Abstract

A quimioterapia constitui a modalidade de tratamento padrão para a cabeça localizada e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP). No entanto, muitos pacientes não conseguem responder e recaída após esta tratamentos devido à aquisição de quimio-resistência. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas drogas que poderiam reverter o fenótipo de resistência. A curcumina, o constituinte da especiaria cúrcuma Foi demonstrado que têm propriedades anti-inflamatórias, anti-oxidantes e propriedades anti-proliferativas em vários tipos de tumores. No entanto, o uso de curcumina tem sido limitada devido à sua fraca bio-absorção. Recentemente, uma nova classe de análogos de curcumina, com base em diarylidenylpiperidones (DAP), foi desenvolvida através da incorporação de uma ligação piperidona com a estrutura de beta-dicetona e substituições de flúor em que os grupos fenilo. Neste estudo, foi avaliada a eficácia da H-4073, uma variante parafluorinated de DAP, usando as duas

in vitro Comprar e

In vivo

de cabeça e pescoço modelos de cancro. Os nossos resultados demonstram que a H-4073 é um agente anti-tumoral potente que inibiu a proliferação das células de forma significativa em todas as linhas de células de carcinoma epidermóide testadas de uma forma dependente da dose. Além disso, o pré-tratamento de linhas de células de carcinoma epidermóide resistentes à cisplatina com H-4073 inverteu significativamente o quimio-resistência como observada por ensaio de viabilidade das células (MTT), ensaio de apoptose (anexina V de ligação) e caspase-3 (Western blot). H-4073 mediada seus efeitos anti-tumorais pela inibição de JAK /STAT3, FAK, Akt e VEGF vias de sinalização que desempenham papéis importantes na proliferação celular, migração, sobrevivência e angiogénese. No modelo de xenoenxerto de ratinho SCID, H-4073 aumentou significativamente os efeitos anti-tumorais e anti-angiogénese de cisplatina, sem toxicidade sistémica adicionado. Curiosamente, H-4073 inibiu a angiogénese do tumor, bloqueando a produção de VEGF pelas células tumorais, bem como inibindo directamente a função das células endoteliais. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que o H-4073 é um agente anti-tumoral potente e pode ser usado para superar a resistência à quimioterapia em HNSCC

Citação:. Kumar B, Yadav A, Hideg K, Kuppusamy P, Teknos TN, Kumar P (2014) a Novel curcumina Analog (H-4073) aumenta a eficácia terapêutica da cisplatina tratamento em Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 9 (3): e93208. doi: 10.1371 /journal.pone.0093208

editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de novembro de 2013; Aceito: 28 de fevereiro de 2014; Publicação: 27 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kumar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH /NCI-CA133250, P. Kumar), Fundo de Investigação Grant de Joan (BK P. Kumar), doação de sementes terapêuticas experimentais da Ohio State University Comprehensive Cancer Center (P. Kumar) , Arthur G. James Cancer Hospital e Instituto de Richard J. Solove Research (TT, P. Kumar). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é um dos o câncer mais prevalente em todo o mundo, com mais de 600.000 casos são diagnosticados a cada ano [1]. uso de tabaco e consumo de álcool têm sido conhecidos por serem os fatores de risco mais fortes para o desenvolvimento desta doença [2]. No entanto, está agora a ser reconhecido que o papilomavírus humano (HPV) pode também desempenhar um papel no desenvolvimento de um subconjunto de cancros da cabeça e pescoço [3]. A maior parte da HNSCC são diagnosticados em estágios avançados e os resultados destes pacientes é muitas vezes deficiente [4]. A cisplatina é um dos agentes quimioterapêuticos vulgarmente utilizados para o tratamento de cancros da cabeça e pescoço [5]. A cisplatina é um agente inorgânico de platina, que podem se ligar ao DNA, induzindo intracadeia e ADN intercadeias de ligações cruzadas, bem como ADN-proteína de ligações cruzadas. Estas ligações cruzadas resultar na inibição da apoptose e crescimento celular [6]. No entanto, muitos pacientes desenvolvem resistência ao tratamento com cisplatina que conduz ao fracasso do tratamento [7]. Por conseguinte, existe uma necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas que são mais eficazes e têm menos efeitos secundários do que os regimes de tratamento actualmente utilizados.

