Sumário

Emerging evidência sugere que as células tumorais de iniciação (TICs) são a subpopulação de células mais malignas em tumores devido à sua resistência à quimioterapia ou tratamento com radiação. Segmentação TICs podem ser uma inovação chave para o tratamento do câncer. Neste estudo, verificou-se que os agonistas de PPARy inibiu o fenótipo de células-tronco, como o cancro e atenuou o crescimento do tumor de células de carcinoma hepatocelular humano (HCC). espécies reactivas de oxigénio (ROS) iniciadas por regulação positiva NOX2 foram parcialmente responsável pelos efeitos inibitórios mediados por agonistas PPAR. No entanto, PPAR produção de ROS mediada por agonista activado significativamente AKT, que por sua vez promoveu a sobrevivência TIC limitando a produção de ROS. A inibição de AKT, quer por inibidores de AKT farmacológicos ou ARNsi, aumentado significativamente PPARy inibição mediada pelo agonista da proliferação de células estaminais e as propriedades das células, nas células CHC. Importante, em ratinhos nus inoculados com células de carcinoma hepatocelular Huh7, que demonstrou um efeito inibidor sinergético da rosiglitazona agonista de PPARy e o inibidor de AKT triciribina no crescimento do tumor. Em conclusão, observou-se um ciclo de feedback negativo entre estresse oxidativo e AKT hiperativação em PPAR efeitos de supressão mediada por agonistas no HCC. aplicação combinatória de um inibidor AKT e um agonista PPAR pode fornecer uma nova estratégia para a inibição de propriedades semelhantes a células-tronco no HCC e tratamento de câncer de fígado

Citation:. Liu L, Yang Z, Xu Y, Li J , Xu D, Zhang L, et ai. (2013) Inibição do Estresse Oxidativo-suscitou AKT Activation Facilita PPAR Agonist-Mediated Inibição da Stem Character celular e crescimento do tumor de células de câncer de fígado. PLoS ONE 8 (8): e73038. doi: 10.1371 /journal.pone.0073038

editor: Yin Tintut, University of California, Los Angeles, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de abril de 2013; Aceito: 16 de julho de 2013; Publicação: 30 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Key Nacional chinês (2013ZX10002-011). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) classifica como o quinto câncer mais comum no mundo inteiro. No entanto, o HCC tem uma taxa elevada de quimioterapia-resistência e uma elevada incidência de recidivas e metástases após o tratamento cirúrgico, o que torna como a terceira causa principal de mortalidade por cancro [1], [2]. Vários estudos têm demonstrado que o HCC pode ter origem a partir de uma sub-população de células estaminais, como, chamados de células de iniciação do tumor (TIC) ou cancro de células estaminais, que são caracterizados pela expressão de marcadores específicos de superfície e de indicação de auto-renovação, a diferenciação, a iniciação do tumor , e a resistência aos medicamentos [3] – [10]. Embora o sorafenib droga foi recentemente aprovado para o tratamento de HCC, benefícios de sobrevivência limitado para pacientes com carcinoma hepatocelular de fase final e nenhuma forte eficácia na metástase de tumor têm sido mostrados [11], [12]. Portanto, as modalidades terapêuticas alternativas destinadas a eliminar ou limitar a subpopulação de TICs pode ser uma estratégia eficaz para o tratamento HCC.

O peroxissoma γ receptores activados pelo proliferador (PPAR) é um fator de transcrição dependente do ligando pertencente à hormona nuclear superfamília de receptores. Os agonistas para a activação de PPARy incluem ligandos lipofílicos endógenos, tais como 15-desoxi-Δ

12,14-prostaglandina J

2 (15d-PGJ

2) e de ácidos gordos, bem como a sintética tiazolidinedionas (uma classe de drogas anti-diabética), incluindo a rosiglitazona, troglitazona, ciglitazona, pioglitazona e englitazona [13]. activação pelo ligando deste factor de transcrição conduz à expressão de genes-alvo para controlar diversos processos fisiológicos essenciais, tais como o metabolismo, diferenciação celular, apoptose e inflamação dos tecidos [14]. agonistas de PPARy, também foram exibidas para deter a proliferação celular, induzir apoptose, diminuir a adesão celular e migração, e promover a diferenciação de células cancerosas de diferentes origens [15] – [22]. PPARy blocos carcinogénese e os potenciais invasivo e metastático de HCC [23], [24], indicando que o pedido de agonistas de PPAR pode ser uma perspectiva terapêutica para o tratamento da HCC. Curiosamente, os agonistas PPAR foram recentemente implicados na condução diferenciação ET-743-mediada de lipossarcoma mixóide rodada celular [15] e a inibição de TICs no cancro do cérebro [25].

