Abstract

Nós previamente descrito um suicídio novel (ou “controle de destino celular ‘) terapia genética sistema enzima /pró-fármaco baseado em uma variante modificada de timidilato quinase humana (TMPK) que potencia azidotimidina activação (AZT). A entrega de uma sequência de gene suicida em tumores através de transdução lentiviral incorpora uma terapia genética do cancro, que pode empregar a morte celular espectador como um mecanismo de accionamento de regressão significativa do tumor

In vivo

. Aqui nós apresentamos provas de uma célula espectador significativa matando

in vitro

e

in vivo

mediada pelo eixo gene suicida TMPK /AZT, que é dependente da formação de comunicações intercelulares GAP-juncional funcionais ( GJICs). Potenciação de activação AZT pelo TMPK engenharia expresso na linha celular de cancro da próstata humano, PC-3, resultou na morte espectador eficaz de células PC-3 sem expressão de TMPK – um efeito que poderia ser bloqueada pelo inibidor da CIJH, carbenoxolona. Embora GJICs são formados principalmente por conexinas, uma nova família de moléculas designadas pannexins CIJH foi recentemente identificado. As células PC-3 expressa tanto connexin43 (Cx43) e Pannexin1 (Panx1), mas a expressão Panx1 predominaram na membrana plasmática, enquanto que a expressão de Cx43 foi localizada principalmente para o citosol. A contribuição de efeito espectador para a redução de xenoenxertos de tumores sólidos estabelecidos pela linha de células PC-3 foi avaliado num modelo animal. Nós demonstramos a contribuição de morte celular espectador a regressão tumoral num modelo de xenoenxerto baseando-se na entrega de expressão do gene suicida TMPK em tumores através de injecção intratumoral directa de lentivírus terapêutica recombinante. Tomados em conjunto, os nossos dados ressaltam que o eixo enzima pró-fármaco TMPK /AZT podem ser eficazmente utilizados em terapia genética suicídio de tumores sólidos, em que a regressão do tumor significativa pode ser alcançada através de Efeito Espectador mediadas por GJICs

Citation:. Sato T, Neschadim A, Lavie A, Yanagisawa T, Medin JA (2013) A Engineered timidilato quinase (TMPK) /AZT Enzyme-Pr�f�maco Axis oferece celular Bystander eficiente Matar por suicídio Gene Therapy of Cancer. PLoS ONE 8 (10): e78711. doi: 10.1371 /journal.pone.0078711

editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria

Recebido: 03 de junho de 2013; Aceito: 16 de setembro de 2013; Publicação: 23 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado em parte por Grant-in ajuda para a Investigação Científica (C) (20590533) para TS da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) e pela bolsa de pesquisa da Fundação Saito Gratidão a T.S .. A. N. foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) Programa de Formação em Medicina Regenerativa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a terapia genética aproximações utilizando vetores oncoretroviral ou lentivírus recombinantes para entregar genes que potenciam várias terapias farmacológicas diretamente em tumores sólidos são promissores no tratamento de tumores sólidos que são difíceis de remover cirurgicamente, tais como cancros que afligem o cérebro [1]. terapia de gene suicida de cancro (SGTC), também denominado terapia enzima-prodroga dirigida por genes (GDEPT), tipicamente assenta na entrega intratumoral de genes suicidas que facilitam a activação selectiva e localizada de pró-fármacos específicos nos seus derivados efectoras citotóxicas. Transcriptional- e segmentação baseada pseudotipo de viriões às células cancerosas prolongar ainda mais as aplicações potenciais para incluir lesões metastáticas e expandir o método de entrega para a administração sistémica [2,3]. Os desafios significativos associados com a entrega do gene suicida em cada célula maligna são muitas vezes superadas por depender de morte celular espectador, ou Efeito Espectador, que criam uma zona de matança localizada em torno das células tumorais transduzidas com sucesso que funcionalmente expressam o gene suicida, aumentando assim a eficácia global SGTC [4].

