Abstract

Fundo

Foi bem conhecido que o uso clínico de medicamentos quimioterápicos é restrito por reações adversas graves e resistências de drogas. Assim, é necessário descobrir uma estratégia para aumentar a eficiência anti-tumor específica de medicamentos quimioterápicos. Apigenina, uma espécie de flavonóides, tem sido relatada a possuir atividades anticancerígenas com muito baixa toxicidade para o tecido normal.

Metodologia /Principais Achados

Os resultados do ensaio de viabilidade celular, ocidentais-borrões e TdT dUTP mediada por ensaio-biotina rotulagem final Nick (TUNEL) demonstraram os efeitos pró-apoptóticos sinérgicas de uma dose baixa de apigenina e paclitaxel em linhas celulares de cancro humano. Para analisar o mecanismo subjacente, examinámos coloração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), depois as células foram tratadas com uma combinação de paclitaxel e apigenina, ou cada um deles sozinho. Os dados de citometria de fluxo mostrou que superóxidos mas não redução de peróxidos acumulados em células HeLa tratadas com apigenina ou uma combinação de paclitaxel e apigenina. A apigenina e a apoptose de células HeLa induzida por paclitaxel foi relacionado com o nível de ROS nas células. Nós ainda avaliada a actividade de proteína e o nível da enzima superóxido dismutase (SOD). A apigenina inibiu significativamente a actividade SOD mas não alterou o nível de proteína SOD sugerindo que a apigenina promovido acumulação ROS através da repressão de actividade enzimática de SOD. A adição de Zn

2 +, Cu

2 + e Mn

2 + para a célula lisados ​​inibiram efeitos de apigenina sobre a atividade SOD. Ao mesmo tempo, os dados de caspase-2 sobre-expressão e experiências de deslocamento batido demonstrado que a caspase-2 participaram apigenina e a apoptose de células HeLa induzida por paclitaxel.

Conclusões /Significado

Tomado em conjunto, este estudo demonstrou que a apigenina podem sensibilizar células de cancro para o paclitaxel a apoptose induzida através de suprimir actividade de SOD, o qual, em seguida, conduziu à acumulação de ROS e a clivagem de caspase-2, sugerindo que a utilização combinada de apigenina e paclitaxel foi um modo eficaz para diminuir a dose de paclitaxel tomadas

Citation:. Xu Y, Xin Y, Diao Y, Lu C, Fu J, Luo L, et al. (2011) Efeitos sinergéticos de apigenina e paclitaxel sobre a apoptose das células cancerosas. PLoS ONE 6 (12): e29169. doi: 10.1371 /journal.pone.0029169

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de julho de 2011; Aceito: 22 de novembro de 2011; Publicação: 21 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Nature Science Foundation da China (Nos. 81072433 e 31071000), Jiangsu major Nature Science Foundation de Ensino Superior (No. 07KJA18026) e um projecto financiado pela Prioridade Academic Programa de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a quimioterapia é um dos tratamentos mais amplamente utilizados para o cancro. No entanto, muitos fármacos quimioterapêuticos pode produzir efeitos colaterais desagradáveis, particularmente quando tomado em doses elevadas. Um dos medicamentos quimioterapêuticos, o paclitaxel, um inibidor mitótico, pode conduzir a reacções de hipersensibilidade [1], neutropenia [2], a neurotoxicidade [3], perturbação do ritmo cardíaco [4] e outros efeitos tóxicos variado [5], o que piora a sério o qualidade de vida de pacientes com câncer e resulta em redução da dose e a interrupção do tratamento. É, portanto, importante para diminuir os efeitos secundários adversos dos agentes quimioterapêuticos no tratamento clínico de cancro. Além disso, a resistência aos medicamentos na terapia clínica, muitas vezes interfere com a eficácia de agentes quimioterápicos.

espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo, peróxido de radical superóxido de hidrogênio (H

