Abstract

A superexpressão e /ou ativar mutação de FLT3 quinase desempenham um papel importante na condução patogénese de leucemia mielóide aguda (LMA). Assim, os inibidores de FLT3 farmacológicas são de potencial terapêutico para o tratamento de AML. Neste estudo, BPR1J-340 foi identificado como um novo inibidor FLT3 potente pela atividade quinase bioquímica (

50 cerca de 25 nm IC) e proliferação celular (GC

50 aproximadamente 5 milhas náuticas) ensaios. BPR1J-340 inibiu a fosforilação de FLT3 e STAT5 e desencadeou a apoptose em FLT3-ITD

+ células de LMA. Foram determinados os parâmetros farmacocinéticos de BPR1J-340 em ratos. BPR1J-340 também demonstrou inibição do crescimento do tumor pronunciado e regressão no FLT3-ITD

+ AML modelos de xenotransplante de murino. O tratamento de combinação do vorinostat inibidor de HDAC (SAHA) com BPR1J-340 sinergicamente apoptose induzida através de Mcl-1 infra-regulação em 13 MOLM células AML, indicando que a combinação de inibidores de FLT3 quinase selectivos e inibidores de HDAC podem apresentar benefício clínico em LMA terapia. Nossos resultados sugerem que BPR1J-340 pode ser desenvolvida nos estudos pré-clínicos e clínicos como terapêutica em tratamentos AML

Citation:. Lin WH, Yeh TK, Jiaang WT, Yen KJ, Chen CH, Huang CT, et ai. (2014) Avaliação dos efeitos anti-tumor de BPR1J-340, uma combinação potente e selectivo inibidor de FLT3, isoladamente ou em com um inibidor de HDAC, Vorinostat, em Câncer LMA. PLoS ONE 9 (1): e83160. doi: 10.1371 /journal.pone.0083160

editor: Zhengqi Wang, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de julho de 2013; Aceito: 31 de outubro de 2013; Publicação: 08 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os financiadores não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a leucemia mielóide aguda (LMA) é a neoplasia hematológica mais comum em adultos com uma taxa de incidência elevada e baixa probabilidade de sobrevivência [1], [2], [3]. LMA progride rapidamente, devido ao rápido crescimento das células brancas do sangue anormais que se acumulam na medula óssea e interferem com a produção de células vermelhas do sangue, plaquetas e glóbulos brancos do sangue normais. Se não tratada, AML é geralmente fatal dentro de semanas ou meses após o diagnóstico. FLT3 (tirosina de tipo fms quinase 3), um receptor da superfície celular que pertence à classe III da família de receptores de tirosina-quinase, desempenha um papel fundamental na diferenciação e sobrevivência das células-tronco hematopoiéticas na medula óssea [4], [5].

FLT3

é um dos genes mutados mais comuns em LMA [6], [7]. A activação de mutações de FLT3, FLT3-ITD (uma mutação duplicao em tandem interna no domínio justamembrana) e FLT3-TKD (uma mutação sem sentido no interior do domínio de quinase), são frequentemente observada em aproximadamente 30% dos pacientes adultos com LMA [8], [9] [10], [11]. mutantions de ativação de FLT3 regulam criticamente transformação leucêmica, acelerando a proliferação e suprimir a apoptose e estão significativamente associados com mau prognóstico [12], [13]. Estes resultados destacam FLT3-ITD e FLT3-TKD como altamente atraentes alvos terapêuticos para o desenvolvimento de drogas em AML humano.

Agora existem várias classes de inibidores de FLT3 de moléculas pequenas que entraram ensaios clínicos. No entanto, os fármacos eficazes ainda não foram identificados em clínicas [14], [15], [16]. Embora estes inibidores demonstraram atividade anti-câncer promissor no

