Abstract

Background

cancros Ambos gástrica e colorretal (CRC) estão ocorrendo mais frequentes malignidades em todo o mundo com a sobrevida global desses pacientes permanece insatisfeito. Identificação de genes supressores de tumor (ETG) silenciados pelo promotor CpG metilação descobre mecanismos de tumorigênese e identifica novos biomarcadores epigenéticas para a detecção precoce do câncer e avaliação do prognóstico. Cistationina-beta-sintase (CBS) funções na via metabolismo do folato, que está intrinsecamente relacionada com a metilação de DNA genômico. Desregulação da metilação do DNA contribui substancialmente para o desenvolvimento do câncer.

Metodologia /Principais Achados

Para identificar potenciais ETG silenciados por metilação do promotor aberrante no CRC, analisamos tumorais e adjacentes tecidos de casos CRC utilizando o Illumina Human Methylation45 BeadChip. Identificamos hipermetilação do

gene CBS

em amostras de CRC, em comparação com os tecidos adjacentes. A metilação e a diminuição da expressão de ARNm de

CBS

foram detectados na maioria das linhas celulares de CRC por PCR específicos de metilação e RT-PCR semiquantitativo, bem como no cancro gástrico. O tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina e /ou tricostatina A metilação inversa e restaurados

CBS

expressão de ARNm, indicando um efeito directo. metilação aberrante foi ainda detectado em 31% dos CRCs primárias (29 de 96) e 55% dos tumores gástricos (11 de 20). Em contraste, a metilação foi raramente encontrados em tecidos normais adjacentes ao tumor.

CBS

metilação foi associada com

KRAS

mutações em CRCs primárias (

P

= 0,04, por χ

2-test). No entanto, não foi encontrada associação entre o

CBS

metilação ou

KRAS

mutações com recidiva do cancro /metástase em pacientes em estágio II CRC.

Conclusão

Um romance encontrar a partir deste estudo é que a enzima metabolismo do folato

CBS

níveis de mRNA são frequentemente reprimidos através CpG metilação do

gene CBS

no câncer gástrico e CRC, sugerindo que

CBS

funciona como um gene supressor de tumor. Estes achados justificam um estudo mais aprofundado da

CBS

como um biomarcador epigenética para o diagnóstico molecular de câncer gastrointestinal

Citation:. Zhao H, Li Q, Wang J, Su X, Ng KM, Qiu T, et ai. (2012) Frequent epigenética silenciamento do gene folato de metabolização de

Cistationina-Beta-sintase

em Câncer Gastrointestinal. PLoS ONE 7 (11): e49683. doi: 10.1371 /journal.pone.0049683

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 27 de julho de 2012; Aceito: 11 de outubro de 2012; Publicação: 13 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (No. 30801344), o programa Nova Beijing (No. 2009A70) eo programa de Laboratório de Referência do Estado (No. 2.060.204). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancros Ambos gástricos e colorretais são as neoplasias mais frequentes em todo o mundo cuja incidência tem aumentado nos últimos anos [1], [2]. Embora diversas novas modalidades de tratamento, incluindo cirúrgica, médica e radiológica, foram introduzidos, o curso clínico de câncer gástrico e colorectal (CRC) é variável eo prognóstico em geral continua a ser insatisfatória. Portanto, a identificação dos principais genes envolvidos na patogênese molecular do câncer gástrico e CRC são susceptíveis de resultar em estratégias terapêuticas novas e mais eficazes.

A inativação de múltiplos genes supressores de tumor (TSG) é um evento molecular chave na multi-passo patogénese genética de CRC [3]. Para além das alterações genéticas, inactivação epigenética de ETG desempenha um papel importante na carcinogénese [4]. silenciamento epigenético através de metilação aberrante de ilhas CpG (CGI) em regiões promotoras TSG ocorre em praticamente todos os tipos de tumores [4]. Particularmente, uma lista crescente de ETG aberrante metilado foi relatada em CRCs, incluindo

APC

,

MGMT

,

MLH1

,

p16

INK4A

,

BVS

,

RASSF1A

,

HIC1

,

chfr

,

ADAMTS18

,

PCDH10 Comprar e

DLEC1

[5] – [10], bem como no câncer gástrico [11], [12]

no presente estudo, nós analisamos para ETG silenciados por metilação do promotor aberrante no CRC. e encontrou hipermetilação do gene da

cistationina-beta-sintase

(

CBS) que codifica para uma enzima chave no metabolismo do folato [13], [14]. Trabalhos recentes tem-se centrado sobre as enzimas envolvidas no metabolismo do folato, uma vez que a metilação do ADN é dependente destas vias [15] – [19]. instabilidade genética com desequilíbrios cromossômicos característicos é uma característica da carcinogênese. metabolismo da homocisteína e folato está relacionada com a integridade do ADN, e as variantes genéticas que funcionalmente influenciar o metabolismo do folato e homocisteína estão associadas a diferentes tipos de cancro, tais como CDC, linfoma não-Hodgkin, etc. [20], [21]. O objetivo do presente trabalho foi verificar se a