2O

2), radical hidroxila, o óxido nítrico, e várias espécies de óxido nítrico derivado do reactivos de nitro (RNS) são formados como subprodutos naturais do metabolismo normal do oxigénio nas células e tecidos humanos. Devido ao seu carácter altamente reativos, eles tendem a envolver-se em reações indesejadas que causam danos às células e, finalmente, levar a doenças. As células cancerosas exibem aumento da glicólise em combinação com uma taxa reduzida de respiração e estas alterações no metabolismo ter sido mostrado para ser associado com o stress oxidativo reforçada [6] – [8]. Um estado redox celular elevada poderia estimular a formação de tumores através da criação de um ambiente proliferativa celular melhorada, induzindo danos no ADN, e desligar as funções de supressão de tumor [9], [10]. O crescimento do tumor e da migração poderia ser inibida

in vitro

por alteração de ambiente em torno de células tumorais de uma forma mais reduzindo um. Em oposição a isso, um estado redox celular de alta também apoiar o aumento da apoptose, o que inibe a formação de tumores. Assim, nas células cancerosas, o estado redox alta poderia aumentar a sua tolerância a estresses ambientais e quimioterápicos. As células de tumor expressa um nível mais elevado de MnSOD indicar um prognóstico pobre [11], [12]. Tem sido demonstrado que as ROS têm potencial capacidade de processar a caspase-2 [13], [14], que é uma caspase iniciadora levou a permeabilização da membrana mitocondrial [15] e é também um membro importante na apoptose circuito de amplificação de sinal [16]. Além disso, estudos anteriores em caspase-2 ratinhos golpeado-out têm mostrado que a activação da caspase-2 foi relacionada com a acumulação de ROS [17]. a taxa de apoptose reduzida também foi detectado em

caspase-2

– /-.

oócitos [18]

A apigenina (4 ‘, 5, 7-trihydroxyflavone) é amplamente contido em muitas frutas e legumes. Recentemente, foi relatado que a apigenina teve um potencial de efeitos anti-tumorais em várias linhas de células de cancro humano com baixa citotoxicidade e qualquer actividade mutagénica. [19] – [21]. Apigenina pode aumentar a acumulação intracelular de ROS e teve o pró-oxidante potencial [22], [23] e diminuir a atividade SOD nas células do câncer de pulmão [24].

No presente trabalho, nós demonstramos que a apigenina poderia sensibilizar células cancerosas para paclitaxel apoptose induzida por meio de suprimir a atividade da SOD e levando à acumulação de ROS e clivagem de caspase-2, sugerindo o uso combinado de apigenina e paclitaxel foi eficaz para a terapia do cancro.

Materiais e Métodos

cultura de células e transfecção

linha de células de carcinoma epitelial cervical humano HeLa, pulmão humano epitelial linha de células de carcinoma A549, a linha de células de carcinoma de hepatócitos negróide humana Hep3B, e as células embrionárias humanas 293A renal (HEK293A) obtida a partir de Instituto de Biochemistry and Cell Biology, Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen) contendo 10% de soro fetal de vitela (Hyclone) e antibióticos (100 ug /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina) com 5% de CO

2 a 37 ° C. transfecção transiente foi realizada com um método de fosfato de cálcio modificado ou utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Em todos os casos, a quantidade total de DNA foi normalizada pelos plasmídeos de controlo vazias.

Antibodies, regentes e DNA constrói

anticorpo monoclonal de ratinho contra Flag-tag foi adquirido de Sigma. Os anticorpos policlonais de coelho contra a polimerase de poli ADP-ribose (PARP), caspase-3 e β-actina foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology. um anticorpo policlonal de ratinho contra a caspase-2 veio da Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos policlonais de coelho contra a caspase-3 clivada veio de Bioworld Tecnologia, Inc. anticorpo monoclonal de ratinho contra anticorpos policlonais de coelho e SOD1 contra SOD2, Endo G e FIA ​​foram obtidos a partir de Abcam. A caspase-2 inibidor benziloxicarbonil-Val-Asp (OMe) -Val-Ala-Asp (OMe) -fluorom etilcetona (Z-VDVAD-FMK) foi obtido a partir de Calbiochem. reagentes ROS detecção (CM-H

2DCFDA e dihydroethidium (DHE)) e apoptótica detecção regente (FITC-anexina V e tampão de iodeto de propídio) eram de Molecular Probes ™ (Invirogen). Dimetil sulfóxido foi de Amresco. A apigenina, paclitaxel e DETC foram adquiridos da Sigma.

pcDNA3.1-Flag-caspase2 (WT) e pRNAU6-caspase2 foram construídos usando técnicas padrão. pcDNA3.1 foi digerido com Xhol e Kpnl. Os iniciadores (sentido: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sentido: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG) foram projetados para gerar pcDNA3.1-flag-caspase2 (WT).