Neste estudo, nós mostramos que o PPAR agonistas (15d-PGJ

2 ou rosiglitazona) propriedades efetivamente inibidos-tronco semelhantes a células em células cancerígenas do fígado, e que NADPH oxidase-2 (NOX2) induzida por espécies reactivas de oxigénio (ROS) geração funcionou como um evento a jusante chave. Como resposta feedback negativo, aumento de ROS provocou hiperativação do AKT, que contrariado significativamente a inibição PPAR agonista mediada de propriedades semelhantes a células-tronco em células do CHC.

In vivo

experimentos mostraram, ainda, que o rompimento do ciclo de feedback negativo pela triciribina inibidor AKT facilitou significativamente a inibição PPAR agonista rosiglitazona mediada do crescimento do tumor. Estes resultados sugerem que a combinação de um inibidor de AKT e um agonista PPAR pode fornecer um potencial tratamento promissor para câncer de fígado.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos animal experimental protocolos foram aprovados pela Comissão médica Experimental animal Care of Shanghai Cancer Institute (Aprovação ID. ShCI-11-020).

Cultura celular

linhas celulares SK-HEP1 e Hep3B foram obtidos a partir americana Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). linha de células Huh7 foi do Riken Cell Bank (Tsukuba Science City, Japão). SMMC 7721 linha celular foi fornecida pelo Departamento de Patologia da Segunda Universidade Médica Militar (Xangai, China) [26]. Todas as linhas celulares foram cultivadas em DMEM com alto teor de glucose (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (GIBCO) e penicilina /estreptomicina (1% [v /v]; GIBCO) a 37 ° C numa atmosfera humidificada 5% de CO

2 atmosfera. Depois as células foram inicialmente crescidas, múltiplas alíquotas foram criopreservadas e todas as linhas de células foram usadas dentro de 6 meses após a reanimação.

Para as experiências de tratamento, as células foram plaqueadas e crescidas durante a noite, o meio foi então substituído com DMEM-elevado teor de glucose meio contendo soro fetal bovino a 1%, e incubadas com PGJ-15d

2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rosiglitazona (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), N-acetylatedcysteine ​​(NAC) (Calbiochem, Darmstadt, Alemanha), triciribina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), e /ou LY294002 (Sigma-Aldrich), durante os tempos indicados. Todas as experiências foram realizadas três vezes.

de células activadas por fluorescência (FACS)

Após a incubação sob condições de cultura indicados, as células foram dissociadas e lavou-se duas vezes com PBS contendo BSA a 0,5% a 4 ° C. PE-conjugado anticorpo CD133 anti-humano (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) foi adicionado para incubação a 4 ° C durante 30 minutos. A citometria de fluxo foi realizada no fluxo FACSCalibur citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA). anticorpo /κ IgG1 de rato conjugado com ficoeritrina serviu como um controlo do isotipo. As células mortas foram excluídas por coloração com 7-AAD (Sigma-Aldrich) antes da análise. Para separação de células, CD133

+ ou GFP

+ células foram rigorosamente fechado e isolado usando um MoFlo XDP (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Viabilidade Celular Ensaio

celular a viabilidade foi determinada por 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5- brometo (MTT) (Sigma-Aldrich) método 2H-tetrazólio-difenil. Em resumo, um total de 1000 células /poço foram semeadas em placas de 96 poços num volume final de 200 ul. Após incubação com PGJ-15d

2 durante os tempos indicados, solução de MTT de 20 ul (5 mg /ml em PBS) foi adicionado ao meio e cultivou-se durante 3 horas adicionais. Em seguida, a solução de MTT foi descartado e 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich) foi adicionado em cada poço. A absorvência de cada poço foi medido a um comprimento de onda de 540 nm.