in vitro

e

in vivo

modelos pré-clínicos, respostas clinicamente positivos em pacientes com LMA que recebem inibidores de FLT3-agente único são limitadas devido à redução transitória de blastos periféricas mas não blastos na medula óssea ou a ocorrência de mutações FLT3 inibidor resistente em pacientes [17], [18], [19], [20]. Portanto, as estratégias combinatórias de inibidores de FLT3 e outros agentes quimioterápicos pode ser abordagens benéficas para melhorar a terapia com inibidor FLT3 e para superar as falhas do tratamento [21], [22]. O inibidor de FLT3 CEP-701 (lestaurtinib) combinado com agentes quimioterápicos AML padrão tem o potencial de melhorar os resultados clínicos em pacientes com LMA [23]. Além disso, os inibidores da histona-desacetilase (HDACi), uma classe de compostos que podem induzir a paragem do crescimento de células cancerosas e a morte das células, alterando o estado de acetilação de proteínas tanto histonas e não-histonas, podem aumentar a actividade dos inibidores de FLT3 na LMA apoptose celular [ ,,,0],24], [25], [26]. O vorinostat HDACi (SAHA) exibe actividade clínica em AML; No entanto, a sua eficácia como um agente único é apenas moderado [27], [28]. Neste estudo, são descritos elementos que caracterizam o perfil farmacológico de um novo inibidor da quinase de FLT3, BPR1J-340, e elucidar o mecanismo molecular possível dos efeitos fortemente sinérgicos em combinação com SAHA em FLT3-ITD

+ células.

O composto BPR1J-340 exibe uma actividade inibidora potente de FLT3, com uma concentração inibitória de 50% (IC

50), de 25 ± 5 efeitos inibitórios nm e de crescimento sobre FLT3-ITD

+ leucemia MOLM-13 e MV4 ; 11 células com um GC

50 valor de 3,4 ± 1,5 e 2,8 ± 1,2 nM, respectivamente. Os sub

50 valores IC foram de aproximadamente 1 nM contra FLT3-ITD e 1 nM para a fosforilação STAT5 em MV4; 11 células. Além disso, BPR1J-340 exibe propriedades farmacocinéticas favoráveis ​​e actividade anti-tumoral significativa em modelos de xenoenxerto de murinos FLT3-ITD. A combinação do inibidor de HDAC com SAHA BPR1J-340 exposições fortemente efeito anti-leucemia sinérgico em FLT3-ITD + células. Estes resultados destacam o potencial terapêutico da BPR1J-340 e SAHA na AML e apoiar o seu desenvolvimento pré-clínico ou clínico.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

Os inibidores de FLT3, BPR1J-340 e AC220, foram sintetizados pelo nosso laboratório. O vorinostat inibidor da desacetilase de histona (SAHA) foi adquirido a partir de SelleckBio (Houston, TX, EUA). Todos os inibidores foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de estoque de 10 mM. O anti-FLT3 (sc-480, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-pFLT3-Tyr591 (# 3461, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) anti-STAT5 (# 9363, Cell Signaling Technology ), anti-pSTAT5-Tyr694 (# 9351, Cell Signaling Technology), anti-clivada poli polimerase de ADP-ribose (PARP) (# 9542, Cell Signaling Technology), anti-Mcl-1 (# 4572, Cell Signaling Technology), anti-caspase 3 (# 9662, Cell Signaling Technology) e anti-β-actina anticorpos (Gtx110546, GeneTex, Irvine, CA, USA) foram adquiridos por análise de transferência de Western. A preparação de proteínas recombinantes, FLT3 (resíduos Y567-S993), VEGFR1 (resíduos R781-I1338) e VEGFR2 (resíduos V789-V1356), para o ensaio de cinase bioquímica foi descrito anteriormente [29]. Os VEGFR3 (resíduos M800-Y1363) proteínas foram adquiridos da Upstate (Billerica, MA, EUA)

cultura celular

RS4;. 11, MV4; 11, as células U937 e K562 foram obtidas a partir de Colecção americana de Culturas Tipo (ATCC, Manassas, VA, EUA). células MOLM-13 foram adquiridos da Deutsche Sammlung von o Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Todas as linhas celulares de leucemia foram crescidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, EUA) com soro fetal bovino a 10% (FBS) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). O HEK293T e células HEK293T transfectadas com FLT3 foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, EUA) com meio de soro fetal de bovino 10% (FBS). As outras 14 linhas de células não-leucémicas, HCC827, H1975, H1650, H2228, NCIH460, A431, HCT-116, MKN45, MiaPaCa-2, RT4, MCF-7, Huh7, Hep3B e Detroit 551, foram cultivadas em meio de acordo com as recomendações da ATCC.

in vitro a actividade da quinase de ensaio

O FLT3 e ensaios de quinase VEGFR1 /2 Kinase-Glo foram realizados tal como relatados por nosso estudo anterior [30]. A análise actividade VEGFR3 ter sido realizada utilizando o mesmo protocolo que se descreveu no ensaio de VEGFR1 /2. O perfil de inibição da quinase e actividade inibidora de FLT3-D835Y, CSF1R, e TRKA foram determinados pela Invitrogen SelectScreen® serviço quinase perfis (Carlsbad, Califórnia, EUA). Os ensaios de

