Sumário

A mucina 2 (MUC2) é uma molécula mucina expressão aberrante pelas células de cancro do ovário. Anterior Estudos in vitro indicaram que MUC2 promove o crescimento e a metástase de cancros através de um mecanismo dependente de macrófagos associados a tumores (TAM). No entanto, este mecanismo não tenha sido ligada a oncologia clínica, e seu significado prognóstico necessário para ser clarificado. Aqui, foram coletados 102 espécimes consecutivos cancro do ovário e utilizada a técnica de múltipla de imuno-histo-química /-fluorescent para determinar a correlação entre o estado de expressão MUC2, a relação de M1 /​​M2 MAT e as densidades de ciclo-oxigenase-2 (COX-2 )

+ TAMs e COX-2 células

+ cancerosas. A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e análise multivariada de regressão de Cox foram utilizados para avaliar as influências de prognóstico destes parâmetros. Como resultado, verificou-se que a sobre-expressão MUC2 (imunocoloração ++ /+++) foi significativamente correlacionada com um rácio reduzido de M1 /​​M2 TAM (p 0,001), um aumento da densidade de COX-2

+ TAM ( p 0,001) e um aumento da densidade de COX-2

+ células cancerígenas (p = 0,017). Além disso, a maior parte do M2 TAM (93% -100%) e COX-2

+ MAT (63% -89%) sobrepostos; ea COX-2

+ células cancerosas foram frequentemente observadas perto da COX-2

+ TAM. Na análise de regressão de Cox, MUC2 sobreexpressão foi encontrado para ser um factor independente de prognóstico para pacientes de cancro do ovário, dos quais o risco relativo (RR) foi 2,354 (intervalo de confiança de 95% (CI): 1,031-10,707, p = 0,005). Além disso, a proporção reduzida de M1 /​​M2 TAM eo aumento das densidades de COX-2

+ TAM e COX-2

+ células cancerosas foram demonstrou ser os preditores de mau prognóstico, entre os quais a redução M1 /​​M2 proporção possuía o maior FC (1,767, IC de 95%: 1,061-6,957, p = 0,019). Todos estes resultados revelaram que MUC2 pode simultaneamente exercer-M2 de polarização e os efeitos na TAM, pelo qual ela provoca um padrão de desequilíbrio /M2-M1-TAM polarização e induz

2 síntese local de PGE (em ambos os TAM COX-2 e induzir células cancerosas). O feedback positivo entre o local PGE

2 síntese e TAM M2-polarização acelera a progressão do câncer de ovário.

citação: Ele Y-M, Zhang H-Y, Wu X, X-Sol J, Xu t, Ele Q-Z, et al. (2013) Expressão alta MUC2 no cancro do ovário é inversamente associado com o Coeficiente de M1 /​​M2 de Tumor-Associated macrófagos e paciente o tempo de sobrevivência. PLoS ONE 8 (12): e79769. doi: 10.1371 /journal.pone.0079769