Ensaio de Apoptose

A extensão da apoptose foi avaliada por Pharmingen ™ FITC anexina V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) de acordo com a instruções fornecidas pelo fabricante. Então, a análise de separação de células activada por fluorescência foi realizada sobre o fluxo FACSCalibur citómetro (BD Biosciences). Um único usando coloração de anexina V-FITC e 7-AAD foi realizada sozinha como controlos.

BrdU Ensaio

Pharmingen ™ APC BrdU Fluxo Kit (BD Biosciences) foi usado para um ensaio de incorporação Bromodeoxiuridina (BrdU) de acordo com as instruções do fabricante.

Extração de RNA e PCR em tempo real

o ARN total foi isolado a partir de células com o Reagente RNAiso (Takara, Dalian, China). A transcrição reversa (RT) foi realizada utilizando 500 ng de ARN total para a síntese de cDNA num volume de reacção de 10 ul, utilizando o kit de reagente PrimeScript ™ RT (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Usando Premix Ex Taq ™ (Takara), PCR quantitativa foi realizada para

Nanog

,

OCT4

, e

AFP News. Para a detecção de

Notch1

,

SMO

,

NOX2, Nox4, P22

phox, P47

phox, P67

phox

e

expressão Rac

, quantitativa PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR verde mistura da Takara num tempo real do sistema de PCR 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

GAPDH

foi usado como um controlo interno. Os primers estão listadas na Tabela S1.

pequeno RNA de interferência (siRNA) transfecção

O siRNAs específicos para

NOX2

,

PPAR

,

AKT1

e

AKT2

foram adquiridos da Sigma-Aldrich. As sequências de siRNA estão listados na Tabela S2. Um dia antes da transfecção, as células foram semeadas em placas de seis poços sem antibióticos. Os ARNsi (60 nM) foram usados ​​para transfectar células com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carisbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Western blotting

As células foram lisadas num tampão de lise RIPA ( Beyotime, Nantong, China) contendo Protease Inhibitor Cocktail e PhosSTOP fosfatase Inhibitor (Roche, Monza, IT). As proteínas foram analisadas utilizando os anticorpos indicados: anti-CD133, anti- PPARy, anti-AKT, anti-fosfo-AKT (Ser473) (todos da Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-GAPDH, anti-α-tubulina (todos da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); e anti-NOX2 (Abcam, Cambridge, UK). O sistema ChemiDoc XRS ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) foi utilizado para obter imagens.

esferoidal-formando Ensaio

células individuais foram semeadas em placas ultra-baixas cultura de fixação (Costar , Coring, Nova Iorque) com uma densidade de 500 células /ml num soro isento de DMEM 01:01: F12 (GIBCO), suplementado com B27 (01:50; GIBCO), 20 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (EGF) e 20 factor de ng /mL de crescimento fibroblástico básico (bFGF) (R D Systems, Minneapolis, MN). Todas as culturas foram incubadas durante 7 dias e foram realizadas contagens de esferóides.

Medição de ROS Acumulação

A sonda fluorescente sensível à oxidação Dihydroethidium (DHE) (Invitrogen) foi utilizado para analisar o nível intracelular de ROS. As células foram lavadas com PBS e incubadas com 5 pM de DHE, durante 30 minutos num banho a 37 ° C incubadora. A fluorescência foi medida por um citómetro de fluxo FACSCalibur.

In vivo

Experimentos

camundongos BALB /c nu masculino, 6 semanas de idade, foram alojados em condições livres de patógenos e todas as experiências envolvendo ratos foram realizados de acordo com o Comitê Institucional animal Cuidado e Uso de Xangai e do Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para Cuidado e Uso de Animais de laboratório.