A viabilidade celular e crescimento celular

a viabilidade celular foi avaliada com um ensaio de MTS como levado a cabo como o método descrito anteriormente [31]. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço, durante 16 horas e, em seguida, tratado com veículo ou várias concentrações do composto no meio. A mudança de células viáveis ​​foi quantificado usando o método de MTS (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante ou por contagem de células sob um microscópio. O

50 GC valor foi definida como a quantidade de composto que causou uma redução de 50% na viabilidade celular em comparação com o controlo tratado com DMSO (veículo) e foi calculada utilizando a versão de software Prism 4 (Graph-Pad Software, Inc., San Diego, CA, EUA). Os dados são apresentados como a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. O crescimento celular foi medido pelo método de exclusão do corante azul tripano. As células (1 × 10

4 mL

-1) foram cultivadas em placas de 12 poços durante 24 horas e, em seguida, tratado com diferentes quantidades de composto de ensaio e nos mesmos volumes de veículo, durante 72 horas. O número de células viáveis ​​foi contado por coloração com corante azul de tripano utilizando um hemocitómetro no ponto de tempo indicado após o tratamento medicamentoso. O resultado foi expresso como a média ± S.D. de determinações em triplicado.

Western blotting

As células foram lisadas em tampão de lise (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS, 1 mM de ortovanadato de sódio, PMSF 1 mM, e DTT 1 mM). Os lisados ​​de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas foram imunotransferidas com anticorpos apropriados e detectado utilizando o reagente SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, EUA), seguido por exposição a filme de raios-X.

Ensaio de Apoptose

O número de células apoptóticas foi determinada por células activadas por fluorescência (FACS) usando análises de coloração de anexina V-FITC. Em resumo, as células foram centrifugadas após tratamento com fármacos e novamente suspensas em 1 × tampão de ligação contendo 2,5 mM de cálcio (Ca2 +). As células foram incubadas com anexina V-FITC (BioLegend, San Diego, CA) e iodeto de propídio (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) no escuro à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, as amostras foram reconstituídas com 1 × tampão de ligação e submetidas a citometria de fluxo FACS Calibus (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) para analisar a população anexina V-positivos usando CellQuest Pro (BD Bioscience) e FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA).

A análise farmacocinética dos BPR1J-340

os usos de animais foram aprovados pelo o cuidado e uso Comitê Institucional dos Institutos Nacionais de pesquisa em Saúde. Resumidamente, ratos Sprague-Dawley machos, pesando 300-400 g cada foram obtidos a partir de BioLASCO, Taiwan Co., Ltd., Ilan, Taiwan. Um dia antes de dosagem, os ratos foram cirurgicamente preparado com uma cânula de veia jugular e jejuaram durante a noite (~18-20 hr). A água estava disponível

ad libitum

. A alimentação foi fornecida às 4 horas após a dosagem. Um único de 1,5 mg /kg dose intravenosa de BPR1J-340, como PEG 400 /água (80/20, v /v) solução, foi administrado em separado a grupos de 3 ratos cada um através da cânula jugular venosa. A 0 (antes da dosagem), 2, 5, 15 e 30 min. e 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h depois da dosagem, uma amostra de sangue foi recolhido. O plasma foi separado do sangue por centrifugação (14,000 g durante 15 min a 4 ° C numa centrífuga Beckman Modelo AllegraTM 6R) e armazenada num congelador (-20 ° C) até à análise. Todas as amostras de plasma foram analisados ​​por LC-MS /MS. dados de concentração de plasma foram analisadas com o método não compartimental para determinação da farmacocinética.

subcutaneamente experimentos de xenotransplante tumoral

ratinhos nu masculino (Nu-Fox1nu) de oito semanas de idade foram adquiridos a partir BioLasco (Ilan, Taiwan ). Os ratinhos nus (n = 5~7 por grupo) foram inoculados subcutaneamente com MOLM-13 (1 × 10

6 células /flanco). Todas as células de cancro humano foram determinadas como sendo livre de Mycoplasma spp antes da inoculação. Quando os tumores atingiram o tamanho 100~200 mm

3 e um tamanho grande de 500 milímetros

3, os animais foram agrupados e tratados com o BPR1J-340 (5 e 20 mg /kg, iv) ou do veículo quanto controlar uma vez por dia durante 5 dias por semana, durante duas ou três semanas. Os tamanhos dos tumores foram medidos e calculados com a fórmula de comprimento x largura