Caspase-2

gene (NM_032982.2) foi sintetizado pela Invitrogen. pRNAU6 foi digerido com Bam HI e Hind III, e os oligonucleótidos de segmentação recozido ACAGCTGTTGTTGAGCGAA para

caspase-2

foi ligado no vector [25].

A viabilidade celular e ensaio de TUNEL

para avaliar a citotoxicidade induzida por paclitaxel, Colorimétrico citotóxica 96 ensaio de citotoxicidade não radioactivo (Promega) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. A viabilidade celular foi detectada por medição da desidrogenase do lactato endógena quantitativamente.

entalhe final rotulagem dUTP-biotina mediada por TdT ensaio (TÚNEL) foi realizada em células HeLa, utilizando Kit de Guava® TUNEL como previamente descrito [26]. As células foram detectados em um sistema goiaba ™ EasyCyte, e os dados foram analisados ​​usando goiaba TUNEL Software (goiaba Technologies, Hayward, CA, EUA). Todos os ensaios foram realizados em três repetições.

anexina V /PI ensaio

ensaio de anexina V /PI, usando anexina V /PI dupla marcação de células não fixadas, distingue entre as células iniciais apoptóticos e tarde apoptóticos /células necróticas. Ambas as células flutuaram e ligados foram suspensos em 500 ul de tampão de ligação (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM

2, 0,1% de BSA). Anexina V-FITC (5 mL) e PI (5 mL) foi então adicionada a cada amostra. Após 15 minutos de incubação no escuro, a análise de citometria de fluxo foi realizada utilizando o Sistema de goiaba EasyCyte ™. Para cada amostra foram analisadas 5000 células. Os dados foram analisados ​​usando Goiaba TUNEL Software (Guava Technologies, Hayward, CA, EUA).

detecção de ROS

As células HeLa foram semeadas em placas de 6 poços e após 24 h, as células foram incubadas corantes específicos com ROS, dihydroethidium DHE (, 5 ^ M) ou CM-H

2DCFDA (5 uM), durante 30 minutos. As células foram subsequentemente tratadas com apigenina (15 uM), paclitaxel (4 nM) ou de ambos, durante mais 30 minutos. ROS foram detectados usando uma goiaba ™ EasyCyte e analisadas com o goiaba Pro Express Software (Goiaba Technologies, Hayward, CA, EUA). DHE foi detectada sob uma emissão no prazo de 580-583 nm (PM1) e CM-H

2DCFDA foi detectada sob uma emissão de 525 nm (PM3).

Isolamento de mitocôndrias e medição de potencial de membrana mitocondrial ( MMP)

mitocôndria intacto foi separado do componente citosólico de células HeLa, para posterior análise da proteína, utilizando mitocôndrias kit de isolamento a partir de Thermo-Pierce Dounce homogeneização e centrifugação diferencial foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante.

potencial de membrana mitocondrial (MMP) de células HeLa foi medida utilizando o Kit de goiaba EasyCyte ™ MitoPotential (goiaba Technologies, Hayward, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. corante à base de Fluorescência 5, 5 ‘, 6, 6′-tetracloro-1, 1’, 3, 3 ‘-tetrethyl benzimidalyl iodeto carbocianina (JC-1) foi usada para avaliar as alterações de MMP. O corante impermeabilizante celular 7-AAD foi utilizado para monitorizar simultaneamente alterações da permeabilidade da membrana celular. As células coradas foram analisadas num sistema de goiaba EasyCyte ™.

ensaio da actividade da superóxido dismutase

A actividade enzimática de SOD em células HeLa foi medida usando kits comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Neste ensaio, o sal de tetrazólio foi utilizado para a detecção de radicais superóxido gerados por oxidase de xantina e hipoxantina. Para medir a actividade de MnSOD, os lisados ​​celulares foram centrifugados a 10000 x g para separar as MnSOD de CuZnSOD, e CuZnSOD foi inibida na presença de cianeto de potássio.