Huh7 células com expressão GFP (2 × 10

6) foram suspensos em 100 ul de PBS e inoculou-se por via subcutânea (sc) no flanco direito de ratinhos nus do sexo masculino. Os modelos subcutâneos foram administradas drogas começando no dia 4 após a injecção de células tumorais. Rosiglitazona (GlaxoSmithKline, margoso le Roi, França) foi misturada com água estéril, a uma concentração de 4 mg /ml. Triciribina (Santa Cruz Biotechnology) foi dissolvida em PBS, a uma concentração de 200 ug /ml. Para um único tratamento, os ratinhos subcutâneos foram aleatorizados para o grupo de veículo e o tratamento com rosiglitazona (n = 7 por grupo). Rosiglitazona (100 mg /kg) foi administrado diariamente por via intragástrica (IG) durante 12 dias. Para o tratamento combinado, os ratinhos subcutâneos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos experimentais (n = 5 por grupo). Os 4 grupos experimentais foram como se segue: grupo de controlo não tratado, grupo de tratamento com rosiglitazona (100 mg /kg /dia, administrada no dia 6, 7, 10, 11 por Ig), grupo de tratamento triciribina [1 mg /kg /dia, administrada em dias 4, 5, 8, 9, 12, 13, por via intraperitoneal (IP)], e o grupo de tratamento combinado triciribina-rosiglitazona (administrada usando o mesmo esquema para cada fármaco, tal como descrito para o único tratamento). Todos os ratinhos de controlo foram administrados com um volume igual de veículo por sonda gástrica ou de injecção, respectivamente. O tamanho do tumor, medido individualmente diariamente com microcalipers após o tratamento, foi calculada de acordo com a fórmula:

V =

(

w

1 ×

w

2 ×

w

2) /2, em que

w

1 é o comprimento e

w

2 é a largura do tumor. Todos os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical no dia após o último tratamento. As massas tumorais foram cirurgicamente excisadas, pesadas grosseiramente, e dissociado em células individuais, tal como anteriormente descrito [27]. As células foram então coradas com anticorpos CD133 anti-humano conjugado com PE (Miltenyi Biotec) para a determinação da expressão CD133 em GFP

+ células tumorais, ou GFP

+ células tumorais isoladas por fluxo de triagem foram usadas para avaliar a capacidade esferóide-formando .

análise estatística

a análise estatística foi realizada com o software Graphpad Prism. As diferenças estatísticas entre dois grupos foram determinados utilizando

t

teste do aluno. O critério de significância estatística foi

valor P

inferior a 0,05.

Resultados

PPAR agonistas inibem a Stem Cell-like Propriedades e Crescimento Tumor de Células HCC

o primeiro testado se os agonistas PPARy inibiu a proliferação celular nas células CHC. Consistente com as observações anteriores de que os agonistas de PPARy geralmente inibem a proliferação de células tumorais, verificou-se que o tratamento com 15d-PGJ

2, um ligando endógeno natural do PPARy, proliferação celular significativamente inibida em todos examinados linhas celulares de carcinoma hepatocelular (Figura 1A). Examinamos ainda mais a expressão de genes relacionados com a stemness em quatro linhas de células de carcinoma hepatocelular, Huh7, SK-HEP1, SMMC 7721, e células Hep3B, com ou sem 15d-PGJ

2 tratamento. Como mostrado na Figura S1A, um número de genes relacionados com a stemness, incluindo

Nanog

,

Notch1

,

OCT4

, e

SMO

, mostrou um tendência para a regulação negativa em todos os sub

2-células tratadas 15d-PGJ, indicando que os agonistas de PPAR pode ter um efeito sobre o HCC tiques. Estudos anteriores demonstraram que a CD133

+ subpopulação de células Huh7 representa um grupo de células que contêm tiques e é essencial para a condução do crescimento do tumor [28], [29]. Nós, portanto, analisados ​​expressão CD133, a capacidade esferóide-se formando, e

in vivo

tumorigenicidade de células Huh7 após o tratamento com agonistas de PPAR. Encontrámos um ligeiro aumento da apoptose de células Huh7 por tratamento com PGJ-15d

2 durante 48 horas (Figura S1B). Curiosamente, após o uso de coloração 7-AAD para excluir as células mortas, observou-se uma diminuição acentuada na porcentagem de CD133

+ células em 15d-PGJ

células 2-tratados (Figura 1B). A diminuição da expressão da proteína CD133 de 15d-PGJ

células Huh7 2-tratados foi ainda confirmada por análise de transferência de Western (Figura 1C). Também examinamos as células tratadas com agonistas PPAR para incorporação de BrdU e coloração CD133, e descobrimos que a percentagem de marcado com BrdU CD133

+ células diminuiu significativamente após o tratamento com 15d-PGJ

2. Além disso, na subpopulação negativa para a coloração BrdU, uma diminuição drástica na expressão de CD133 foi também observado (Figura 1D). Além disso, o tratamento com 1 ug /ml de 15d-PGJ

2 esferóides números significativamente reduzidos de células Huh7 (Figura 1E).