Vários genes suicidas foram caracterizadas e avaliadas até agora no que diz respeito à sua utilidade para SGTC. Entre eles, o vírus herpes simplex-derivado da timidina cinase (HSV-TK) é um dos genes suicidas mais extensivamente estudados para SGTC [5]. HSV-TK e vários cataliticamente melhorados mutantes desta enzima tem sido amplamente utilizado como um gene suicida, em combinação com o análogo de guanosina, o ganciclovir (GCV), para o tratamento de vários cancros [1,6]. HSV-TK converte o GCV não tóxico para GCV-monofosfato (GCV-MP), que está ainda fosforilados por quinases celulares para produzir o metabolito tóxico, GCV trifosfato (GCV-TP), que inibe a replicação do ADN das células do hospedeiro, resultando na indução de apoptose [7]. Bystander efeitos têm sido bem caracterizados na suicídio sistema de terapia de gene de HSV-TK /GCV, e pensa-se que envolve a difusão de GCV activado, quer mono- ou multiplamente formas fosforilada, a partir de HSV-TK-expressando células para as células vizinhas através comunicações intercelulares GAP-juncional (GJICs) que ligam as citosois de células adjacentes em muitos tumores sólidos e permitem a troca de pequenos metabólitos peso molecular por difusão [8]. Um número de factores limitam a eficácia global do HSV-TK para uso em SGTC incluindo: fraca activação de GCV por HSV-tk na sua forma citotóxica, principalmente associada com o passo limitante da velocidade na activação GCV sendo fosforilação de GCV-MP em GCV -DP pela guanilato-quinase celular (GMPK) [9]; citotoxicidade limitado de GCV, em particular contra tumores de crescimento lento, dado o seu mecanismo de acção limitada, que se baseia unicamente na replicação de ADN [10]; e, finalmente, a lipofilicidade de GCV pobre resultando em efeitos bystander reduzido e uma baixa capacidade de atravessar a barreira sangue-cérebro limitando assim a aplicabilidade em SGTC alvo do cérebro [11]. Tomados em conjunto, SGTC aproximações utilizando o eixo de HSV-tk /GCV são, portanto, limitada pela citotoxicidade limitada e problemas com a dosagem eficaz com GCV, o que pode ter que ser utilizado em concentrações que são sistemicamente mielossupressora para alcançar a ablação do tumor significativa.

Temos anteriormente descritas alternativas enzima pró-fármaco para o suicídio (ou ‘controlo de células destino “) a terapia genética [12,13], um dos quais utiliza uma variante cataliticamente-melhorada do timidilato quinase humana (TMPK-F105Y) que foi ativado para potenciar a rápida activação do pró-fármaco azidotimidina (AZT) [12]. Cataliticamente, de tipo selvagem TMPK é relativamente lento na fosforilação do AZT-monofosfato, que é o passo de gargalo na sua via de activação em células de mamífero. A mutação F105Y, adoptada com base na comparação de uma região homóloga da sequência de levedura TMPK, resulta numa enzima variante que é muito mais robusto em fosforilar o AZT monofosfato e menos activo no seu substrato natural, a timidilato-monofosfato [14]. Este eixo terapia de gene suicida novo utiliza um enzima de origem humana com um potencial mínimo para provocar respostas imunes adversas dirigidos contra o transgene, como é observado com abordagens baseadas em HSV-TK. É também utiliza uma enzima que é cataliticamente robusta e actua na etapa limitante da taxa de activação do AZT. Além disso, utiliza um pró-fármaco cuja forma citotóxica pode eficientemente como alvo tanto células que não se dividem, devido a dois mecanismos distintos de citotoxicidade [12] e divisória. Finalmente, ele utiliza uma pró-droga que tem melhor perfil de lipofilicidade e é provavelmente mais adequada para utilização em SGTC. Especificamente, o AZT é estimada em pelo menos 30-vezes mais lipofilico do que GCV [11], no qual se prevê melhor difusão passiva e aumento da aptidão do pró-fármaco AZT para a terapia de gene suicida de tumores sólidos, bem como uma melhor distribuição da pró-droga para o cérebro, por exemplo. Devido a estas características superiores do suicídio eixo terapia genética TMPK /AZT, nos propusemos a avaliar a adequação deste sistema e à magnitude dos efeitos espectador seria engendram em SGTC.