análise de RT-PCR

O ARN total foi extraído utilizando Kit de Isolamento de RNA alta Pure (Roche) de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. RT-PCR foi realizada utilizando a transcriptase reversa M-MLV (Invitrogen) com os iniciadores indicados (

caspase-2

, sentido: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sentido: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG; GAPDH, sentido: CATATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC, anti-sentido: GAATTCTTACTCCTTGGAGGCCATGTGG). A PCR foi efectuada a Tm de 58 ° C durante 30 ciclos em mistura reaccional de 25 mL de cada proteína individual. Os produtos de PCR foram, em seguida, resolvidas em géis de agarose a 1% e coradas com brometo de etídio. A casa mantendo gene GAPDH foi utilizada como um controlo.

análise de Western-blot

Os lisados ​​celulares foram centrifugados (15000 g) a 4 ° C durante 15 min. A análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [27]. Os complexos anticorpo-antigénio foram visualizados pelo sistema de imagem LI-COR Odyssey Infrared de acordo com as instruções do fabricante utilizando o anticorpo IRDye800 Fluoróforo-conjugado (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Determinação de sinergismo

A combinação de drogas foi determinada pelo método de Chou-Talalay. O CI foi calculada pela equação Chou-Talalay, que leva em conta tanto a potência (IC

50 ou D

m) ea acentuada da curva dose-efeito (valor m) [28], [29 ]. O isobolgram clássico (CI = 1) é dada por: (A)

Nos denominadores, (D

x)

1 e (D

x)

2 são os as concentrações de D

1 (apigenina) e D

2 (paclitaxel) usados ​​isoladamente que dão% de inibição x, enquanto que nos numeradas, (D)

1 e (D)

2 são as doses de apigenina e paclitaxel utilizado em combinação isoeffectively que inibem x%. CI 1, IC = 1, e CI . 1 indicam sinergismo, aditivo e antagonismo, respectivamente

A partir da equação do efeito mediano de Chou e Chou et ai. [29], [30], a (D

x)

1 e (D

x)

2 pode ser facilmente calculado. (B)

Aqui D

m é a dose do efeito mediano que obteve a partir do anti-log da X-intercepção da trama do efeito mediano, X-log (D) versus Y = log [f

a /(1-f

a)] ou D

m = 10

– (Y-intercepção) /m, e m é a inclinação do gráfico do efeito mediano. cálculo automatizado de m, D

m, D

x e valores de IC também são permitidos com software de computador.

A análise estatística

Os dados foram representados como média ± SD. O teste t de Student foi aplicado para analisar a significância estatística de variância comparação de pares. Em todas as análises, P 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

O tratamento combinado de apigenina com paclitaxel aumenta significativamente a citotoxicidade de células cancerosas humanas

Desde toxicidade do paclitaxel é. juntamente com a sua actividade antitumoral e apigenina foi reportado como tendo actividade antitumoral com toxicidade baixa, observou-se primeiro os co-efeitos de paclitaxel comcination com apigenina. As células HeLa foram tratados com várias doses de apigenina, paclitaxel ou ambos e, em seguida, as viabilidades celulares foram detectados. Como mostrado na Fig. 1A e B, ambos apigenina e paclitaxel forma dependente da dose induzida por citotoxicidade com redução de aproximadamente 29% de viabilidade celular induzida por apigenina no dose de 25 uM (Fig. 1a) e redução de 24% induzida por paclitaxel em doses de 10 nM (Fig. 1B), respectivamente. Quando se trataram células HeLa com 15 apigenina uM e 4 nM de paclitaxel, foi detectado mais de 50% de redução da viabilidade das células, no entanto, menos do que 20% de redução da viabilidade das células foi observada nas células tratadas com apigenina ou paclitaxel, respectivamente (Fig. 1C). Foi realizado o cálculo Chou-Talalay para confirmar os efeitos sinérgicos de apigenina e paclitaxel em células HeLa. O índice de combinação (IC) foi 0,3918 ± 0,0436 para a dose de 15 uM apigenina e 4 nM de paclitaxel indicando efeitos sinérgicos da apigenina e paclitaxel. Estes resultados indicaram um aumento significativo da citotoxicidade quando apigenina e paclitaxel foram administrados a células HeLa simultaneamente. Também mostrado na Fig. 1C, a combinação de paclitaxel com apigenina induzida os resultados semelhantes nos outros do que as células HeLa e as células Hep3B, incluindo células de cancro A549. No entanto, apigenina 15 uM, 4 nM de paclitaxel ou a combinação deles não resultou em citotoxicidade para células HEK293A respectivamente (Fig. 1C). Estes dados sugeriram que havia efeitos sinérgicos da apigenina e paclitaxel para matar especificamente células cancerígenas