A, Huh7, SK-HEP1, células SMMC 7721 e Hep3B foram tratados com 0,5? g /ml de 15d-PGJ

2 durante os tempos indicados. A proliferação celular foi avaliada por um ensaio MTT. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01, contra as células controle. B, células Huh7 foram tratados com 0,5 ug /ml de 15d-PGJ

2 durante os tempos indicados e coradas com CD133-PE. Antes da análise, 7-AAD foi usada para excluir as células mortas. perfis de FACS representativos são mostrados (painel da esquerda). Percentagens de CD133

+ células são apresentados como os meios ± S.E.M (n = 3) (painel direito). *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01. C, as células Huh7 foram tratados com 0,5 ug /ml de 15d-PGJ

2 durante 24 horas e a proteína total foi extraído para análise de expressão de CD133. Todas as amostras foram normalizadas para expressão de GAPDH. D, células Huh7 foram tratados com 0,5 ug /ml de 15d-PGJ

2 durante 24 horas. As células foram colhidas por incorporação de BrdU e coloração CD133. quantitativas gráficos de barras são apresentados como as médias ± S.E.M (n = 3). *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001, células controle versus. E, células Huh7 foram cultivadas em meio de esferóide contendo formando-15d-PGJ

2 (1 ug /ml) durante 7 dias. Representativos imagens microscópicas são mostradas (painel da esquerda). Barra de escala = 100 pm. quantitativas gráficos de barras são apresentados como a média ± S.E.M. (N = 3) (painel da direita). *,

P

. 0,05

Para substanciar as nossas observações com

in vivo

experimentos, nós tratados ratinhos portadores de GFP

+ Huh7 tumores com uma agonista PPAR. Uma vez que a actividade biológica de 15d-PGJ

2 é geralmente limitado

In vivo

[30], [31], a rosiglitazona, um agonista de PPARy sintético, foi utilizado em

In vivo

experiências a uma dose de 100 mg /kg dia /(o esquema de tratamento mostrado na Figura 2A). Observou-se um efeito anti-tumor de crescimento rosiglitazona (Figura 2B). O crescimento tumoral foi inibido em aproximadamente 60% (

P

0,001). Foram avaliados ainda mais o potencial de formação de esferóides de células tumorais derivadas de controle e camundongos tratados com rosiglitazona. Notavelmente, células tumorais

+ GFP isoladas a partir de tumores primários de ratinhos tratados com rosiglitazona formado esferas menores e menos do que aqueles do grupo de controlo (Figura 2C). A administração de 100 mg /kg /dia rosiglitazona também diminuiu significativamente a proporção de GFP

+ CD133

+ células tumorais (Figura 2D). Estes resultados sugerem um efeito inibitório proeminente do agonista PPAR no crescimento do tumor e haste propriedades semelhantes a células de células HCC Huh7

in vivo

.

GFP

+ células Huh7 (2 × 10

6) foram sc inoculadas em pequenos ratos nús. Após 4 dias, os ratinhos com tumores foram tratados diariamente com o veículo ou rosiglitazona (100 mg /kg /dia) por ig por 12 dias (n = 7 por grupo). A, contorno esquemático da configuração experimental. B, as imagens originais de tumores de xenoenxerto são mostradas (painel da esquerda). O peso do tumor foi medido no fim do tratamento (painel da direita). Cada ponto representa o peso de um tumor xenoenxerto indivíduo. As barras horizontais representam a média ± DP (n = 7). ***,

P Art 0,001. C, tecidos tumorais de controlo e os grupos tratados foram enzimaticamente dissociada em suspensões de célula única e GFP

+ células tumorais foram colhidas por triagem de fluxo e cultivadas em meio de formação de esferóides, durante 7 dias. Uma fotografia representativa é mostrada (painel da esquerda). Barra de escala = 100 pm. Um gráfico barra de resumo (média ± SD) é mostrado no painel da direita. *,

P Art 0,05. D, as células tumorais individuais dissociadas a partir de cada ratinho foram coradas com CD133-PE. A percentagem de GFP

+ CD133

+ células foi determinada por citometria de fluxo. fluxo representativas perfis de citometria de análise são mostrados (painel da esquerda). A proporção de CD133

+ células em GFP

+ células tumorais é apresentados como a média ± DP (painel da direita). ***,

P

. 0,001

PPAR agonistas Cancer Inibição Caule fenótipos celulares-like via dependente de NOX2 ROS Geração