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de julho de 2013; Aceito: 26 de setembro de 2013; Publicação: 06 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Key disciplinas e especialidades Fundação dos Serviços de Saúde de Xangai, o disciplinas-chave Fundação da Comissão de Educação Xangai (número de concessão 08YZ43), a Fundação de Pesquisa científica da Ciência e Tecnologia da Comissão de Xangai (número de concessão 12411950200), o Key Projeto Disciplina de Renji Hospital, Faculdade de Medicina, Shanghai Jiaotong University, a China pós-doutoramento Science Foundation (número de concessão 2011M500795) e da National Science Foundation Natural da China (números de subvenção 81272882 e 81072137). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial ameaça a saúde de mulheres adultas e é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em mulheres na pós-menopausa [1]. As interacções entre as células de cancro do ovário e células hospedeiras imunes têm sido intensamente estudadas por oncologistas clínicos para determinar como estas células cancerosas escapar ou mesmo fazer uso do sistema imunitário do hospedeiro para sobreviver, proliferar e metástase [2,3]. Em pesquisas anteriores, uma série de moléculas de mucina (MUCs aberrante) secretadas por células de cancro do ovário foram identificadas, incluindo MUC1, MUC2 e MUC16 [4-6]. Estas mucinas compreendem uma família de glicoproteína que caracteriza uma serina- e núcleo polipéptido repetitivo enriquecido-treonina e um grande número de O-glicanos ligados a este núcleo [4]. Em circunstâncias fisiológicas, mucinas servir como uma barreira protectora e a camada de lubrificante que mantém a estrutura e função do tracto digestivo, do tracto respiratório, tracto reprodutivo e do tracto urinário, bem como os coeloms, tais como a cavidade peritoneal, a cavidade pleural e as cavidades articulares [5]. No entanto, quando ocorre a transformação maligna, os níveis de secreção de mucina é dramaticamente melhorada, e as estruturas dos glicanos dentro destas moléculas podem ser alterados [7,8]. Uma vez liberado para a circulação, mucinas podem servir como biomarcadores de câncer, como o CA125 (codificado por MUC16) e CA153 (codificado por MUC1) [4-8]. Vários estudos pré-clínicos indicaram que as mucinas derivadas de malignidade pode facilitar a progressão do cancro através das suas interacções com células imunitárias [9-11]. Por exemplo, em experiências in vitro realizados por Inaba et ai. mostraram que os macrófagos induzidos MUC2 dentro de tecidos de cancro para expressar ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e liberte a prostaglandina E2 (PGE

2). Estes autores também sugerem que a PGE secretada por macrófagos

2, por sua vez poderia promover o crescimento tumoral e metástase [12]. Os seus resultados indicaram que MUC2 pode ser usado como um supressor imunitário por células cancerosas.

Os tipos e números de macrófagos que infiltram o tecido do cancro (isto é, macrófagos associados a tumores ou TAM) estão intimamente relacionadas com o cancro o prognóstico do paciente [ ,,,0],13,14]. MAT podem ser divididos em dois fenótipos, M1 e M2. TAM M1-polarizados libertar intermediários de oxigénio e azoto reactivos para matar as células cancerosas ou libertam factores imunomoduladores, tais como interleucina-1β (IL-1β) e IL-12, que provocam

+ células T CD8 para atacar as células de cancro [13, 14]. TAM M2-polarizados têm efeitos opostos. Eles libertar o factor de crescimento epidérmico (EGF), derivado de plaquetas do factor de crescimento (PDGF), factor de crescimento de transformação do tumor (TGF) -β, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e outros factores tróficos que promovem o crescimento de células de cancro e o processo de vascularização do cancro [ ,,,0],13,14]. Além disso, estes TAM M2 pode produzir uma variedade de metaloproteinases de matriz (MMP2, MMP7, MMP9 e MMP12) e quimiocinas [ligando motivo CXC (CXCL) 8, ligando CC motivo (CCL) 13, CCL18 e CCL23] que facilitam micrometástases do cancro [13 , 14]. Estudos anteriores demonstraram que uma densidade relativamente alta de infiltrar M1 TAM e uma alta taxa de M1 /​​M2 são positivamente correlacionados com a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com câncer (como pacientes com câncer de pulmão não-pequenas células, cancro da próstata e cancro colorectal ) [15-17]. Além disso, eliminando M2 polarizado TAM usando agentes quimioterápicos podem inibir a progressão da doença e melhorar o resultado paciente [18,19]. Uma série de substâncias liberadas pelas células cancerosas, tais como IL4, IL10 e fator estimulante de colônias (CSF) -1, foram encontrados para induzir monócitos /macrófagos imaturos (M0) de se diferenciar em M2 TAM [20,21]. No entanto, o papel de mucinas segregadas por células cancerosas no processo de diferenciação TAM permanece obscura.