a, células HeLa foram tratados com concentrações aumentadas de apigenina (0-100 uM) durante 24 horas. vitalidade celular foi medida. A experiência foi repetida três vezes, independentemente, por e os dados foram apresentados como média ± DP. B, células HeLa foram tratados com o aumento das concentrações de paclitaxel (0-50 nM), durante 24 horas. vitalidade celular foi detectado e analisado como descrito em A. C, HeLa, A549, Hep3B e células HEK293A foram submetidos a tratamento com a apigenina (15 uM) combinação com paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. vitalidade celular foi detectada como descrito em A. D, células HeLa foram tratados com paclitaxel ou apigenina, respectivamente, além disso, em outros grupos, apigenina foi adicionado a células HeLa 2 horas antes ou após o tratamento com paclitaxel, o paclitaxel ou apigenina e foram adicionados a células HeLa ao mesmo tempo. TUNEL coloração foi realizada e detectadas com um kit de Guava® TUNEL. Números representada a percentagem de células positivas TUNEL. E, As células foram deixadas sem tratamento ou tratada tal como anteriormente descrito em D. No tempo indicado, as células foram coradas com corante de anexina V /PI. As análises foram realizadas em 5000 células em cada pista. F, células HeLa foram tratadas com concentrações aumentadas de apigenina ou paclitaxel, respectivamente, ou de ambos, durante 24 horas. Em seguida, os lisados ​​de células foram submetidas a transferência de Western para determinar o nível de proteína de caspase-3 e PARP. V representa veículo (sulfóxido de dimetilo). * P 0,05 comparado com o grupo não tratado; ** P . 0,01 comparado com o grupo não tratado

tem sido relatado que tanto o paclitaxel [31], [32] e apigenina [21] pode induzir a apoptose celular. A seguir, verificar se o uso de combinação de apigenina e paclitaxel podia induzir a apoptose mais aguda em células HeLa. Em comparação com os grupos tratados com apigenina ou paclitaxel individualmente, grupos co-tratados apigenina e paclitaxel mostrou mais células de coloração TUNEL positivas. As taxas de células de coloração positiva de TUNEL foram notavelmente aumentada de 17,95% no grupo tratado paclitacel e 19,65% de apigenina grupo tratado com cerca de 40% nos grupos tratados pela combinação dos mesmos (Fig. 1D). Para quantificar a apoptose, a análise de FACS foi realizada após a coloração das células com FITC-anexina-V mais iodeto de propídio (PI). Os dados mostrados na Fig. 1E indicou que o número de células sobreviventes diminuíram gradualmente após co-tratamento com paclitaxel e apigenina e apenas menos de 60% foram sobreviveram 24 horas após a apigenina e paclitaxel tratamento.

Uma vez que a activação de caspases é uma razão importante para a apoptose , detectamos ainda mais as clivagens de caspase-3 e PARP utilizando análise de western blot. Como mostrado na Fig. 1F, tanto as clivagens de caspase-3 e PARP foram significativamente melhoradas por apigenina /co-tratamento com paclitaxel em comparação com apigenina ou tratamento com paclitaxel sozinho. Estes resultados confirmaram que o co-tratamento apigenina /paclitaxel induziu uma significativa morte apoptótica de células HeLa, sugerindo que a utilização combinada de paclitaxel apigenina e produziria um efeito anti-tumoral melhor do que o uso de apigenina ou paclitaxel sozinho.