Tem sido relatado que agonistas PPARy induzir a produção de ROS em vários tipos de células cancerosas, [33] [32]. Uma vez que a regulação da diferenciação celular tem sido observada como sendo uma função crítica de ROS [34], [35], foi investigada a possibilidade de que a produção de ROS contribuiu para o PPARy repressão induzida por agonista de propriedades semelhantes a células estaminais em células de carcinoma hepatocelular. Nós primeiro testou níveis de ROS em células de carcinoma hepatocelular após a exposição ao 15d-PGJ

2. Os resultados mostraram que os níveis de ROS intracelular foram drasticamente aumentada em células Huh7 ambos e SK-HEP1 após o tratamento com 15-D-PGJ

2 durante 72 horas (Figura S2a). Nós ainda isolado CD133

+ subpopulações de células Huh7 por separação por FACS e cultivaram-na presença ou ausência de 15d-PGJ

2 e o NAC antioxidante, um precursor de glutationa intracelular que inibe a produção de ROS. Após 3 dias em cultura, a percentagem de CD133

+ células nas células de controlo foi reduzido para 74,84%, ao passo 15d-PGJ

2 tratamento causou reduções significativamente maiores na proporção de CD133

+ células numa dependente da dose de modo (Figura 3A). Surpreendentemente, a frequência de CD133

+ células foi reduzido para 20,39% quando a concentração de 15d-PGJ

2 foi de 1,0 ug /ml. No entanto, o tratamento com NAC robustamente atenuada esta inibição

2-mediada 15d-e PGJ preservada a CD133

+ compartimento (Figura 3A). Consistente com esta observação, o efeito inibitório de 15d-PGJ

2 na formação esferóide foi dramaticamente reduzida quando as células Huh7 foram pré-tratados com NAC (Figura S2B). Além disso, NAC também atenuou a diminuição da expressão de genes stemness-relacionados, tanto em células SK-HEP1 (Figura S2C) Huh7 e. Estas observações sugerem que os agonistas PPAR inibiu os fenótipos semelhantes a células-tronco cancerosas através da regulação positiva da produção ROS. Além disso, a depleção de PPARy por siARN teve apenas efeitos subtis na geração de ROS induzidos por 15d-PGJ

2 (Figura S3), indicando que o tratamento resulta na indução de PPARy ROS principalmente através de uma via independente de PPARy.

a, Isolado CD133

+ Huh7 células foram tratadas com 15d-PGJ

2 (0,5, 0,75 ou 1,0 ug /ml) e NAC (10 mM) por si só ou em combinação, e a percentagem de CD133

+ foi detectada por citometria de fluxo após 72 horas. B, células Huh7 foram tratados com 0,5 ug /ml de 15d-PGJ

2 durante os tempos indicados. A expressão de ARNm de genes de NADPH-oxidase (

NOX2

e

Nox4

) foi medido por RT-PCR quantitativo. Os dados são médias ± S.E.M. (N = 3). ***,

P Art 0,001. C, as células Huh7 foram tratados com 0,5 ug /ml de 15d-PGJ

2 durante 24 horas. A expressão

P22

phox, P47

phox, P67

phox

e

Rac

mRNA foi determinada por RT-PCR quantitativo. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01. D, Huh7 e SK-HEP1 células foram tratadas com 0,5 ng /ml-15d PGJ

2 durante os tempos indicados e a proteína total foi extraído para análise de expressão NOX2. E, células Huh7 foram transitoriamente transfectadas com ARNsi de controlo negativo ou NOX2 siRNA-3, após o que as células foram semeadas em placas ultra-baixas cultura de fixação e cultivadas em meio de esferóide contendo formando-15d-PGJ

2 durante 7 dias. Número de esferóides formadas é apresentado como médias ± S.E.M. (N = 3). *,

P Art 0,05. células F, Huh7 foram transitoriamente transfectadas com ARNsi de controlo negativo ou NOX2 siRNA-1. As células foram tratadas com 0,5 ng /ml-15d PGJ

2 durante 72 horas e corados com CD133-PE. Os dados são médias ± S.E.M. (N = 3). *,