Neste estudo, relatamos que a expressão sustentada do cataliticamente reforçada, variante AZT-activo TMPK, TMPK-F105Y, na linha celular de cancro do carcinoma da próstata humano, PC-3, por transdução com construções lentivirais prontamente sensibiliza as células para o tratamento com AZT e facilita a morte celular via melhorada efeito espectador ambos

in vitro

e

in vivo

. Nós demonstramos que o efeito de morte circunstante, observada após tratamento com AZT, é em grande parte dependente da existência de GJICs funcionais e é abolida por tratamento com um inibidor de junções de hiato. Além disso, mostramos a Pannexin1, e não Connexin43, provavelmente forma as junções de hiato funcionais entre células PC-3. Esses resultados destacam a utilidade de SGTC mediada por lentivírus com base no sistema modificado com TMPK /AZT e garante a sua avaliação posterior

in vivo

em modelos específicos de câncer.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

procedimentos experimentais em animais, seguido de um protocolo aprovado pelo Comité de Cuidados com animais da University Health Network (Toronto, ON, Canadá). Os animais foram mantidos no Centro de Recursos Animais no Princess Margaret Hospital (Toronto, ON, Canadá).

cultura celular

linha celular

prostático humano adenocarcinoma PC-3 foi obtido a partir de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA) e mantidas em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) -1640 médio (Wako Puré Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japão) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching , Áustria), 100 unidades /mL de penicilina (Nakalai Tesque, Inc., Kyoto, Japão), 100 ug /mL de estreptomicina (Nakalai Tesque, Inc.) e 250 ng /mL de anfotericina B (Nakalai Tesque, Inc. ) em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO

2 ambiente a uma humidade constante. A linha de células humanas embrionárias derivadas de rim 293T foi obtida de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA) e mantidas em Dulbecco Modified Eagle Medium (D-MEM; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), suplementado com 10% de FBS , 100 unidades /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Produção de recombinante LV /TMPK e transdução de células PC-3

O procedimento para a produção de estomatite vesicular virus-glicoproteína (VSV-G) -pseudotyped lentivírus recombinante, relatado anteriormente pelo nosso grupo [12], foi utilizado com modificações menores. Resumidamente, a transfecção de três plasmídeos (plasmídeo pHR ‘de transferência de genes, o plasmídeo de empacotamento pCMVR8.91, e o vírus da estomatite vesicular glicoproteína de envelope-plasmídeo que codifica pMD.G) em células 293T foi conduzida utilizando uma polietilenoimina (PEI) -procedure [15 ] e os sobrenadantes virais foram recolhidos a 48 horas pós-transfecção, filtrada utilizando um filtro de 0,45 um, e concentrou-se a 50000 × g durante 2 horas. PC-3 de células foram infectadas com as reservas de vírus concentrado na presença de 8 ug /ml de sulfato de protamina. As células infectadas foram então de uma única célula clonada por diluição limitante. expressão do transgene nas células transduzidas PC-3 foi confirmada por análise de Western blot utilizando coelho TMPK anti-humano (gentilmente fornecida pelo Dr. Konrad Manfred, Max Plank Institute para Biophysical Chemistry, Gottingen, Alemanha). Para esta análise, os lisados ​​celulares totais foram resolvidos por electroforese em dodecilsulfato de sódio em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) e transferidas para uma membrana de filtro de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA). A membrana foi bloqueada com 0,5% de leite desnatado sem gordura em 20 mM de Tris-salino tamponado com 0,05% de Tween-20, pH 7,4 (TBS-T, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A membrana foi sondada com o TMPK anti-humano de coelho (diluído a 1: 5000), e em seguida com o anticorpo secundário adequado de rábano silvestre conjugado com peroxidase (diluído 1: 5000, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). Carga igual de proteína foi confirmada com um anticorpo de murino anti-GAPDH (diluído 1: 5000, Ambion Austin, TX, EUA.). As membranas, após desenvolvimento com o substrato HRP Immobilon Ocidental quimioluminescente (Millipore, Billerica, MA, EUA), foram fotografadas usando o sistema de LAS-1000 (Fuji Film Corp., Tóquio, Japão) par-carregada de câmara dispositivo. A expressão da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) nos clones de uma única célula transduzidas foi confirmada por detecção de citometria de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA).