Como MUC2 foi encontrado para interagir com MAT através dos seus receptores (isto é, o receptor de macrófagos sequestrante) na superfície da célula, nós eram bastante interessado em saber se eles também podem influenciar a diferenciação M1 /​​M2 destas células imunes. Enquanto isso, também é necessário para interpretar os resultados de Inaba et al. em um contexto clinicamente relevante, o que pode beneficiar o tratamento clínico e vigilância dos doentes com cancro do ovário. Para esses fins, no presente estudo, nós analisada quantitativamente o número, a densidade e as características moleculares de macrófagos em tecidos de cancro do ovário e avaliadas as relações dos parâmetros TAM obtidos com o nível de expressão em tecidos de cancro MUC2. Descobrimos que MUC2 desempenhou um papel significativo no processo de diferenciação TAM intratumoral, favorecendo o fenótipo M2. Além disso, com base nos resultados de Inaba et ai. [12], temos explorado e analisado o mecanismo de COX-2-indução possível pelo qual MUC2 medeia a polarização M2 de TAM e determinou-se a significância clínica deste mecanismo para o paciente a longo prazo sobrevivência.

resultados

as relações entre o nível de expressão MUC2 e demográfico do paciente, características clínicas e patológicas

Um total de 102 casos foram estudados (Tabela 1). A imuno-histoquímica demonstrou que as amostras de 47,1% (48 casos) dos pacientes incluídos exibiram diferentes níveis de expressão MUC2 (+, ++, ou +++). Para diferenciar o status superexpressão de MUC2 de sua expressão de linha de base, foi realizado um experimento imunohistoquímica paralelo em 33 amostras de tumores de ovário benignos (métodos para a recolha de amostras foram fornecidas por Materiais e Métodos S1 no arquivo S1; características demográficas e patológicos de 33 pacientes eram providenciada pela tabela S1). Os resultados demonstraram “+” MUC2-imunocoloração em 36,4% dos casos benignos, e nenhum caso de tumor benigno com níveis mais elevados de positividade foram detectados (veja a Figura S1 em S2 Arquivo). Estes resultados sugerem que a expressão da linha de base MUC2 em tumores benignos do ovário corresponde a MUC2 – /+ imunocoloração, enquanto MUC2 ++ /+++ imunocoloração é mais específico para tumores malignos e representa um estado sobre-expressão genuína [23-25]. Por isso, dividimos os pacientes correspondentes em dois grupos: um grupo de alto MUC2 expressão (++ e +++) e um grupo de expressão baixo MUC2 (- e +), com 23 e 79 casos, respectivamente. Em seguida, foram comparadas as características demográficas, clínicas e patológicas de pacientes nos dois grupos. Encontramos uma correlação significativa entre o nível de expressão MUC2 eo histotipo câncer. A taxa de MUC2 sobre-expressão foi significativamente aumentada no cancro do ovário mucinoso (p = 0,002, χ

2 teste, Tabela 1). No entanto, observamos nenhuma relação significativa entre qualquer um dos outros parâmetros, incluindo a idade do paciente, índice de massa corporal (IMC), gravidity, paridade, estado metástase do câncer, estágio clínico e grau patológico, e o nível de expressão MUC2 (Tabela 1).

Características

Baixa MUC2 grupo expressão (n = 79)

alta MUC2 grupo expressão (n = 23)

p valor

†

Demografia :Idade (years)59.2±6.159.8±6.70.680Gravidity4.2±1.23.6±1.20.107Parity1.1±0.41.2±0.50.544BMI23.2±2.623.0±1.90.769Oral uso de contraceptivos 6 meses 7 (8,9) 2 (8,7) 0.980Smoking 6 meses 12 (15,2) 5 (21,7) 0.458Alcohol abuso 6 meses1 (1,3) 1 (4,3) características 0.348Clinical: Ascites20 (25.3) 7 (30,4) metástase 0.624Peritoneal (incluindo intestinal, bexiga e metástase hepática e peritoneal lavagem exame citológico +) 62 (78,5) 16 (69,5) nó 0.375Lymph metastasis30 (38,0) 8 (34,8) resistência 0.781Drug durante os course2 quimioterápicos primários (2,5 ) 1 (4.3) 0.650Pathology: Stage

