PPAR
Flox /Flox (Flox) conforme descrito na seção “Métodos”. Após 5 semanas de recuperação para permitir o enxerto, os ratos foram colocados em cada ração ou ração de controlo durante 1 semana antes da implantação de células de tumor e ao longo do curso do experimento contendo pioglitazona. Os animais foram injectados com 10
5 CMT células /167-luc ortotopicamente como na Fig. 1. Quatro semanas após a inoculação de células de cancro, os animais foram fotografadas por bioluminescência e sacrificados.
A.
O número de tumores pulmonares secundárias foi quantificada por exame sob um microscópio de dissecação. Os tumores foram contadas por dois observadores cegos independentes. Os dados são médias e S.E.M. de contagens de 6-9 animais em cada grupo. Os ratinhos que receberam PPAR-Mac
neg medula óssea tinha um número significativamente menor número de tumores pulmonares secundárias do que os ratos que receberam PPAR
Flox /Flox. * P 0,05 vs controlo Flox. ** P 0,05 vs controlo Flox.
B
representativas histologia (H E). É mostrado para os tumores pulmonares secundárias a partir de todos os 4 grupos de animais.
C. Secções de pulmão com tumor
de WT PPAR
Flox /Flox ou PPAR-Mac
camundongos neg marcação imunoistoquímica para arginase I (cor marrom reacção). Imagens representativas são mostrados de pulmões de todos os 4 grupos de animais.
D.
O número de arginase células I-positivos foi quantificado por dois observadores cegos independentes. Os dados são médias e S.E.M. de contagens de 6-9 animais em cada grupo. Pulmões de PPAR-Mac
camundongos neg na ração controle apresentou uma redução estatística na arginase I células positivas; pioglitazona aumentou o número destas células para níveis vistos em PPAR
Flox /Flox ratos. * P . 0,05 vs controle Flox
Para confirmar os resultados em nosso modelo ortotópico, empregamos um segundo modelo no qual as células tumorais foram implantadas subcutaneamente nos flancos de camundongos C57BL /6 alimentados normal ou -pioglitazona impregnada de comida. Usamos WT C57BL /6 ratos transplantados com medula óssea de qualquer PPAR-Mac
camundongos neg ou controle de PPAR
Flox /Flox ratos. Seis semanas após o transplante, os animais foram colocados em impregnado de pioglitazona ou controlo Chow durante 7 dias, seguido de implantação de 10
5 CMT células /167-luc para o flanco. Os animais foram mantidos em ambos impregnado de pioglitazona ou controlo Chow, até que foram sacrificados 4 semanas após a implantação do tumor. o tamanho do tumor primário foi medido com compassos de calibre e metástases pulmonares digitais foram quantificados por contagem de metástases visíveis sob um microscópio de dissecação e confirmado por histologia. Como mostrado na Figura 4A, o volume do tumor primário foi semelhante em PPAR
Flox /Flox ratos na presença ou ausência de pioglitazona, bem como em PPARy-Mac
ratinhos neg sobre Chow controlo; PPAR-Mac
camundongos neg receberam pioglitazona apresentaram uma redução modesta no tamanho do tumor primário. Importante e semelhante ao nosso modelo ortotópico, pioglitazona aumento marcado das metástases pulmonares em PPAR
Flox /Flox camundongos em relação ao controle chow-fed PPAR
Flox /Flox ratos (Figura 4B). Em contraste, a pioglitazona não conseguiu aumentar significativamente o número de metástases pulmonares em PPARy-Mac
ratinhos NEG (Figura 4B). histologia representativa das metástases pulmonares é mostrado na Figura 4C. O tamanho médio das metástases não foi significativamente diferente em qualquer um dos quatro grupos (dados não apresentados). Em geral, não se observou uma correlação entre o tamanho do tumor primário e de metástases em qualquer um dos modelos que estudámos. Além disso, e semelhante ao modelo ortotópico, pioglitazona não alterou o número de células de arginase I-positiva nos pulmões de PPAR
Flox /Flox ratinhos. No entanto, o número de células arginase I-positivas foi significativamente diminuído em PPARy-MAC
ratinhos NEG, tanto em condições de controlo e na presença de pioglitazona (Figura 4D, E). Por fim, para determinar se os efeitos sobre a metástase eram específicos para pioglitazona, as experiências foram repetidas usando Chow impregnado com rosiglitazona, noutro TZD. A exposição a rosiglitazona mostrou aumentos semelhantes na incidência de metástases, mas nenhuma mudança no volume do tumor primário (Figura S2).
A seguir à irradiação letal, WT C57BL /6 ratos recebeu medula óssea a partir de qualquer PPARy-Mac
neg (KO) ou PPAR
Flox /Flox (Flox) ratos doadores, conforme descrito na seção “Métodos”. Após 5 semanas de recuperação para permitir o enxerto, os ratos foram colocados em cada ração ou ração de controlo durante 1 semana antes da implantação de células de tumor e ao longo do curso do experimento contendo pioglitazona. Os animais foram então injectados com 10
5 CMT células /167-luc subcutaneamente. Os animais foram visualizados por bioluminescência, e sacrificados 4 semanas após a inoculação de células de cancro.
A.