Os transdutores de sinal e activadores da transcrição (STAT) são uma família de proteínas de sinalização que sejam activados por citocinas e factores de crescimento [8]. Até à data, 7 membros da família STAT, foram identificados em mamíferos. Em células normais, as proteínas STAT se transitoriamente activadas por fosforilação e desempenhar um papel nas respostas de citocinas mediada pelo factor de crescimento e como o crescimento celular, sobrevivência e inflamação [9], [10], [11]. No entanto, tem sido observado em vários estudos que a STAT3 é constitutivamente activa numa variedade de tumores sólidos humanos, incluindo cancro do pulmão [12], o cancro da próstata [13], o cancro da mama [14] e em mais de 95% dos cancros da cabeça e pescoço [10]. A desregulação e a activação constitutiva de STAT3 estimula o crescimento celular do cancro e contribui para o desenvolvimento e progressão do tumor por sobre-regulação de genes alvo STAT3 incluindo Bcl-2, c-myc, ciclina D1 e VEGF, que pode aumentar a sobrevivência celular, a proliferação e promover a angiogénese [15] [16], [17]. A expressão aumentada de STAT3 tem sido associada a um mau prognóstico em pacientes com gástrico, cancro colorectal, carcinoma de células escamosas do colo do útero e gliomas [18], [19], [20]. Além disso, a sobre-expressão e STAT3 sinalização foram encontrados para ser associado com resistência a cisplatina em HNSCC [21], [22]. Portanto, os esforços intensos focaram-se na segmentação STAT3 sinalização utilizando novas abordagens terapêuticas que poderia induzir a apoptose e sensibilizar tumores à quimioterapia [23].

Recentemente, uma nova classe de diarylidenylpiperidone (DAP) compostos tem sido sintetizada incorporando um anel piperidona à estrutura de base de beta-dicetona de curcumina [24]. Estes compostos mostraram substancialmente mais elevada a actividade anti-cancro do que a curcumina, em um modelo de cancro do ovário [25]. Verificou-se também que estes compostos inibiram a activação da STAT3. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de um dos compostos (DAP) diarylidenylpiperidone, H-4073, quer como agente único ou em combinação com a cisplatina, tanto

in vitro

e

In vivo

. Mostramos que H-4073, como um agente único, foi eficaz na inibição da proliferação de células tumorais e induzir a apoptose. Além disso, H-4073 a inibição mediada do STAT3, quinase de adesão focal (FAK), Akt e factor de crescimento celular endotelial vascular (VEGF) vias de sinalização e foi capaz de sensibilizar células tumorais aos efeitos da cisplatina, resultando na inibição da migração e apoptose

in vitro

bem como a redução do volume do tumor

in vivo

. Os nossos dados suportam o uso terapêutico da H-4073 em combinação com a cisplatina no tratamento de câncer de cabeça e pescoço.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todo o trabalho animal foi aprovado pela comissão de ética da Ohio State University IACUC animal e conduzida de acordo com as suas orientações (animal Welfare Assurance Número A3261-01).

linhas celulares e Reagentes

UM-SCC-74A, um- SCC-1, UM-SCC-74B, UM-SCC-38 e SCC-UM-47 foram obtidos a partir do laboratório do Dr. Thomas E. Carey da Universidade de Michigan [26]. CAL27 foi obtido a partir de ATCC (Manassas, VA). A linha de células resistentes à cisplatina (CAL27-CISR) foi gerado a partir da linha celular parental CAL27 (ATCC) como anteriormente descrito [27]. A identidade de todas as linhas celulares foi autenticado pelo STR genotipagem (Kit AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification, Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Todas as linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% de soro fetal de bovino, 1% de penicilina /estreptomicina e aminoácidos não essenciais a 1% (Invitrogen). H-4073 foi sintetizado tal como descrito anteriormente [24]. O composto de ações foi recém-dissolvido em DMSO para