ROS produzido por apigenina é essencial para a apigenina /induzida por paclitaxel HeLa apoptose celular

enquanto isso flavonóides incluindo apigenina foram amplamente reconhecidos como os antioxidantes, as suas propriedades pró-oxidantes também foram relatados [33]. Especulamos os efeitos anticancerígenos da combinação apigenina /paclitaxel pode estar relacionado com a produção de ROS em células HeLa induzidas pela apigenina. Portanto, observou-se os níveis em células HeLa tratadas com com apigenina, paclitaxel ou ambos. Dois corantes específicos de ROS, DHE e CM-H

2DCFDA exibido espécies superóxido e H

2O

2 em células alvo, respectivamente [24]. CM-H

2DCFDA é oxidada principalmente pelo peróxido de hidrogênio (H

2O

2) e radical hidroxila, DHE é oxidado pelo superóxido (O

2

-). As células HeLa foram coradas com DHE e CM-H

2DCFDA seguido por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 2, DHE-específica ROS aumentada (Fig. 2A), enquanto que CM-H

ROS-2DCFDA específica reduzida (Fig. 2B) em células HeLa tratadas com apigenina dentro dos 30 minutos. Nenhuma alteração foi detectada nas células tratadas com paclitaxel sozinho. Uma tendência semelhante, e uma alteração mais significativa no estado ROS ‘foram observadas nas células tratadas com a combinação de apigenina e paclitaxel em comparação com células tratadas com apigenina sozinho (Fig. 2). DHE coloração observado nestas experiências resultou da oxidação por espécies superóxido sugerindo que espécie apigenina aumento superóxido relacionada ROS nas células HeLa.

a, células HeLa foram tratados com apigenina (15 uM), isoladamente ou em combinação com paclitaxel (4 nM), para os períodos indicados. DHE (5 uM) foi adicionado a culturas de células 30 minutos antes do tratamento. coloração de DHE nas células foram detectados e analisados ​​pelo sistema de goiaba EasyCyte ™. coloração DHE em células não tratadas foram usadas como controlo negativo. B, CM-H

2DCFDA (5 uM) a coloração foi realizada e analisada tal como descrito em A.

Em seguida avaliou-se a apoptose induzida por paclitaxel apigenina /era dependente da acumulação de ROS. N-acetil-L-cisteina (NAC), um eliminador de ROS bem aprovado, tem sido usado para antagonizar os efeitos de ROS. O pré-tratamento das células HeLa com 100 pM de NAC eficazmente suprimida a geração de espécies de superóxido (Fig. 3A) e inibiu significativamente a apoptose celular induzida por apigenina e co-tratamento com paclitaxel (Fig. 3B). Os dados apresentados acima sugerem que ROS eram essenciais para a apoptose das células apigenina /induzida por paclitaxel HeLa.

As células foram então recolhidas e detectado pelo sistema de goiaba EasyCyte ™ como descrito na Fig. 2A. B, células HeLa foram tratados com NAC (100 uM) durante 2 horas e, em seguida, incubadas com apigenina (15 uM) e paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. apoptose celular foi medida pelo ensaio de TUNEL como descrito na Fig. 1.

Apigenin induz a acumulação de ROS através da supressão da atividade da SOD

Foi observado que após as células HeLa foram tratados com apigenina, a abundância de espécies superóxido aumentaram, enquanto H

2O

2 diminuiu. Considerando SOD era uma enzima celular que pode converter superóxido a H

2O

2, nós especulamos que a apigenina pode reduzir a atividade de SOD e consequentemente levou à acumulação de espécies superóxido. Em seguida, investigou o efeito de apigenina do nível de proteína, bem como a actividade enzimática de SOD. Uma supressão significativa de ambos CuZnSOD (SOD1) e actividade de MnSOD (SOD2) foi observada em células HeLa no prazo de 30 minutos após a apigenina ou apigenina /paclitaxel, mas não o tratamento com paclitaxel (Fig. 4A). No entanto, não houve nenhuma alteração aparente observada no nível da proteína de CuZnSOD e MnSOD após a administração apigenina (Fig. 4B). Por conseguinte, era prova de que a apigenina suprimiu a actividade SOD e assim induzida a acumulação de ROS.