P Art 0,05; **,

P

. 0,01

A família NADPH oxidase (NOX) de proteínas é responsável pela produção de ROS [36]. Para determinar se oxidases NADPH está regulada e contributable para o aumento da geração de ROS pela estimulação dos agonistas PPAR, analisamos a abundância de vários

NOX

mRNAs, incluindo

NOX2

e

Nox4

, em células tratadas com PGJ-15d

2. A expressão de

NOX2

e

Nox4

foram prontamente regulada, a partir de aproximadamente 3 horas após o tratamento com 15d-PGJ

2 (Figura 3B). Além disso, verificou-se que a transfecção de siRNAs específico para

Nox4

não prejudicou 15d-PGJ geração de ROS

2-induzida (dados não apresentados), enquanto que os níveis de mARN de vários componentes Nox2 principais, tais como o

P22

,

P47

,

P67 Comprar e

Rac

, foram significativamente aumentados em 15d-PGJ

2 tratados com células Huh7 (Figura 3C) . Além disso, o nível de proteína de NOX2 foi notavelmente elevada em ambas as células Huh7 e SK-HEP1 por tratamento com PGJ-15d

2 (Figura 3D). Nós empobrecido expressão adicional NOX2 com siRNAs específicos em ambas as células Huh7 e SK-HEP1, e descobriram que as células empobrecido-Nox2 exibiram uma indução fraca de ROS em resposta a 15d-PGJ

2 tratamento, em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo (Figura S4A). A eficiência de

Nox2

siRNAs na inibição da expressão NOX2 foi validado por transferência de Western e análise de RT-PCR quantitativo (figura S4B e C). De facto, downregulation de NOX2 contrariado significativamente 15d-PGJ

inibição da formação esferóide e tamanho da piscina do CD133 2 mediada

+ subconjunto em células Huh7 (Figura 3E e F). Juntos, estes resultados indicam que a regulação positiva de NOX2 foi responsável por PPAR inibição mediada pelo agonista de propriedades semelhantes a células-tronco em células do CHC.

regulação recíproca de ROS Geração e AKT de ativação em células HCC tratados com agonistas PPAR

em seguida, exploramos possíveis alterações nas vias de sinalização que regulam os efeitos mediados pelos agonistas PPAR. Curiosamente, verificou-se que tanto 15d-PGJ

2 e rosiglitazona aumentada dramaticamente a fosforilação de AKT, e esta activação induzida por agonista de PPARy de AKT foi atenuada por NAC em células Huh7 (Figura 4A). Um fenómeno semelhante ocorreu também em células SK-HEP1 (dados não mostrados). Estes dados indicam que a induzida por agonista de PPARy ROS provocou hiperactivação AKT. Para examinar a potencial relação entre a activação AKT e produção ROS, foi utilizado o triciribina inibidor AKT ea LY294002 inibidor PI3K para reprimir a atividade AKT, e descobrimos que uma dose ou a repressão dependente do tempo da fosforilação de AKT foi acompanhada por uma mudança incremental gradual na expressão NOX2 (Figura 4B e C). Além disso, o tratamento combinatória de células Huh7 com ambos 15d-PGJ

2 e triciribina levou a um nível mais elevado de ROS intracelulares do que qualquer dos tratamentos sozinhos (Figura 4D). Este efeito sinérgico foi também observada em células co-tratadas com PGJ-15d

2 e LY294002 (Figura 4E). Nós confirmamos ainda mais as nossas observações usando siRNAs específicos contra AKT1 e AKT2. O ARNsi contra AKT1 aumentou ainda mais a indução ROS na presença de 15d-PGJ

2 (Figura 4F). A eficiência de AKT1 e AKT2 siRNAs na inibição da expressão total e fosforilada AKT foi validado por análise de transferência de Western (Figura 4F). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a geração de ROS mediada por NOX2 PPARg induzida por agonista de activação AKT modulada através de feedback negativo.