ensaio de transferência de corante utilizando citometria de fluxo e microscopia confocal observação

Para a marcação de calceina, as células cultivadas à semi-confluência foram lavadas duas vezes com PBS (sem cálcio e magnésio), e, em seguida, coradas durante 15 min com 20? M de calceina metil-acetoxi (calceína-AM; Doujin Chemical Co., Kumamoto, Japão) dissolvido em PBS (sem cálcio e magnésio). Após coloração com calceina, as células foram lavadas com meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS. Para PKH26-marcação, as células foram lavadas em PBS e ressuspensas em Diluente C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a uma densidade de 10

7 células /ml e coradas com 20? M PKH26 (Sigma-Aldrich ) dissolvido em Diluente C durante 5 min. As células foram então lavadas 3 vezes com RPMI-1640 contendo 10% de FBS. Tanto a calceina-rotulado e as células PKH26-marcadas foram misturadas e co-cultivadas em placas de 6 poços (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA), durante 3 dias. de transferência de corante foi analisada por citometria de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences) por medição da fluorescência da calceina detectado em 514nm e 567nm PKH26 detectado no. Em um ensaio separado, 100 uM carbenoxolona (CBX, Sigma-Aldrich) foi adicionada às culturas de células para examinar a sua capacidade para bloquear a transferência de corantes. Além disso, para detectar as moléculas que participam na formação de junções de hiato, a imunocoloração de células PC-3 foi realizada. Resumidamente, as células PC-3, aderidas Lab-TekII corrediça câmara (Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL, EUA), foram fixadas com 4% (w /v) de formalina tamponada (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, e permeabilizadas com 0,1% (v /v) de Triton X-100 durante 15 min. As células foram então bloqueadas com soro de cabra normal a 5%, e fez-se reagir sequencialmente com solução de anticorpo primário (diluição 1: 100 em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA)) a 4 ° C durante a noite, seguido por incubação em PBS contendo o derivado anticorpo (diluição 1: 500 em PBS contendo 1% de BSA) marcado com Alexa488 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, EUA) e contrastadas com rodamina-faloidina (Cytskelton, Inc., Denver, CO, EUA) durante 3 horas na sala temperatura. Os anticorpos utilizados neste estudo foram como se segue: anticorpo de coelho anti-connexin43 (Signalway Anticorpo, College Park, MA, EUA), anticorpo de coelho anti-pannexin1 (Merck Millipore Corp., Billerica, MA, EUA), e Alexa488 de cabra anti-marcado -rabbit anticorpo IgG (Molecular Probes, Inc.). sinais de fluorescência foram analisados ​​utilizando um microscópio confocal de varredura a laser LSM-5 e LSM Sistema versão 3.98 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), ao Biomedical Research Núcleo da Escola de Pós-Graduação da Universidade Tohoku of Medicine.

ensaios de proliferação celular

As células foram semeadas em placas de 96 poços (Corning Incorporated) a 5 × 10

5 células /poço em 200 ul de meio RPMI-1640, suplementado tal como acima descrito, e incubadas com concentrações crescentes de AZT (0, 0,1, 1, 10, 100? M, e 1 mM; Sigma-Aldrich). O meio foi funciona diariamente. Após 4 dias de cultura, a viabilidade celular foi determinada utilizando o Cell Counting Kit-8 (Doujin Chemical Co.). Para determinação da relação óptima para experiências de células espectadoras subsequentes, ambas as células que expressam eGFP e células TMPK-F105Y-transduzidas foram semeadas em placas de 96 poços em diferentes proporções, e cultivados na presença de 10 uM de AZT durante 5 dias. A viabilidade celular foi determinada como acima usando a contagem celular Kit-8 (Doujin Chemical Co.).