2/2 após o início dos tratamentos. O tamanho do tumor e peso corporal do animal foi medido duas vezes por semana após a inoculação das células tumorais. No final do estudo, os animais foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocação cervical. A diferença significativa entre o controlo tratado e veículo foram analisados ​​usando one-way

ANOVA

e

teste de Student-Newman-Keuls

. O nível de significância estatística foi fixado em

p

. 0,05

Resultados

In vitro quinase perfis de BPR1J-340

BPR1J-340 , um derivado de ureia-3-fenil-1

H

-5-pyrazolylamine base composto, foi concebido através da modificação química da série de derivados de sulfonamida (097 BPR1J-série) por uma relação estrutura-actividade (SAR) estudo (Fig. 1) [31], [32]. Para quinase triagem especificidade de inibição, BPR1J-340 foi testado contra 59 proteínas quinases que cobrem as principais quinases oncogênicas do kinome proteína humana. Este perfil de inibição da cinase revelaram que BPR1J-340 é um inibidor altamente selectivo e mais quinase de quinases testadas não foram significativamente inibidas na concentração de 100 nM (Tabela S1). Subsequentemente, as cinases mais potentes do rastreio 59 cinases foram ainda avaliados. Como mostrado na Tabela 1, BPR1J-340 potentemente inibida de tipo selvagem de FLT3 (IC

50 = 29 ± 5 nM, em comparação com ABT869 com um IC

50 de 38 ± 3 nM,), mutante de FLT3-D835Y (IC

50 = 19 nM), CSF1R (FMS) (IC

50 = 78 nM), KDR (VEGFR2) (IC

50 = 28 ± 9 nM), e FLT4 (FCEVR3) (IC

50 = 29 ± 7 nm). Além disso, BPR1J-340 inibiu TRKA, que está associado com o crescimento e a metástase de cancros da mama, com um IC

50 valor de 8 nM. Dada a elevada similaridade das bolsas de ligao de ATP de FLT3 e as Aurora cinases, a actividade inibitória para com Aurora A Aurora e B foram medidos. O IC

50 anos de BPRJ-340 foram determinados como sendo 1,040 nM e 1,344 nM para Aurora quinase e Aurora B quinase, respectivamente. Tomados em conjunto, BPRJ-340 é um inibidor da quinase seletivo com

in vitro

atividade contra FLT3, VEGFR2, VEGFR3 e TrkA do receptor tirosina-quinases

BPR1J-340.:

N

1-(3-4-[([(5-ethyl-3-isoxazolyl)amino]carbonylamino)methyl]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-[(4-methylpiperazino)methyl]benzamide. BPR1J-097:

N

1-(3-3-[(phenylsulfonyl)amino]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-(4-methylpiperazino)benzamide.

BPR1J-340 inibe a proliferação de FLT3-ITD

+ células

Após os efeitos inibidores do crescimento selectivos e potentes de BPR1J-340 foram demonstrados em FLT3-ITD-rolamento células leucémicas, a actividade inibidora de proliferação de células foi testada num painel de células leucêmicas e não-leucêmicas. BPR1J-340 inibiu a proliferação celular de FLT3-ITD

+ células (MOLM-13 e MV4; 11 linhas celulares dependentes de FLT3) com um GC

50 de cerca de 5 nM. As células que não eram dependentes de FLT3 de sinalização para o crescimento, incluindo RS4; 11, células leucémicas U937 e K562 [33], [34], [35], e as linhas de células não-leucémicas testadas foram quer fracamente inibida ou não foram inibidas por BPR1J-340 (Tabela 2). O crescimento independente da FLT3-RS4; linha de células que contém 11-FLT3 do tipo selvagem foi apenas fracamente inibida por BPR1J-340 com um GC

50 valor de 770 ± 360 nM. A sensibilidade em relação BPR1J-340 varia entre as células dependentes de FLT3 MOLM-13 /MV4; 11 e células independentes de FLT3 RS4; 11, sugerindo que a via de sinalização de FLT3 em FLT3-ITD células + é quase completamente perturbado por BPR1J-340. Além disso, nossos resultados sugerem que BPR1J-340 poderia inibir a atividade FLT-ITD pelo

in vitro

ensaios bioquímicos e celulares. No geral, BPR1J-340 é um inibidor potente e altamente seletivo para a proliferação de células-driven FLT3.