CBS

foi um novo TSG potencial e para testar se

CBS

expressão de mRNA foi regulada negativamente por hipermetilação do promotor no CRC, bem como no câncer gástrico. Nós também investigou o papel potencial dos

CBS

hipermetilação do gene como um biomarcador para prever recidiva tumoral ou metástase no estágio II (T

3N

0M

0) pacientes com CCR.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em conformidade com as orientações de Helsínquia para os estudos sujeitos humanos e foi aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital do Câncer, da Academia chinesa de Medicina Ciências (CAMS), Beijing, China. consentimento informado assinado foi obtido de todos os participantes do estudo para a recolha e análise de amostras.

Linhas Celulares

Quatro CRC (HCT116, HT29, LoVo e SW480) e 16 de câncer gástrico (Kato III, YCC1, YCC2, YCC3, YCC6, YCC7, YCC9, YCC10, YCC11, YCC16, SNU719, AGS, MKN28, MKN45, SNU1 e SNU16) linhas celulares foram utilizados [10]. As linhas celulares foram rotineiramente mantidas em meio RPMI-1640 com 10% de FBS. A linha celular HCT116 com nocaute genético de genes metil-transferase de DNA

DNMT1

e

DNMT3B

(duplo nocaute, HCT116

NSO) foi um presente do Dr. Bert Vogelstein, da Universidade Johns Hopkins [22] e cultivadas na presença de 0,4 mg /ml genecitin ou 0,05 mg /ml de higromicina.

amostras tumorais

Todas as amostras de primários, incluindo quatro emparelhado fresco CRC e tecidos normais, 96 de formalina primária parafina fixa incorporados tecidos (FFPE) CRC e 20 FFPE câncer gástrico de tecidos, foram obtidos do Departamento de Patologia, Hospital do câncer, webcams, Beijing, China. Além disso, para o estudo de metilação, foram analisadas as margens livres de tumor correspondentes de 20 cancro gástrico e 17 pacientes de CRC. Todos os pacientes não foram submetidos a quimioterapia ou radioterapia, uma vez que apresentaram tumores ressecáveis. amostras frescas foram congeladas em N líquido

2 e, subsequentemente, armazenadas a -80 ° C até serem processadas. O diagnóstico foi confirmado por meio de hematoxilina e -staining eosina (HE) e análise histopatológica foi realizada para definir regiões tumorais representativas. informação clínica estava disponível para todos os pacientes de CRC, incluindo sexo, idade, diferenciação e dados de acompanhamento. A idade média dos pacientes com CCR foi de 68 anos (variação 37-93), e rácio entre homens e mulheres foi 1.4:1 (56:40). O número de bem, moderado e pobres-diferenciação casos foi de 14, 56 e 26, respectivamente. Cancer estadiamento (pTNM) foi definida de acordo com o 7

ª edição do Comité Misto Americana de câncer [23]. Todos os pacientes CRC estão na fase II (PT

3N

0M

0).

DNA e RNA Extração

Total de RNA e DNA foram extraídas de linhas celulares que utilizam o TRI Reagent (Centro de Investigação Molecular). Para tecidos tumorais frescas, cortes congelados foram obtidos e analisados ​​para garantir que o conteúdo do tumor foi mais do que 80% da área seção. O DNA foi extraído a partir de tecidos frescos e amostras FFPE utilizando o kit de ADN QIAamp® Mini (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante.

Farmacológicos A desmetilação

Duas linhas celulares de cancro gástrico (YCC10 e SNU719) e um CRC linha celular (HCT116) com silenciados

CBS

foram tratadas com 5 uM de 5-aza-2′-desoxicitidina (aZA) (Sigma) durante três dias e seguido com 100 nM de tricostatina a (TSA, Cayman) durante um dia tal como descrito anteriormente [24]. Após o tratamento, o ADN total e o ARN foi extraído.