**

0.383II23(29.1)4(17.4)III53(67.1)17(73.9)IV3(3.8)2(8.7)Histotype0.002

§

Serosa 57 (72,2) 10 (43,5) mucinoso 7 (8,9) 10 (43,5) Endometrioid8 (10,1) 1 (4,3) Limpar cell5 (6,3) 2 (8,7) Undifferentiated2 (2,5) 0 (0) Grau

**

0,182 G140 (50,6) 8 (34,8) G219 (24,1) 10 (43,5) G320 (25,3) 5 (21,7) Tabela 1. As relações entre as características do paciente e os níveis de expressão MUC2 *.

* os dados são apresentados como valores médios ± desvio padrão ou como o número (percentagem)

** Veja referência 22

† t-teste ou de um estudante de duas caudas χ

foi usado 2 teste, conforme o caso.

§ A significância estatística. CSV Baixar CSV

Correlação entre o tecido canceroso status de expressão MUC2 ovário ea relação TAM M1 /​​M2

Os TAM nas amostras de câncer de ovário foram analisados ​​quantitativamente com base em CD68 imunocoloração único [17,26]. As densidades de CD68

+ células nos tecidos de câncer do grupo de expressão alta MUC2 eo grupo expressão MUC2 baixo eram semelhantes (27,3 ± 13,6 milímetros

-2 vs 26,0 ± 11,9 milímetros

-2); e sem significância estatística foi estabelecida (p = 0,654, teste t de Student). Em seguida, os espécimes de câncer foram duplo imunocoradas para explorar o estado de diferenciação intratumoral dos TAMs. O + antigénio de leucócitos anti-humano anti-CD68 (HLA) -DR e anti-CD68 anti-induzível da sintase do óxido nítrico (iNOS), os painéis de anticorpos foram usadas para identificar M1-polarizada TAM, e o anticorpo anti-CD68 anti-CD163 e anti-CD68 anti-VEGF painéis de anticorpos foram usadas para identificar M2-polarizada TAM (Figura 1) [17,26]. Nosso teste preliminar confirmou que HLA-DR

+ CD163

+, HLA-DR

+ VEGF

+, iNOS

+ CD163

+ e iNOS

+ VEGF

+ MAT representam menos de 3% (1,2%, 1,7%, 2,1% e 2,6%, respectivamente) do total TAM, indicando que os TAM dificilmente são duplamente marcadas com ambas as assinaturas M1 e M2. Após examinar as secções de tecido de câncer, observou-se que a densidade intra-ilhota de TAMs M1-polarizado (CD68

+ HLA-DR

+ ou CD68

+ iNOS

+) foi significativamente menor no grupo expressão MUC2 alta do que no grupo expressão MUC2 baixa (p 0,01, teste t de Student, Tabela 2). Em contraste, a densidade intra-ilhéus de M2-polarizada TAM (CD68

+ CD163

+ ou CD68

+ VEGF

+) no grupo expressão elevada MUC2 foi significativamente mais elevada do que a do baixo grupo expressão MUC2 (p 0,001, teste t de Student, Tabela 2). Além disso, foram analisados ​​os índices de M1 /​​M2 baseado em TAMs coloração com CD68

+ HLA-DR

+ ou CD68

+ CD163

+ em duas secções de tumores consecutivos de cada paciente. A relação M1 /​​M2 significativo resultante foi significativamente menor no grupo expressão elevada MUC2 do que no grupo de baixa expressão MUC2 (p 0,001, teste t de Student, Tabela 2), o que foi consistente com o padrão de distribuição M1 /​​M2 dos MAT de estes dois grupos (Figura 1).