BPR1J-340 inibe FLT3-STAT5 sinalização

Para abordar se BPR1J-340 foi capaz de inibir a via de sinalização de FLT3 em células impulsionado-FLT3, MV4; 11 células foram tratadas com diferentes concentrações de BPR1J-340 durante 1 hora, e o estado de fosforilação de FLT3 e STAT5 (transdutor de sinal e activador da transcrição 5), uma crítica modulador a jusante que desempenha um papel importante na transdução de sinal de FLT3-ITD para expansão celular e sobrevivência, foi examinado por análise de Western blot. Como mostrado na Figura 2A, BPR1J-340 suprimiu a fosforilação de FLT3 e STAT5 de um modo dependente da dose com um IC

50 valor de aproximadamente 1 nM. Para investigar a diferença de sensibilidade entre FLT3-WT e os mutantes de activação FLT3-ITD e FLT3-D835Y para BPR1J-340, células HEK293T engenharia para expressar FLT3-WT ou mutantes FLT3 (FLT3-ITD, FLT3-D835Y) foram analisados ​​[31 ]. As células HEK293T-FLT3 foram tratados com BPR1J-340 a várias concentrações durante 1 h, e ligando FLT3 foi adicionado (50 ng /ml) durante 5 minutos para se preparar o ligado de células para a detecção de alterações na fosforilação de FLT3 por análise de Western. Tal como mostrado na Figura 2B, a fosforilação de toda a FLT3-WT, FLT3-ITD e FLT3-D835Y foi inibida pela BPR-1J340, com IC

50 valores de 10 a 100 nM. Em conjunto, estes dados demonstram que a BPR-1J340 inibe a fosforilação celular de FLT3 e modula a via de sinalização de FLT3, particularmente a via de FLT3-ITD

(A) MV4; 11. As células foram tratadas com BPR1J-340 nas concentrações indicadas por 1 hora. O estado de fosforilação de FLT3 e STAT5 foram avaliados por análise de Western blot. (B) culas 293T HEK foram transfectadas com FLT3-WT, FLT3-ITD-, ou plasmídeos expressando FLT3-D835Y-durante 24 horas e depois incubadas com várias concentrações de BPR1J-340 durante 1 hora. O estado de fosforilação de FLT3 em células transfectadas foi avaliada por análise de transferência de Western.

BPR1J-340 induz apoptose em FLT3-ITD expressando células

Como a inibição da sinalização de FLT3 resulta numa perda de potencial de crescimento e a indução de apoptose em células de FLT3-ITD expressando, foram investigados os efeitos de BPR1J-340 sobre a resposta apoptótica celular em FLT3-ITD

+ células. O MOLM-13 e MV4; 11 foram tratadas com células BPR1J-340 em diferentes concentrações durante 24 horas e analisadas quanto à indução de apoptose utilizando caspase-3 e PARP clivada activo (polimerase poli-ADP-ribose) análise. A capacidade de BPR1J-340 para induzir apoptose é evidente como se mostra na Figura 3, onde se observou a clivagem significativa da caspase-3 (caspase-3 activa) e PARP (PARP activa) em MOLM-13 e MV4; 11 células tratadas com BPR1J- 340 a 10 nM.

transferência de Western revelou que BPR1J-340 foi capaz de induzir a apoptose em FLT3-ITD-driven FLT3-ITD

+ células AML. MOLM-13 (A) e MV4; 11 (B) As células foram tratadas com BPR1J-340, nas concentrações indicadas, durante 24 horas, e os lisados ​​celulares foram então sujeitas a análise de transferência de Western utilizando anticorpos contra a caspase-3 e PARP (poli- polimerase de ADP-ribose). (Comprimento completo de caspase-3 (FL-caspase-3), a clivagem de caspase-3 (CL-caspase-3), poli comprimento completo (ADP-ribose) polimerase (FL-PARP), a clivagem de PARP (CL-PARP) ).