a, células HeLa foram tratados com apigenina (15 uM), paclitaxel (4 nM), ou de ambos, durante 30 minutos, . atividade da SOD foi medida com kit de detecção de SOD Cayman. A experiência foi repetida três vezes, independentemente, por e os dados foram mostrados com a média ± D.P.. * P 0,05 comparado com grupo de controlo; ** P 0,01 comparado com o grupo de controlo. B, células HeLa foram tratados com apigenina (15 uM) e paclitaxel (4 nM) durante 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a proteína Ocidental-blot para determinar os níveis de SOD1 e SOD2. C, células HeLa foram tratados com apigenina (15 uM) durante 30 minutos e submetidas a lise por sonicação. Os lisados ​​celulares foram então incubadas com CuCl

2 (8 uM), ZnCl

2 (8 uM) e MnCl

2 (8 uM) durante 30 minutos em gelo. A actividade da SOD foram medidos e analisados ​​como descrito em A. D, células HeLa foram lisadas por sonicação e os lisados ​​celulares foram então incubadas com iões metálicos acima mencionados, durante 30 minutos em gelo. actividade SOD foi medida tal como acima referido. * P 0,05 comparado com grupo tratado com apigenina; ** P . 0,01 em comparação com o grupo tratado com apigenina

Como resultados acima mostraram que a apigenina suprimida atividade da SOD, e que tinha sido relatado que a apigenina pode formar complexação estável com iões metálicos

in vitro

[34.], que assim determinado se apigenina pode formar complexação com iões metálicos e suprimir a atividade SOD através prevenir SOD de montar com seus cofatores. As células HeLa foram tratadas com 15? M apigenina durante 30 minutos e os lisados ​​de células foram incubadas com 8 uM de ZnCl

2 (aq), CuCl

2 (aq) ou MnCl

2 (aq), respectivamente, sobre gelo durante mais 30 minutos. A actividade de SOD foi medida usando o Cayman superóxido dismutase Assay Kit, como descrito em Material e Métodos. Como esperado, apigenina suprimiu significativamente as actividades de ambos CuZnSOD e MnSOD, mas a actividade aumentada após CuZnSOD Cu

2+, Zn

2+, e Mn

2+ exposição e a actividade de MnSOD, obviamente, também aumentou depois de Mn

2 + exposição (Fig. 4C). Além disso, não houve alteração significativa da actividade de SOD foi encontrado quando os lisados ​​de células foram directamente expostos a Cu

2+, Zn

2+ ou Mn

2+ sem tratamento apigenina (Fig. 4D), indicando que estes metais íons não melhorou basais resultados SOD activity.These sugeriu que a apigenina suprimida atividade da SOD, provavelmente, através da formação de uma complexação estável com esses metais nas células [34], e apigenina pode ter maior afinidade de ligação para Mn

2 +.

redução da atividade SOD é crítica em apigenina /induzida por paclitaxel apoptose

a apigenina inibe a atividade da SOD e combinação de apigenina /paclitaxel foi mais eficaz na indução de apoptose de células cancerosas do que cada um deles sozinho. A fim de confirmar que a redução induzida por apigenina de actividade de SOD foi crítico na apoptose desencadeada por co-tratamento apigenina /paclitaxel, observou-se a apoptose induzida por paclitaxel depois de bloquear a actividade da enzima SOD. DETC (dietiltiocarbamato), um inibidor bem aprovado tanto CuZnSOD e MnSOD foi aplicada em nosso estudo atual [35]. Como semelhante como apigenina, DETC suprimiu a actividade de SOD e a apoptose induzida por paclitaxel melhorada, bem como (Fig. 5A). Estes dados sugerem fortemente que a redução da actividade SOD por apigenina é crítico no melhoramento da apoptose induzida por paclitaxel.