Avaliação da apoptose

As células foram semeadas em placas de 6 poços (Corning Incorporated) a 10

6 células /poço em 5 ml de meio de cultura celular (meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, antibióticos, antimicóticos e, tal como descrito acima), com ou sem 10 uM AZT. Após 4 dias de cultura, de coloração de anexina V foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Anexina V-APC; BD Pharmingen, San Diego, CA). Para confirmar a exigência de GJICs espectador para matar induzida pelo AZT, 100 uM carbenoxolona (CBX, Sigma-Aldrich) foi adicionada em simultâneo com o AZT para a cultura. índices apoptóticos rácios relativos foram calculados como normalizadas de apoptose em AZT-tratado com células-AZT não tratados. Para examinar a contribuição de factores solúveis segregadas a partir de células tratadas com AZT, do tipo selvagem, células PC-3 foram cultivadas durante 5 dias no meio condicionado recolhido a partir de tipo selvagem TMPK ou TMPK-F105Y expressando células que foram tratadas com 10? M AZT durante 5 dias, seguida por avaliação da indução da apoptose nestas células como acima.

espécies reactivas de oxigénio (ROS) ensaio

geração de espécies reactivas de oxigénio intracelulares (ROS) foi monitorizada por o dihydroethidium ( DHE) procedimento [16]. Resumidamente, os pontos de tempo após tratamento indicados, as células foram ainda incubadas com DHE (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) durante 30 min a 37 ° C no escuro. intensidade de emissão de fluorescência a 525 nm (excitação a seguir a 488 nm) foi medida por um citómetro de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences). A alteração na intensidade de fluorescência média (IFM) de amostras medidas a partir de cada grupo de tratamento foi expressa como uma percentagem de DHE fluorescência das células de controlo não tratadas.

Avaliação do efeito espectador in vivo após uma injecção intratumoral de LV /TMPK

não-obesos diabéticos imunodeficiência combinada /grave (NOD /SCID) (5-8 semanas de idade, comprado de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) foram mantidos no Centro de Recursos animais no Princess Margaret Hospital (Toronto , ON, Canadá). Os animais foram injectados no dia 0 na sua dorsal direita flanco com 4×10

6 VE /eGFP transduzidas células PC-3, em suspensão em 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Cerca de 10 pi de A /F105Y TMPK-LV (1,5×10

8 UI /ml) foi injectada preparação intratumoral no dia 11. Os animais nos grupos tratados com o fármaco receberam uma dose de 50 mg /kg /dia por via intraperitoneal de AZT durante 6 dias, começando no dia 12. Os grupos experimentais foram como se segue: PC-3-TMPK-F105Y tratados com AZT e PC-3-TMPK-F105Y tratados com veículo (PBS). Os animais foram sacrificados no dia 18; Os tumores foram então colhidos e pesados ​​

Estatísticas

A significância estatística entre os grupos foi avaliada por ANOVA one-way análise com o teste de Bonferroni post-hoc usando GraphPad InStat (ver 3.0a para Macintosh..; GraphPad Software, San Diego CA).