SAHA em combinação com BPR1J-340 aumenta a citotoxicidade contra FLT3-ITD

+ expressando células

Alguns inibidores da histona deacetilase (HDACi) vai aumentar a atividade citotóxica de FLT3 inibidor de FLT3-ITD

+ celular via degradação do FLT3-ITD e STAT5 [24], [26], [36], [37]. Para determinar se a SAHA, um HDACi, pode sinergizar com BPR1J-340 para aumentar a citotoxicidade em FLT3-ITD expressando células através da interferência com o eixo de FLT3-ITD e STAT5, foram examinados os efeitos combinados de SAHA e BPR1J-340 na citotoxicidade. A taxa de crescimento celular de MOLM-13 e MV4; 11 com SAHA e BPR1J-340 tratamento de combinações foi diminuída em comparação com o tratamento de um único medicamento (Fig 4A.). Em seguida, examinou-se o efeito do tratamento SAHA na apoptose induzida por BPR1J-340 em células de FLT3-ITD-expressam. único tratamento com SAHA (a 300 nm) durante 48 horas não aumentou a taxa de células apoptóticas na população de controlo de 10%, ao passo que a SAHA /BPR1J-340 co-tratamento resultou numa maior indução de apoptose (aumento de 20% em MOLM-13 e 12% em MV4; 11 células, respectivamente), em comparação com BPR1J-340 tratamento fármaco isoladamente (Figura 4B e Fig 4C)… Estes dados sugerem que a SAHA intensificar a apoptose induzida por BPR1J-340 em FLT3-ITD

+ células. Nós elucidado ainda mais os níveis de proteína de FLT3-ITD e STAT5 neste SAHA /BPR1J-340 co-tratamento melhorado citotoxicidade. Nós tratada células MOLM-13 com SAHA, BPR1J-340, ou sua combinação durante 20 horas. Comparado com o tratamento de fármaco único, a combinação de SAHA e BPR1J-340 diminuiu marcadamente os níveis de proteína de FLT3-ITD e STAT5 (Fig. 4D). Além disso, o tratamento BPR1J-340 /SAHA reduziu profundamente os níveis de proteína de Mcl-1 (células de leucemia mielóide-1, um membro anti-apoptótica da família Bcl-2) em FLT3-ITD

+ células (Fig. 4D). Estes resultados de redução de Mcl-1, podem explicar a citotoxicidade melhorada mesmo a fosforilação STAT5 em Tyr694 foi bloquear completamente por BPR1J-340 (Fig. 4D) Mcl-1 desempenha um papel essencial na resistência à quimioterapia em células AML [38]. Assim, a segmentação MCL-1 utilizando SAHA /BPR1J-340 pode ser uma estratégia promissora para superar a resistência aos medicamentos no LMA FLT3-ITD-positiva. Os nossos resultados sugerem que a redução nos níveis de proteína total de FLT3-ITD, STAT5 e Mcl-1 por SAHA disso proporciona um mecanismo possível para explicar a citotoxicidade aumentada com SAHA /BPR1J-340 co-administração

MOLM-13. ou MV4; 11 células foram semeadas a uma concentração inicial de 1 × 10

5 ml de células

-1 durante 24 horas e depois tratou-se com BPR-1J340 quer isoladamente ou em combinação com SAHA nas concentrações indicadas. As células viáveis ​​(A) foram contadas após coloração com corante azul de tripano em indicada ponto de tempo (B) Às 48 horas após o tratamento, as células foram coradas com anexina V marcada com FITC e iodeto de propídio e as percentagens de células apoptóticas foram analisadas por citometria de fluxo. (C) O fluxo representativo citometria de histogramas de ensaios de células apoptóticas anexina positivas às 48 horas de tratamento da toxicodependência (D) MOLM-13 As células foram tratadas com fármacos durante 20 horas, e, em seguida, seguidos por análise de Western blot para avaliar alterações nos níveis de proteína com o anticorpos indicados. A análise estatística foi realizada utilizando Estudante de

t

-teste. * Indica diferença significativa em relação ao veículo de controlo (* p 0,05, * * * p 0,01). Os dados apresentados são representativos de múltiplos experimentos independentes.

Os parâmetros farmacocinéticos de BPR1J-340

Para avaliar as propriedades farmacocinéticas do BPR1J-340, medimos a concentração plasmática de BPR1J-340 sobre um período de 24 h após uma única administração intravenosa (Fig. 5 e na Tabela 3). Após uma dose intravenosa de 1,5 mg /kg, administrada a ratos Sprague-Dawley, BPR1J-340 alcançaram uma concentração plasmática máxima de 7,9 ^ M (4,296 ng /ml) em 2 min após a administração. A concentração no plasma superior a 80 ng /mL durante 6 horas e manteve-se nos 9,9 ng /mL (C

24 horas, 18 nM), após 24 horas de dosagem. Por conseguinte, a concentração plasmática de BPR1J-340 atinge níveis suficientes para inibir a proliferação e induzir a apoptose de FLT3-ITD

+ células com base em experiências celulares. A clearance corporal total foi de 20,4 ± 5,2 mL /min /kg e o volume de distribuição em estado estacionário (Vss) foi de 10,3 ± 2,5 L /kg para BPR1J-340 em ratos. O plasma aparente semi-vida foi de aproximadamente 8,8 h.