Volumes tumor primário em todos os ratos foram medidos usando paquímetro digital. Os dados são médias e S.E.M. de contagens de 9-14 animais em cada grupo. * P 0,05 vs controlo Flox.
B.
Incidência de metástase pulmonar foi quantificada por exame sob um microscópio de dissecação. Os tumores foram contadas por dois observadores cegos independentes. Os dados são médias e S.E.M. de contagens de 9-14 animais em cada grupo. A pioglitazona aumento da incidência de metástases em ratinhos WT, mas não em ratinhos que receberam PPARy-Mac
medula óssea neg. * P 0,05 vs controlo Flox. ** P 0,05 vs Flox Pio.
C.
Histologia Representante é mostrado para metástases pulmonares de todos os 4 grupos de animais.
D. Secções de pulmão com tumor
de WT ou PPAR-Mac
camundongos neg marcação imunoistoquímica para arginase I (cor marrom reacção). Imagens representativas são mostrados de pulmões de todos os 4 grupos de animais.
E.
O número de arginase células I-positivos foi contado por dois observadores cegos independentes. Os dados são médias e S.E.M. da conta de 9-14 animais em cada grupo com uma seção por animal e 4 campos aleatórios por lâmina. O número de células arginase I-positivos foi significativamente diminuído em PPAR-Mac
camundongos neg, tanto em condições de controle e na presença de pioglitazona. * P . 0,05 vs controle Flox
Discussão
carcinoma pulmonar de células não pequenas (NSCLC) é responsável pela maioria dos casos de câncer de pulmão, que é a principal causa de câncer mortes no mundo. são urgentemente necessárias abordagens terapêuticas inovadoras para o tratamento de câncer de pulmão. Com base em estudos clínicos retrospectivos [9], há um interesse considerável na utilização de TZDs como potencial quimiopreventivo ou agentes quimioterapêuticos no tratamento do cancro do pulmão. Isto é apoiado por estudos extensos que demonstram os efeitos da activação de PPARy em células cancerosas na inibição do crescimento transformado [18], a indução de apoptose [19], [20], e promoção da diferenciação de [10], [21]. Além disso, os activadores de PPAR têm sido mostrados para inibir a iniciação do tumor em um modelo de carcinogénese química [22]. No entanto, em contraste com a iniciação do cancro, que é largamente mediada por meio de alterações em células epiteliais transformadas, progressão de tumores e metástases envolve interacções críticas entre o tumor e o microambiente. Na série de experiências, relatamos aqui, a administração sistémica de pioglitazona com ratinhos acelerada progressão tumoral e metástase em dois modelos independentes de cancro do pulmão de células não-pequenas. Isto reflectiu-se em aumentos tanto na incidência e o número de metástases órgão distante que não se correlacionam com o tamanho do tumor primário. Importante e contrariamente ao que estava previsto, a administração sistémica da pioglitazona exerceu nenhum benefício de sobrevivência em comparação com ratinhos de controlo.
Há várias razões possíveis para esses achados aparentemente não previstos. Em primeiro lugar, ao contrário de estudos em NSCLC humana, os nossos estudos utilizaram-se células de cancro de pulmão de murino, que podem se comportar de forma diferente do que as células NSCLC humanas. No entanto, os nossos resultados não suportam isso. Ativação de PPARγin CMT /167 células invasão inibida e promoveu um fenótipo mais diferenciado na cultura 3D (Informações de Apoio S1), semelhante ao que temos observado em linhas de NSCLC humanos [10]. Em vez disso, propõe-se que os efeitos de pioglitazona na aceleração da progressão do tumor e metástases estão em grande parte mediada através de efeitos sobre o microambiente do tumor. De fato, os ratos com uma deleção alvo de PPARy em linhagens mielóides mostraram marcadamente menos tumores pulmonares secundárias em nosso modelo ortotópico, e menos metástases pulmonares em nosso modelo de flanco. Além disso pioglitazona não conseguiu aumentar tumores pulmonares em ambos os modelos knockout. Estes dados para o nosso conhecimento são a primeira demonstração de uma função importante de PPARy no microambiente do tumor em progressão tumoral e metástases. Além disso, com base nos nossos estudos in vitro, nós propomos que PPARy em macrófagos é essencial para a conversão dos macrófagos em um fenótipo alternativamente activados na presença de células cancerosas que foi mostrado para promover metástases [23]. Co-cultura de macrófagos WT com células cancerosas resultou na indução da expressão de arginase Eu, um marcador clássico de macrófagos alternativamente activados, com aumentos na expressão observada na presença de pioglitazona; este foi marcadamente atenuada se macrófagos deficientes em PPARy foram utilizados para co-cultura. Além disso, em ambos os modelos de metástases, o número de macrófagos arginase I-positiva no pulmão foi significativamente diminuída em ratinhos com uma deleção alvo de PPARy em células mielóides em comparação com os controlos, indicando que há uma forte correlação entre a activação de PPARy específico de macrófagos e progressão de metástases .
A evidência de estudos clínicos e experimentais indicam macrófagos promover a progressão de tumores sólidos e metástases. Os macrófagos são formados por o microambiente do tumor, de modo que eles adoptar um papel trófico que facilita a angiogénese, a quebra da matriz e a motilidade de células tumorais, as quais são os elementos do processo metastático.