DNA Metilação Análise

Todas as amostras de ADN foram sujeitas a modificação com bissulfito utilizando o Kit EZ Metilação de DNA (Zymo Research) de acordo com as instruções do fabricante. Um ug de ADN genómico a partir de cada amostra foi bissulfito convertido e eluída em tampão de eluição de 18 ul e 5 ul de cada amostra foi analisado com o ensaio de metilação Ilumina Infinium ADN utilizando o Methylation45 BeadChip Humana (Infinium Metilação 450 K, Ilumina), que é um ensaio específico de alelo com 480.000 CpG loci abrangendo todo o genoma [25]. Os protocolos e informações sonda estão disponíveis em www.illumina.com. Os resultados do ensaio de metilação de ADN foram compilados para cada locus usando o software Ilumina grânulo Estúdio (Ilumina) e são relatados como valores de beta (p), que são contagens de metilação de ADN que vão de 0 a 1, o que reflecte o nível de metilação do DNA fraccionada de uma única sítio CpG [25].

semi-quantitativa de transcrição reversa PCR (RT-PCR)

RT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [9], utilizando

GAPDH como

ao controle. Os iniciadores para a

CBS

estão listados na Tabela 1. O programa de PCR utilizou uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, 35 ciclos (94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C por 30 s), e uma etapa de extensão final a 72 ° C durante 10 min.

KRAS

detecção da mutação por PCR em tempo real

Os sete mutações de ponto de acesso dentro códon 12 e 13 da

gene KRAS

foram examinadas usando o Human

KRAS

mutação qualitativa Kit de Detecção (ACCB Biotech Ltd.). sondas fluorescentes foram projetados para detectar especificamente 7 diferentes mutações pontuais (G12V /S /R /D /A /C e G13D). O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante utilizando o sistema de PCR em tempo real MX3000P (Stratagene). Presença ou ausência de mutações foi avaliado qualitativamente a partir da curva de amplificação de fluorescência.

bissulfito Tratamento e metilação-específica por PCR (MSP) Análise

modificação bissulfito de ADN foi efectuada tal como descrito anteriormente usando 2,4M metabissulfito de sódio [26]. MSP foi realizada como previamente descrito [9]. iniciadores de MSP estão listados na Tabela 1. MSP PCR especificidade iniciador foi confirmado como eles não amplificar modelos de DNA genómico não de bissulfito-tratada. Os produtos MSP de amostras selecionadas foram confirmadas por sequenciação directa.

Análise Estatística

χ

2 testes foram utilizados para analisar possíveis correlações entre parâmetros clínicos,

KRAS

mutação e

CBS

estado de metilação de amostras tumorais. Todas as análises foram realizadas usando SPSS para Windows.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Identificação

CBS

como Gene hypermethylated no CRC

analisados ​​tumor e tecidos adjacentes de quatro casos de CRC chineses usando matriz metilação Illumina que a tela de 480.000 CpG

loci

cobrindo todo o genoma. Entre todos os locais de CpG que foram hipermetilado em amostras de tumor (dados não mostrados), quatro locais de CpG localizados foram

CBS

gene (Figura 1A). A análise da sequência genómica do

gene CBS

, revelou que o seu promotor putativo, um exão e um intrão foi um CGI típico e, portanto, susceptíveis ao silenciamento epigenético (Figura 1A) [27].

a

, diagrama esquemático do

CBS

promotor CpG ilha (CGI), com exão 1 (retângulo preto), locais de CpG (linhas verticais curtas), região MSP é mostrado. O local de início da transcrição está indicado por uma seta curva. Os quatro locais CpG localizadas em

região do gene CBS

identificado por matriz metilação Illumina a ser significativamente hipermetilado no tumor em comparação com tecidos não tumorais (CT /CN) são mostradas.

B

, Expressão de

CBS

foi facilmente detectada em tecidos normais.

C

, Expressão e metilação de

CBS

em linhas celulares de cancro foram examinadas por RT-PCR e MSP, com

GAPDH

como controle. M, metilado, U, não metilado.

silenciamento frequente de

CBS

por metilação do promotor em vários CRC e câncer gástrico linhas celulares

Anteriormente,

CBS

tem sido mostrado para ser fortemente expressa no cérebro, bem como o fígado, pâncreas, rim e tecidos fetais [13]. Para continuar a analisar a correlação entre a

CBS

metilação e expressão de mRNA, primeiro investigou um painel de tecidos humanos normais por RT-PCR semiquantitativo. Os nossos resultados mostraram que

CBS

foi expressa em todos os tecidos normais incluindo os do cólon, do recto e do estômago, embora a diferentes níveis de expressão. O nível de expressão mais elevada foi encontrada em tecidos pâncreas e vias respiratórias (laringe, traquéia e pulmão), enquanto que a baixa expressão estava em tecido da medula óssea (Figura 1B).