resultados

células PC-3 expressam GJICs funcionais constituídas por pannexin1

junções de hiato de comunicação intracelulares (GJICs), além de jogar um papel directo na progressão tumoral [17], são considerados como sendo importante para o efeito de morte celular espectador em aplicações SGTC [18]. GJICs são tipicamente constituídos por proteínas da família de conexinas, e, como foi recentemente mostrado, a partir de proteínas da família pannexin assim [19]. GJICs permitir a difusão passiva de moléculas pequenas (≤1 kDa em tamanho) entre as células adjacentes, ligadas. As expressão das proteínas principais, a CIJH connexin43 e pannexin1, foram confirmados em células PC-3 por análise de Western blot (Figura 1A); expressões de tipo selvagem TMPK e TMPK-F105Y também foram confirmadas de forma análoga (Figura 1B). Os padrões de distribuição dos connexin43 e pannexin1, tal como determinado por análise de microscopia de imunofluorescência confocal, revelaram no entanto que connexin43 células PC-3 predominantemente expressa em compartimentos perinuclear citoplasmático (Figura 1C, painel esquerdo), enquanto que pannexin1 foi localizada principalmente para a membrana plasmática, observado como manchas e estrias que são a marca do padrão aparência GJIC (Figura 1C, painel da direita). Esta descoberta sugere que pode predominar sobre pannexin1 connexin43 na formação de GJICs funcionais nesta linha de células de cancro da próstata.

(A) Expressão de CIJH componentes, connexin43 e pannexin1, foi confirmada por Western blot em lisados ​​de células inteiras de não transduzidas, LV /TMPK transduzidas, e LV /eGFP transduzidas células PC-3. expressão de GAPDH foi avaliado como um controlo de carga igual. (B) A expressão de TMPK foi confirmada por Western blot em lisados ​​de células inteiras de não transduzidas, LV /TMPK transduzidas e LV /TMPK-F105Y transduzidas células PC-3. expressão de GAPDH foi avaliado como um controlo de carga igual. (C) Padrão de expressão de connexin43 (painel da esquerda) e pannexin1 (painel da direita) componentes CIJH (fluorescência verde) foi avaliada por microscopia de imunofluorescência confocal. Citoesqueleto (F-actina) foi visualizado com rodamina-faloidina (fluorescência vermelha) coloração. (D) de transferência de corante de calceína em células marcadas com PKH26 adjacentes foi medida por citometria de fluxo em directos (normais) ou Transwell co-culturas de células PC-3 como percentagem de células duas vezes positivos para calceína e PKH26 fluorescência (n = 3) . (E) de transferência de corante de células marcadas para calceína-PKH26 adjacentes foi significativamente inibida pela carbenoxolona (CBX) (n = 3). A significância estatística é indicado (p 0,0001).

próxima examinada a formação de GJICs funcionais em células PC-3 num ensaio de transferência de corante. Duas populações de células, separadamente e de forma estável marcadas com um de dois corantes diferentes (calceina, que é não-permeável da membrana e é preso no citosol da célula, e PKH26, que rotula especificamente membranas celulares) exibiram transferência de corantes em 2-dia co- culturas, como demonstrado pelo aparecimento de células duplamente marcadas (Figura 1D). Este calceína transferência de corante para as células PKH26-rotulados necessários contacto directo célula a célula, como a transferência de corante não era evidente em células marcados diferencialmente que foram cultivadas em um sistema Transwell (Figura 1D). Além disso, a transferência de corante foi significativamente inibida na presença de um inibidor específico das junções de hiato, a carbenoxolona (CBX) (Figura 1E). Tomados em conjunto, os dados sugerem que calceína transferência de corante em células PKH26-rotulados necessários contato direto célula-célula, e foi provavelmente facilitada pela GJICs funcionais.

Avaliação de morte celular AZT mediada por LV /TMPK transduzidas células PC-3 e espectador efeitos

PC-3 células foram transduzidas com vetores de lentivírus expressão de engenharia de qualquer tipo selvagem ou TMPK TMPK-F105Y. expressão TMPK e TMPK-F105Y foi confirmada por análise de Western blot utilizando um anticorpo de coelho anti-TMPK humano em clones de células individuais isolados por diluição limitante (Figura 1B). Enquanto expressão TMPK endógena foi detectável nas células não transduzidas (NT), observou-se uma sobre-expressão significativa de TMPK nas células transduzidas. AZT sensibilidade dependente da dose de clones de células PC-3 que expressam o tipo selvagem TMPK, que são incapazes de activar o AZT significativamente, ou o AZT-activo mutante TMPK-F105Y, foi avaliada numa cultura de células. As células de PC que expressam o mutante de TMPK-F105Y eram altamente sensíveis ao tratamento com concentrações crescentes de AZT (IC50 de 1,8 uM) em comparação com células não transduzidas ou células que sobre-expressam o tipo selvagem TMPK (IC50 de 1 mM e 0,1 mM , respectivamente) (Figura 2A). Com base na relação dose-respostas determinadas, numa dose de 10 uM de AZT foi seleccionado para experiências subsequentes como uma dose que foi muito eficaz no TMPK-expressando-F105Y células mas não exibiu qualquer toxicidade detectável em células ou células não transduzidas que sobre-expressam o tipo selvagem TMPK.