A, células Huh7 foram pré-tratados com NAC (10 mM) durante 30 min seguido por 15d-PGJ

2 (0,5 ug /ml) para a adicional indicado vezes (painel de cima). células Huh7 foram tratados com rosiglitazona (5, 20 ou 50? M) e NAC (10 mM) por si só ou em combinação, durante 6 horas (painel inferior). A proteína total foi extraído para análise de P-Akt, Akt, e a expressão de GAPDH. B, células Huh7 foram tratadas com o inibidor de AKT triciribina durante 3 horas e a proteína total foi extraído para análise de NOX2, P-Akt, Akt, e a expressão de GAPDH. C, as células Huh7 foram tratados com LY294002 (10 uM) durante os tempos indicados, e o nível de proteína de NOX2 foi examinada por análise de transferência de Western. D, células Huh7 foram tratados com 15-D-PGJ

2 e triciribina, quer isoladamente ou em combinação, durante 48 horas, após o que foram marcadas com DHE e analisadas por citometria de fluxo. Os dados são médias ± S.E.M. (N = 3). *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01. E, células Huh7 foram tratados com 15-D-PGJ

2 e LY294002, quer isoladamente ou em combinação, durante 72 horas, após o que foram marcadas com DHE e analisadas por citometria de fluxo. Os dados são médias ± S.E.M. (N = 3). *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01. células F, Huh7 foram transitoriamente transfectadas com ARNsi AKT1 e AKT2 ARNip quer isoladamente ou em combinação, após o que as células foram tratadas com 0,5 ng /ml-15d PGJ

2 durante mais 3 horas (painel da esquerda). Os níveis de proteínas AKT P-AKT e foram medidos por análise de transferência de Western. células Huh7 foram transitoriamente transfectadas com ARNsi de controlo negativo ou AKT1 siRNA, após o que as células foram tratadas com 0,5 ng /ml-15d PGJ

2 durante mais 72 horas (painel da direita). produção intracelular de ROS foi analisada por citometria de fluxo (médias ± S.E.M, n = 3). *,

P

. 0,05

O AKT Inhibitor triciribina Coopera com PPAR agonistas para inibir Cancer Stem fenótipos celulares semelhantes e

Tumor Crescimento

Os resultados acima mencionados levou-nos a especular que o tratamento combinado de um agonista de PPARy e um inibidor de AKT pode inibir o crescimento do tumor de forma mais eficiente do que qualquer dos reagentes sozinho. Em primeiro lugar, avaliaram se triciribina aumentou a sensibilidade de células de carcinoma hepatocelular para PPARy apoptose induzida por agonista. De facto, em ambas as células Huh7 e SK-HEP1, a combinação de triciribina com PGJ-15d

2 ou rosiglitazona marcadamente aumentada a indução de apoptose em comparação com quer sozinha (Figura 5A). Curiosamente, descobrimos que o tratamento combinado de células Huh7 com tanto 15d-PGJ

2 e triciribina não causou uma redução ainda maior na proporção de CD133

+ células comparado com o tratamento de 15d-PGJ

2 sozinho. No entanto, o tratamento de combinação foi mais eficaz na inibição da proliferação celular em células Huh7 comparado com o tratamento de qualquer dos agentes individuais isoladamente (Figura 5B), indicando que o tratamento de combinação reduziu ainda mais o número absoluto de CD133

+ Huh7 células. Nas células tratadas com ambos 15d-PGJ

2 e triciribina, verificou-se que o número de CD133

+ células foi reduzido em 70.9%, que foi superior à de 46,1% em 15d-PGJ

2- células tratadas (Figura 5c). Da mesma forma, o número de CD133

+ células foi reduzida em 89,6% com o tratamento com rosiglitazona e combinação de triciribina, superior à de 37,5% com o tratamento com rosiglitazona sozinho (Figura 5C). Além disso, o tratamento de combinação suprimiu a formação de esferóides de células Huh7 substancialmente mais do que qualquer 15d-PGJ

2 ou inibidor de AKT sozinha (Figura 5D). Estes dados indicam que a inibição de AKT por triciribina pode ter exacerbado os efeitos inibidores de agonistas de PPARy sobre a população de CD133

+ células através da indução de morte celular directamente.

A, as células Huh7 e SK-HEP1 foram tratados com 15d-PGJ

2, rosiglitazona e triciribina, quer isoladamente ou em combinação. A percentagem de células apoptóticas foi avaliada 48 horas mais tarde por coloração com anexina V-FITC /7-AAD. Os dados são médias ± S.E.M. (N = 3). *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; ***,

P Art 0,001. (N = 3). (N = 3). *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01. *,

P Art 0,05. Os dados são média ± DP. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01. (N = 3). *,

P Art 0,05; *,

P Art 0,05; *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01.