Para contrastar

expressão CBS

em condições normais tecidos para células malignas, foram analisadas linhas celulares de tumor gastrointestinal. Semiquantitativa RT-PCR mostrou que

CBS

expressão foi reduzida ou silenciada em 56,3% (9/16) de cancro gástrico e 75,0% (04/03) das linhas celulares de CRC (Figura 1C).

CBS

estado de metilação também foi analisada por MSP nestas linhas celulares. Descobrimos que linhas de células com reduzido ou silenciado

CBS

expressão tinha metilado promotores, enquanto não metilação foi encontrado na posição normal

CBS

linhas celulares de expressão (Figura 2B), indicando que

CBS

metilação do promotor é um importante mecanismo de silenciamento transcricional deste gene na maioria das linhas celulares de cancro examinadas CRC e gástricas.

um

, farmacológico ou desmetilação genética utilizando Aza com TSA induz

expressão CBS

em linhas celulares metiladas e silenciadas. A + T: tratamento de TSA e Aza.

B

, resultados Representante MSP de

CBS

metilação no câncer primário gástrica (GC) e cancro colorectal (CRC). U: MSP para promotor não metilado, M:. MSP para promotor metilado

Restauração de

CBS

Expressão por farmacológica e genética Desmetila�o

Para determinar se a metilação medeia directamente a diminuição do

CBS

expressão de ARNm, uma metilado CRC (HCT116) e duas linhas celulares de cancro gástrico metilados (YCC10 SNU719 e) foram tratadas com Aza, um inibidor da metiltransferase de ADN, e TSA. Após o tratamento,

CBS

expressão foi restaurada em linhas celulares metiladas, juntamente com um aumento marcado de alelos não metilados promotor (Figura 2A). Descobrimos também que

CBS

poderia ser reativado na HCT116

linha de células NSO CRC, que é geneticamente desmetilado através double knockout de ambos DNMT1 e DNMT3B. Concomitantemente, não metilado

CBS

alelos foram detectados em Aza-tratada e HCT116

células NSO, indicando que a metilação do

CBS

promotor leva diretamente ao seu silenciamento no CRC e cancros gástricos.

Frequent

CBS

metilação no CRC Primária e gástrico tumores

Além disso, investigamos a presença de

CBS

metilação do promotor em 96 CRC primária e 20 amostras com câncer gástrico usando a análise de MSP.

CBS

metilação do promotor foi detectado em 30% dos CRC (29/96) e 55% dos tumores gástricos (11 de 20), mas foi raramente encontrada em gástrica normal (20/01, 5%) ou do cólon tecido (0/17, 0%) amostras (Figura 2B). Não houve associação significativa do

CBS

metilação com sexo, idade ou diferenciação do tumor em pacientes com CCR (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que a hipermetilação do

CBS

promotor é um evento comum na CRC e cancros gástricos.

Correlação de

CBS

metilação e

KRAS

Mutation na Primária CRC tumores

mutações comuns de códons 12 e 13 do exão 2 do

gene KRAS

foram examinados em 96 primária CRC, onde

CBS

estado de metilação foi anteriormente analisadas (Tabela 2).

KRAS

mutação foi detectada em 45% (13/29) de

CBS

-methylated e 24% (16/67) de

CBS

CRCs primários -unmethylated indicando uma correlação positiva entre o

CBS

metilação e

KRAS

mutações (

P Art 0,05). Outras análises mostraram nenhuma correlação de

CBS

metilação e

KRAS

mutação com a recidiva do câncer /metástase em fase II, os doentes CRC (Tabela 2).

Discussão

para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para identificar

CBS

como candidato metilado TSG em cancros gastrointestinais. Nós demonstramos que

CBS

expressão de ARNm estava ausente em várias linhas celulares de cancro colo-rectal e do estômago devido à metilação do promotor. Além disso, o

gene CBS

foi frequentemente metilado no CRC e pacientes com câncer gástrico, sugerindo que

CBS

age como um TSG no CRC e câncer gástrico sendo freqüentemente inativado por metilação.