Uma única dose de bolus intravenoso (1,5 mg /kg) de BPR1J-340 foi administrado a adultos machos Sprague-Dawley (n = 3). Os dados ilustram os valores médios (n = 3) ± D.P. das concentrações plasmáticas de BPR1J-340 em cada ponto temporal

actividade supressora do crescimento do tumor de BPR1J-340

FLT3-ITD

+ MV4;. 11 e MOLM- 13 xenoenxertos têm sido amplamente utilizados para avaliar o

in vivo

eficácia dos inibidores de FLT3 contra LMA [39], [40]. Nós e outros grupos encontraram a MV4; modelo de xenotransplante 11 é visivelmente mais sensível aos inibidores de FLT3 [30], [31], [39], [41]. Para avaliar a capacidade de BPR1J-340 para inibir o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de LMA, que, por conseguinte, seleccionado o modelo de xenoenxerto de tumor MOLM-13. BPR1J-340 foi administrado por via intravenosa (5 mg /kg QD) em 1-5 dias de cada semana durante 3 semanas; até o final deste período, os tumores MOLM-13 tinha atingido um volume médio de 200 mm

3. O tratamento através deste regime resultou na regressão completa do tumor em todos os animais por 22 dias; regressão completa (CR) ocorreu em 4 de 6 animais tratados no prazo de 31 dias de observação pós-tratamento (Fig. 6A). Neste estudo de eficácia, os ratinhos com tumores maiores (volume médio do tumor de 630 mm

3, n = 3) receberam uma única dose intravenosa de 20 mg /kg BPR1J-340 nos dias 1-5 de cada semana, durante 2 semanas, o que resultou em regressão completa do tumor e durável com tumores não palpáveis ​​detectados durante os 48 dias de acompanhamento (Fig. 6B). Não foi observada perda de peso corporal ou de mortalidade nos animais tratados com qualquer dose de BPR1J-340 (dados não apresentados). Estes resultados demonstram que BPR1J-340 reduz efectivamente o tamanho do tumor com doses intravenosas de 5 e 20 mg /kg /dia; BPR1J-340 é bem tolerada em ratinhos com estas doses eficazes.

BPR1J-340 (IV) é activo contra a leucemia aguda humana MOLM-13 tumores crescendo subcutaneamente e pode reduzir o tamanho de tumores, mesmo depois de os tumores estavam deixadas crescer até um tamanho de 630 milímetros

3. (A) O efeito anti-tumoral in vivo de BPR1J-340 no modelo de xenoenxerto de murganhos nus MOLM-13. O crescimento do xenoenxerto de tumor foi inibido por BPR1J-340 [5 mg /kg, i.v.]; p 0,05 comparado com o tratamento com veículo. (B) O crescimento de uma via subcutânea MOLM-13 do tumor de grande tamanho ( 630 mm

3) em ratinhos nus pode ser significativamente invertida pelos BPR1J-340 [20 mg /kg, iv]

Discussão

uma vez que a expressão anormal de FLT3 quinase, incluindo amplificado ou anormalmente ativados FLT3, é frequentemente observada nas células blásticas de pacientes com LMA, FLT3 representa um atraente alvo terapêutico de escolha para o desenvolvimento de drogas em AML. Até à data, vários inibidores de FLT3 potenciais foram desenvolvidos e examinados em pacientes AML, incluindo lestaurtinib (CEP701) e midostaurina (PKC412) na Fase III de ensaios clínicos e malato de sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), quizartinib (AC220), e crenolanib (CP-868,596) em ensaios de fase II. No entanto, FLT3 quinase a segmentação por mono-terapia com agentes experimentais atuais não produz benefícios terapêuticos em pacientes com LMA. Ele indicou que a activação aberrante de FLT3 e /ou FLT3 resistente aos medicamentos, incluindo mutantes resistentes aos medicamentos pré-existentes e adquiridas, raramente podiam ser totalmente inibida pelo tratamento com um único agente. Assim, existe uma necessidade para a identificação de inibidores mais eficazes de FLT3 e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, incluindo estratégias de combinação de drogas que têm como alvo não só FLT3 mas também moléculas relevantes para o percurso de sobrevivência FLT3 para substituir a resistência aos medicamentos actuais. Neste estudo, nós demonstramos a eficácia do novo inibidor FLT3 BPR1J-340 em vários

in vitro

e

in vivo

modelos de AML e identificar os efeitos sinérgicos com HDACi SAHA na citotoxicidade de FL3 células -ITD expressando em

in vitro

análises.