(A) de dose-dependente de morte celular de células PC-3 LV-transduzidas incubadas com concentrações crescentes de AZT (média +/- SEM, n = 3). (B) A indução de apoptose por 10 uM AZT foi avaliada por coloração de anexina V de células TMPK-F105Y tratados. de morte celular (C) Bystander foi avaliada por avaliação relativa de V de coloração de anexina em AZT-tratada para espectador não tratada eGFP-expressando PC-3 de células por citometria de fluxo em directo (normal) e Transwell co-culturas de eGFP transduzidas com TMPK-WT – ou células PC-3 TMPK-F105-transduzidas (n = 3). A significância estatística é indicado (p 0,0001). (D) Determinação da razão óptima das células que expressam eGFP-a células para avaliar matando bystander efeitos por 10 uM de AZT (média +/- SEM, n = 4 TMPKF105Y-expressando; * p 0,05, ** P 0,01 ). (E) A indução de apoptose no tipo selvagem de PC-3 de células por meios condicionados de-tratados com AZT de tipo selvagem TMPK transduzidas e TMPK-F105Y transduzidas células PC-3 normalizada para a apoptose em células tratadas com meio condicionado de AZT-tratada células (n = 3).

Para confirmar ainda mais a indução específica da apoptose em TMPK expressando-F105Y células após incubação com 10 mM AZT, avaliamos a exposição de um marcador de apoptose, a fosfatidilserina (PS ), na superfície das células de células tratadas com a proteína por coloração de anexina V-APC conjugada. células TMPK transduzidas-F105Y cultivadas na presença de 10 uM de AZT, mas não outros grupos de células de controlo, exibiram uma indução significativa da apoptose, como demonstrado por um aumento de mais de 3 vezes na taxa de apoptose destas células (Figura 2B).

para avaliar a morte celular espectador mediada pela ativação TMPK-F105Y derivado do AZT em células PC-3, TMPK transduzidas e células de controlo não transduzidas foram directamente co-cultivados com células independentes PC-3 projetados para expressam de forma estável a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP). Co-culturas tratadas com AZT foram avaliadas por anexina V (e 7-AAD) coloração para indução de apoptose na população de células positiva eGFP-PC-3. Tal como mostrado na Figura 2C (barras brancas), as células espectadoras única eGFP-positivos co-cultivadas com células que expressam o AZT-activo TMPK-F105Y e não o de tipo selvagem TMPK demonstrado um aumento significativo no índice apoptótico mediante tratamento com AZT. TMPK-expressando células efectoras e células que expressam eGFP-bystander necessários contacto directo célula a célula, uma vez que nenhum aumento do índice apoptótico das células espectadoras foi observada quando as populações de células separadas, onde por um sistema Transwell (Figura 2C, barras sombreadas). O espectador matando efeito em co-culturas com uma proporção de 1: 4 de células eGFP-expressam (20%) de TMPK-expressando-F105Y células (80%) foi altamente significativa levando a uma redução global de 80% na sobrevivência de células na co culturas a seguir 5 dias de tratamento com AZT (Figura 2D), o que sugere que um espectador matando potente efeito pôde ser observado. Para confirmar adicionalmente que o efeito de proximidade observado não era mediada por factores solúveis segregadas a partir de TMPK-F105Y células que expressam, o AZT-tratadas, foi realizada cultura não transduzidas células nos meios condicionados colhidos a partir de tipo selvagem TMPK ou PC-3 TMPK-F105Y -expressing células tratadas com AZT 10 uM durante 5 dias. Sob estas condições de cultura, não transduzidas células PC-3 não exibiram morte celular significativa (Figura 2E). Tomados em conjunto, estes dados indicam que o efeito de morte circunstante observado é mediada pela transferência de metabolitos citotóxicos do AZT através de um mecanismo que requer o contacto directo célula a célula.