O gene

CBS

, localizado em 21q22.3 cromossoma, codifica uma enzima importante envolvida na transulfuration de homocisteína produzida durante o metabolismo metil-grupo [27]. Notavelmente,

CBS

causas de deficiência de aumento dos níveis de metionina no plasma e níveis diminuídos de cisteína [14], [28], que por sua vez são conhecidos para correlacionar com homocistinúria, doença cardiovascular e carcinoma hepatocelular [14], [21]. A via transulfuration liga metabolismo da metionina para a biossíntese de moléculas de controlo redox celulares, tais como a cisteína, a glutationa, a taurina e [18]. Cisteína gerado através da via transulfuration determina os níveis de moléculas de controlo redox celulares, tais como células de glutationa e taurina proteger contra danos reactiva induzida por espécies [29] de ADN através da base e do açúcar modificações, sítios livres de base, as reticulações de ADN-proteína, e Strand quebras [30], [31]. Assim, reprimidos expressão de

CBS

pode prejudicar a produção de glutationa facilitando assim tumorigênese [16]. Além disso, o desequilíbrio redox estimula a cinase de proteína e poli- (ADP ribosilação) vias que levam à inibição da apoptose e que resultam na morte celular por necrose, seguido por respostas inflamatórias e desenvolvimento de tumores [32]. Existem alguns estudos que avaliaram a associação entre a susceptibilidade tumor maligno e polimorfismos do gene da

CBS

(844ins68) no CRC [19], [33], mas não no esôfago ou cancro gástrico [15]. Além disso,

CBS

844ins68 polimorfismo está associado à diminuição sobrevivência no câncer de cabeça e pescoço de células escamosas [34].

Além disso, a perda de

CBS

expressão pode levar a a acumulação de homocisteina, que será reciclado para metionina pela metionina systhase através da via remetilação [14]. Como metionina actua como fonte de metil grupo dador para a metilação do DNA, o seu aumento causado pela perda de

CBS

expressão podem desregular a metilação de DNA. Nossos resultados revelaram metilação frequente de

CBS

em linhas celulares de cancro gastrointestinal e tumores primários. Assim, a supressão de

CBS

por metilação do promotor, em vez de alterações genéticas, também iria resultar numa perturbação do metabolismo metil-grupo e contribuir para o desenvolvimento do cancro com o aumento do dano do ADN por stress oxidativo, prejudicando a capacidade antioxidante, e dysregulating metilação do DNA. No entanto,

CBS

metilação não foi associada com a recorrência em nossa coorte de pacientes com estágio II CRC. Sugerimos que maior número de pacientes são necessários para estudar este potencial associação com poder estatístico suficiente.

O valor prognóstico da

KRAS

mutações em pacientes com CRC permanece controverso. Um estudo realizado por Roth

et al.

Sugeriu que o valor prognóstico para

KRAS

estado de mutação para PFS e OS estava faltando em pacientes com estágio II e III ressecado cancro do cólon [35]. No entanto, tem sido relatado que pacientes em estágio III tendo

KRAS

mutações exibido sobrevida livre de doença significativamente pior em comparação com aqueles que têm de tipo selvagem

KRAS

[36]. Mais importante ainda, alguns estudos têm diferenciado

KRAS

mutações no códon 12 daqueles no códon 13 no que diz respeito às características clínico-patológicas e sobrevivência [37] – [40]. Neste estudo, não foi possível identificar

KRAS

estado de mutação como fator prognóstico de recidiva ou metástase em pacientes com estágio II ressecado CRC. Em vez disso, descobrimos que

CBS

metilação foi significativamente associada com

KRAS

mutações. Este recurso está em linha com um relatório anterior mostrando que CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) está associada a

mutações KRAS

[41].

Em resumo, a constatação saliente a partir deste estudo é que

CBS

é suprimida por metilação do promotor em colorectal e cancro gástrico. Verificou-se que o silenciamento mediado por metilação de

CBS

podia ser revertida por desmetilação genética ou farmacológica, sugerindo que em>

funciona como um supressor de tumores nestes tipos de cancro. A desregulamentação do

CBS

e sua associação com um fenótipo de tumor maligno é potencialmente associados ao papel crucial da CBS no metabolismo da metionina e para a manutenção da homeostase redox intracelular. Nosso estudo requer uma análise mais aprofundada da

CBS

como um biomarcador epigenética para o diagnóstico molecular de CRC e câncer gástrico.

Reconhecimentos

Agradecemos Professores Qian Tao e Wang Jing para útil comentários e suporte técnico e Drs Sergio Rey e Yuan Qiao para a edição crítica para este manuscrito. Agradecemos também o Dr. Bert Vogelstein para a linha celular HCT116

DKO e Dr. Keith Robertson de amostras de DNA de algumas linhas celulares de CRC.