a, células HeLa foram incubadas com apigenina (15 uM) /paclitaxel (4 nM), ou o paclitaxel ( 4 nM) em conjunto com ou sem DETC 1 mM (um inibidor da enzima SOD) durante 24 horas e depois as células foram submetidas a ensaio de TUNEL, como descrito anteriormente. B, células HeLa foram pré-tratados com NAC (100 uM) durante 2 horas, seguido por tratamento com apigenina (15 uM) e paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. A clivagem de caspase-2 foi detectada por análise de Western-blot, com o controlo de β-actina. C, células HeLa foram pré-tratadas com z-VDVAD-fmk (25 pM), um inibidor específico da caspase-2, e, em seguida, foram tratados com apigenina (15 uM) e paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. Os níveis de proteína de PARP clivada e pro-caspase-3 foram detectados por análise de Western-blot. D, As células HeLa foram pré-tratadas com z-VDVAD-fmk (25 pM) durante 30 minutos e, em seguida, foram tratados com apigenina (15 uM) e paclitaxel (4 nM) durante 8 horas. As células foram então colhidas e o potencial de membrana mitocondrial foi detectada utilizando um Kit de goiaba EasyCyte ™ MitoPotential e analisadas por Goiaba Sistema EasyCyte ™. MMP foi mostraram que a contagem de células despolarizadas. A experiência foi repetida três vezes, independentemente, por e os dados foram apresentados como média ± DP. ** P 0,01 comparado com o grupo não tratado. E, células HeLa foram incubadas com apigenina (15 uM) e paclitaxel (4 nM) durante 24 horas, e, em seguida, as células foram submetidas a análise de RT-PCR. GAPDH mRNA foi usado como gene goleiro casa.

Ativação da caspase-2 é importante para a apigenina /desencadeou-paclitaxel HeLa apoptose celular

via mitocondrial desempenha um papel importante na ROS desencadeada apoptose [36], [37] e a caspase-2 tem sido considerada como a caspase apical no circuito de amplificação do sinal de morte mitocondrial [38], [39]. -ROS induzida caspase-2 e clivagem de feedback amplificação do sinal apoptótico também foram investigados [40]. Para examinar o efeito da apigenina na via mitocondrial de apoptose, caspase-2 precursor de clivagem foi detectada em tratados com apigenina células HeLa por análise de Western-blot. Co-tratamento de células HeLa com apigenina e paclitaxel mostrou muito baixo nível de caspase-2 precursor. Quando as células HeLa foram pré-tratados com NAC, o nível do precursor da caspase-2 recuperada (Fig. 5B). A caspase-2 Z-inibidor VDVAD-fmk reduziu significativamente a clivagem de caspase-3 e PARP em células HeLa tratadas com apigenina combinado com paclitaxel (Fig. 5C). MMP pode ser um acontecimento causal na precipitação de apoptose. Os dados na Fig. 5D indicou que a apigenina mas não paclitaxel induziu um aumento de despolarização da MMP sugerindo a importância da apigenina em apigenina paclitaxel apoptose induzida /célula cancerosa. Como esperado, Z-VDVAD-fmk inibiu o aumento de MMP em apigenina e /paclitaxel grupos tratados com apigenina (Fig. 5D). FIG. 5E mostraram que o tratamento de apigenina, paclitaxel ou apigenina /paclitaxel não alterou o nível de ARNm de caspase-2, indicando apigenina /paclitaxel co-tratamento só aumentou a activação de caspase-2.

Para confirmar a importância da caspase 2 em apigenina permeabilização da membrana mitocondrial /desencadeou-paclitaxel e apoptose, realizamos caspase-2 sobre-expressão e knock-down experiências e medidos FIA, Endo G e citocromo c liberação de mitocôndria em células HeLa. A sobre-expressão da caspase-2 apigenina significativamente melhorada ou aumento apigenina /induzida por paclitaxel da FIA, Endo G e citocromo c na fracção citoplasma e diminuição da FIA, Endo G e citocromo c na fracção mitocondrial (Fig. 6A). Como esperado, a caspase-2 knock-down resultou no oposto em apigenina ou apigenina /paclitaxel induziu alterações de FIA, Endo G e citocromo C em células HeLa (Fig. 6A). Além disso, como mostrado na Fig. 6B, a sobre-expressão da caspase-2 aparentemente aumentada de clivagem apigenina /induzida por paclitaxel, da caspase-3 e PARP e knock-down da caspase-2 inibido tal efeito de apigenina /paclitaxel. Nós próxima detectado vitalidade celular para avaliar efeito mediado da caspase-2 em apigenina /paclitaxel desencadeada apoptose de células HeLa. A sobre-expressão da caspase-2 causou cerca de 10% de redução da vitalidade celular, tanto em grupos apigenina e co-tratamento, e caspase-2 silêncio aumentou significativamente a vitalidade das células.