O papel de GJICs na mediação do efeito espectador em células PC-3

Para explorar melhor os mecanismos do efeito espectador observado nas células PC-3 facilitado pelo sistema suicídio TMPK-F105Y /AZT, avaliamos a célula espectador matar observada na população eGFP-positiva directamente co-cultivados com TMPK-expressando F105Y células tratadas com AZT 10 uM na ausência e na presença de 100 uM de um inibidor específico das junções de hiato, a carbenoxolona (CBX). A adição de CBX para a co-cultura de morte aboliu completamente a célula espectador (índice apoptótico de uma) (Figura 3A), o que indica que o efeito espectador no nosso PC-3 co-culturas é mediada principalmente por GJICs funcionais.

(A) morte celular espectador foi avaliada por avaliação relativa da anexina V coloração no espectador-tratados AZT eGFP-expressando células PC-3, co-cultivados com células PC-3 TMPK-F105Y-tranduced, por fluxo citometria. Co-culturas foram quer deixados sem tratamento, ou tratados com o inibidor da pan CIJH, a carbenoxolona (CBX) (n = 3). (B) Fold-mudança na produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS), devido ao tratamento com AZT foi avaliada no tipo selvagem TMPK e expressando-TMPK-F105Y células que expressam PC-3 (n = 3). (C) Fold mudança na produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS), devido ao tratamento com AZT foi avaliada em eGFP-expressando células PC-3, co-cultivados com células TMPK-F105Y-tranduced PC-3, com e sem carbenoxolona (CBX ) tratamento (n = 3). A significância estatística é indicada (p 0,0001).

Nós determinamos que a ativação do AZT em TMPK-F105Y expressando células aumenta de espécies reactivas de oxigénio (ROS) de produção (Figura 3B). Uma vez que é bem conhecido que a produção de ROS frequentemente induz danos celulares levando à morte das células, especulamos que a produção de ROS poderia contribuir para a morte celular observada espectador neste sistema. De facto, mostrámos que o tratamento CBX dos nossos co-culturas que perturbariam GJICs funcionais resultou na redução de ROS produzidas seguindo tratamento com AZT na população de células espectador (Figura 3C), o que sugere que a transferência de metabolitos AZT activados para espectador células induz a produção de ROS e, potencialmente, contribui para a indução da apoptose celular nestas células.

efeitos bystander Avaliação do AZT-mediadas em modelos de xenoenxerto de cancro da próstata humana in vivo

para avaliar a eficácia do espectador efeitos induzidos no TMPK-F105Y sistema /suicídio AZT

in vivo

e da adequação dessa abordagem para SGTC, utilizamos um modelo de rato de xenotransplante PC-3. Desde pobres transdução de células tumorais por vetores de engenharia a expressão de genes suicidas é uma limitação geral de abordagens GDEPT, procurou-se analisar se Efeito Espectador no sistema suicídio TMPK /AZT são suficientemente robustas para possivelmente compensar as limitações na eficiência de transdução de tumor. Aqui NOD /SCID animais foram inoculados subcutaneamente com não transduzidas PC-3 tumores, e após 11 dias de crescimento de tumor, os tumores palpáveis ​​foram directamente injectados, intratumoral, com 1,5×10 ~

6 partículas virais infecciosas engenharia A expressão do TMPK-F105Y gene suicida. A partir de 24 horas após a injecção dos viriões, os animais receberam diariamente injecções intraperitoneais de AZT (50 mg /kg /dia) ou um controlo de veículo, durante 6 dias consecutivos. Os ratinhos foram sacrificados no final do período de tratamento, e nos tecidos de tumor foram colhidos e pesados.