(A) Representante MUC2 e CD68 single-histoquímica e CD68 /HLA-DR, CD68 /iNOS, CD68 /CD163, CD68 /VEGF seções duplas-histoquímica do grupo expressão alta MUC2. (B) Representante MUC2 e CD68 single-histoquímica e CD68 /HLA-DR, CD68 /iNOS, CD68 /CD163, CD68 /VEGF seções duplas-histoquímica do grupo expressão MUC2 baixa. Para VEGF e iNOS-imunocoloração, as células cancerosas (vermelho) em que expressavam de forma independente destas duas proteínas pode ser encontrado nas secções de tecido de cancro a partir de ambos os grupos (seta). Asterisk, TAM (em marrom), que expressa a proteína CD68. Arrow, CD68

+ TAM (em roxo), que co-expressa as proteínas indicadas (HLA-DR, iNOS, CD163 ou VEGF). Barra de escala (preto), 100 mm. bar Inset escala (branco), 10 mm. (C) A comparação das percentagens de diferentes subpopulações de células M1 e M2 (ou seja, M1 /​​M2 padrões de distribuição) entre todos os TAMs. Pode-se notar que as percentagens de macrófagos M1 foram significativamente maiores do que as de macrófagos M2 no grupo expressão elevada MUC2; mas, pelo contrário, as percentagens de macrófagos M1 foram significativamente menores do que os dos macrófagos M2 no grupo de baixa expressão MUC2. *, P 0,05, ANOVA.

Grupos em total CD68

+ TAM densidade

*

M1 densidade

* (HLA-DR)

M1 densidade

* (iNOS)

densidade M2 ​​

* (CD163)

M2 densidade

* (VEGF)

relação M1 /​​M2 (calculado)

†

relação M1 /​​M2 (real)

†

alta MUC2 group17.4 expressão ± 8.36.7 ± 5.86.6 ± 4.79.9 ± 7.211.5 ± 7.90.69 ± 0.280.58 ± 0.12Low MUC2 expressão group16.1 ± 8.211.0 7.212.0 ± ± 7.34.6 ± 3.94.5 ± 3.82.75 ± 2.422.83 ± 2.16p value

**0.5230.008

§0.001

§ 0.001

§ 0.001

§ 0.001

§ 0.001

§Table 2. A densidade e a relação M1 /​​M2 de TAM dentro da região do ilhéu do tecido do cancro do ovário.

* Os dados são apresentados como os valores médios ± DP por mm

2. A densidade total TAM foi determinada por CD68 única imunocoloração, e as densidades M1 e M2 TAM foram determinadas usando dupla imuno-base CD68. As assinaturas utilizadas para identificar os fenótipos M1 e M2 de TAM são indicados em parênteses. ** Dois-atado teste t de Student.

† A relação M1 /​​M2 foi calculada dividindo a densidade M1 TAM (CD68 e HLA-DR positivo) pela densidade M2 ​​TAM (CD68 e CD163-positiva), em duas secções representativas

O .17,23 proporção real M1 /​​M2 é definido como o número de CD68

+ HLA-DR

+ células dividido pelo número de CD68

+ CD163

+ células nos mesmos campos de duas secções consecutivas.

17,23

§ A significância estatística. CSV Baixar CSV

Correlação entre o tecido de câncer de status e expressão MUC2 ovário TAM COX-2 expressão

Para estabelecer a relação entre o estado de expressão de MUC2 no tecido canceroso e nível de expressão de COX-2 em TAMs comparamos as densidades de COX-2

+ MAT em amostras de cancro entre os grupos de expressão MUC2 alto e baixo. Como mostrado na Figura 2, verificou-se que, independentemente do nível de expressão MUC2 geral, a densidade de CD68

+ COX-2

+ MAT foi significativamente maior nos ilhéus do cancro, em que as moléculas MUC2 foram vigorosamente secretadas, em que as regiões do estroma, em que as moléculas MUC2 foram mal secretadas (p 0,001, ANOVA, Figura 2). Além disso, tanto nas ilhotas cancerosas ou nas regiões do estroma, a densidade de CD68