Anteriormente, identificamos H

-5-base-pyrazolylamine compostos de uma série de sulfonamida de 3-fenil-1

como inibidores potentes de FLT3, tais como BPR1J-097 [31]. Em continuidade aos nossos esforços para desenvolver inibidores de FLT3 potentes, pretendemos procurar outra série de inibidores que não só aumentou o

in vitro

efeito inibidor do crescimento em células de LMA, mas também prolonga a duração da acção

in vivo

. Através da concepção racional, descobrimos BPR1J-340, que é uma série de ureia 3-fenil-1

H

-5-pyrazolylamine baseado inibidor de FLT3, com eficazmente inibe a actividade de FLT3-ITD de FLT3-WT ou

in vitro

e

in vivo

. Porque múltiplas vias de sinalização influenciar o crescimento e o potencial metastático de células tumorais, muitos dos inibidores em desenvolvimento clínico são concebidos como inibidores multi-alvo que bloqueiam a um número limitado de quinases oncogénicas. Assim, o perfil de selectividade de quinase BPR1J-340 foi realizada para identificar alvos adicionais num painel de 59 cinases oncogénicas testados. Em ainda ensaio bioquímico, BPR1J-340, mostraram inibição potente (20-190 nM) contra as cinases angiogénicos VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 e, elementos que desempenham um papel importante no microambiente tumoral (Tabela 1). Além disso, BPR1J-340 fortemente inibida atividade TRKA com um IC

50 valor de 8 nM. Tomados em conjunto, BPRJ-340 é caracterizada como um inibidor selectivo multi-alvo com actividade de inibição potente contra FLT3-WT, FLT3-D835Y, VEGFR2, VEGFR3, e TRKA. Este perfil de inibição pode permitir BPRJ-340 para inibir o crescimento de tumores directamente através do bloqueio da via de sinalização de FLT3 aberrante e indirectamente pela segmentação angiogénese tumoral. BPR1J-340 também pode ter um potencial clínico no tumor impulsionado por receptores trkA expressos de forma anormal, que pode ocorrer no cérebro, da próstata, do pâncreas, e cancro da mama [42], [43], [44], [45].

BPR-1J340 inibiu a fosforilação celular de FLT3 e modulada a via de sinalização de FLT3, o que resultou na inibição da proliferação e indução de apoptose. BPR1J-340, mostraram inibição de crescimento potente, predominantemente em células dependentes de FLT3 (MOLM-13 e MV4; 11), mas não em células independente de FLT3. BPR1J-340 inibiu a proliferação de

células mutantes FLT3-ITD + com um GC

50 de 2-6 nM e inibiu a fosforilação de FLT3-ITD com um IC

50 de 10 nM; mesmo as células transfectadas com o mutante de FLT3-D835Y foram também inibidas por BPR1J-340 com um IC

50 de aproximadamente 100 nm. Consistente com estes resultados, BPR1J-340 eficazmente a apoptose induzida em FLT3-ITD

+ células.

inibidores de HDAC podem exibir uma actividade de inibição de crescimento contra células AML e melhorar significativamente a eficácia terapêutica de inibidores de FLT3 [24], [46]. Um estudo recente relatou que HDACi LBH589 mais um inibidor FLT3 tratamento combinado (PPKC412, AC220) poderia sinergicamente induzir a apoptose através de FLT3-ITD e STAT5 degradação [26]. É também demonstrado que activado de caspase-3 (CL-caspase 3) contribui para a degrdation de FLT3-ITD e STAT5 [26]. degradação de FLT3-ITD também foi relatado para HDACi secundária induzida por sobre-regulação de UBCH8 e sub-regulação de HSP90 [36], [47]. Mcl-1, uma proteína anti-apoptótica que promove a sobrevivência de FLT3-ITD

+ células através da activação STAT5, é regulada negativamente pela inibição de FLT3 [25]. A SAHA HDACi também induziu a sub-regulação de Mcl-1 [48]. Além disso, Mcl-1 de proteínas é um substrato directo clivagem de caspase-3 activada [49].