+ COX-2

+ MAT foi significativamente maior no grupo de expressão elevada MUC2 do que no grupo de baixa expressão MUC2 (p 0,001, ANOVA, Figura 2). Além disso, em toda a secção (ilhota + Câncer região do estroma), a razão média de CD68

+ COX-2

+ MAT /total de CD68

+ MAT foi significativamente maior no grupo de expressão elevada MUC2 do que na o grupo de baixa expressão MUC2 (p 0,001, teste t de Student, Figura 2). Um número de CD68

-COX-2

+ células cancerosas foram observados em torno do CD68

-COX-2

+ TAM, particularmente nos espécimes do grupo expressão alta MUC2 (Figura 2).

(A) CD68

+ COX-2

+ TAM em uma seção de tecido de câncer de representante do grupo expressão alta MUC2 foram mostrados. (B) CD68

+ COX-2

+ TAM em uma seção de tecido de câncer de representante do grupo expressão MUC2 baixo foram mostrados. Os núcleos foram corados com SYTO 40, mostrado em roxo. Arrowhead, CD68

+ COX-2

+ TAM. Seta, CD68

+ COX-2

– TAM. Asterisk, COX-2

+ células cancerosas (CD68

-) em torno do CD68

+ COX-2

+ TAM. (C) As densidades intratumorais de CD68

+ TAM e CD68

+ COX-2

+ TAM ea CD68

+ COX-2

+ /CD68

+ rácios da TAM de os grupos de expressão MUC2 alta e baixa foram comparados, assim como os valores correspondentes para o cancro da ilhota e as regiões do estroma. Pode considerar-se que a proporção de CD68

+ COX-2

+ /CD68

+ MAT foi significativamente maior no grupo de expressão elevada MUC2 do que no grupo de baixa expressão MUC2 *, P 0,05, Student t-teste. **, P 0,05, ANOVA.

M1 e M2 padrões de diferenciação e sua relação com a TAM COX-2 expressão

Para estabelecer a relação entre o nível de expressão de COX-2 e do estado de diferenciação da TAM, usamos uma técnica triple-imunocoloração para determinar os padrões M1 = ovelhas e M2-diferenciação do CD68

+ COX-2

+ TAM que havia se infiltrado nos tecidos de cancro do ovário. Geralmente, em todas as amostras, 3% -20% do CD68

+ COX-2

+ MAT foram identificados como M1 polarizada (HLA-DR

+ ou iNOS

+), e 63% -89% foram identificados como M2 polarizada (CD163

+ ou VEGF

+), independentemente do estado de expressão MUC2. No entanto, a percentagem média de M1-polarizados de COX-2

+ MAT foi significativamente menor no grupo expressão elevada MUC2 do que no grupo de baixa expressão MUC2 (p 0,001, ANOVA); e a percentagem média de M2-polarizados de COX-2

+ MAT foi significativamente maior no grupo de expressão elevada MUC2 (p 0,001, ANOVA, Figura 3). Além disso, o inibidor de COX-2

+ células nas secções de tecido de cancro responsável por 3% a 13% de toda a observada M1 TAM (isto é, CD68

+ HLA-DR

+ ou CD68

+ iNOS

+ células), e foi responsável por 93% a 100% do M2 TAM observada (CD68

+ CD163

+ ou CD68

+ VEGF

+). Os rácios de COX-2

+ células nas populações M1 e M2 TAM dos dois grupos de expressão MUC2 não foram significativamente diferentes (por subconjuntos M1, p = 0,161 e para subconjuntos M2, p = 0,610, ANOVA, Figura 3) .

(A) Representante CD68, COX-2 e M1 /​​M2 assinatura seções triplas-histoquímica são mostrados. Arrowhead, COX-2

+ TAM que expressavam as assinaturas M1 ou M2. A seta amarela, COX-2

+ TAM que não expressaram os índices de assinatura M1 ou M2. seta azul, COX-2

– M1 ou M2 TAM. Asterisk, COX-2 células

+ cancerosas. Barra de escala, 10