in vitro

trabalho. Para

in vivo

trabalho, H-4073 foi misturado com ração animal (dose de 50 ppm por Harlan Tekland). Os anticorpos contra pSTAT3 (Tyr705), pAkt (Ser473), pp38 (Thr180 /Tyr182), pErk1 /2 (Thr202 /Tyr204) e GAPDH foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) e anticorpo pFAK (Tyr397) foi de Abcam ( Cambridge, MA). anticorpo CD31 era da Dianova (Hamburgo, Alemanha) e anticorpo p21 foi obtido a partir de Calbiochem (EMD Millipore, Billerica, MA).

Incorporação celular

Para determinar a absorção de H-4073 por HNSCC células

in vitro

, as células UM-SCC-74A foram cultivadas em placas de 10 cm e tratado With10 M de H-4073 ou 100 M curcumina. Após 1 hora de incubação, as células foram tratadas com tripsina, contadas, e lavadas com PBS. O sedimento de células foi deixada a secar, ressuspenso em metanol e sonicada durante 15 min. O sonicado foi centrifugado a 10000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi diluído com um volume igual de metanol e medida com um /Vis (λ = 328 nm, ε = 25000 H

-1 cm

-1).

Proliferação de Células Ensaio UV

a sensibilidade das células à cisplatina e H-4073 foi medida utilizando o kit de proliferação celular colorimétrico com base em MTT (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) [27]. Resumidamente, 5000 células /poço foram plaqueadas numa placa de 96 poços. No dia seguinte, as células foram tratadas com diferentes concentrações de H-4073, cisplatina, ou uma combinação de ambos. Após 72 horas, 10 uL /​​poço de solução de MTT foi adicionado a cada poço e ainda incubadas durante 4 horas a 37 ° C. Os cristais de formazano formados nas cavidades foram solubilizados por adição de solução de solubilização e incubação das placas a 37 ° C durante a noite. As placas foram lidas a 590 nm num leitor de placas Spectramax 190 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale CA). A percentagem de inibição de crescimento de células para cada grupo de tratamento foi calculada ajustando-se o grupo de controlo não tratado e 100%. Os dados foram analisados ​​utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Sofware, Inc., San Diego, CA) e as curvas de resposta de dose foram utilizados para calcular a concentração de H-4073 ou cisplatina, resultando em 50% de inibição da proliferação celular (IC50) usando um quatro modelo logístico paramétrica. Todas as experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes

Para os estudos de combinação de drogas, o efeito sinérgico foi avaliado pelo índice de combinação (Cl), de acordo com o método de Chou e Talalay, em que o sinergismo é definida como IC . 1, enquanto o antagonismo é CI 1, e um efeito aditivo é considerado como IC = 1 [28]. Os valores de Cl foram calculados usando o software CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).

Colónia ensaio de formação de

As células tumorais foram plaqueadas em pratos de 6 cm e tratados com cisplatina, H-4073 ou uma combinação de ambos. Após 48 horas de tratamento, 4 × 10

3 células viáveis ​​de cada grupo foram colocadas em placas em pratos de 6 cm e cultivadas durante mais 10 dias. As colónias foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal. Microfotografias foram tomadas e o número de colónias foi contado pelo software de imagem Alpha Innotech (San Leandro, CA).

Apoptosis Assay

As células foram colocadas em placas de 6 cm e tratada durante 24 horas. Celular do sobrenadante da cultura e as células foram recolhidas 48 horas após o tratamento. As células foram coradas com Anexina V 488 (Life Technologies, Grand Island, NY) e iodeto de propídio (Sigma, St. Louis, MO) e analisadas por citometria de fluxo [27].

imunotransferência

Os lisados ​​celulares foram corridas em Novex Bis-Tris gel (Invitrogen) sob condições redutoras, transferidas para membranas de PVDF (GE Healthcare Life Sciences /Amersham, Piscataway, NJ), sondados com anticorpos primários, em seguida, lavadas e incubadas com de ovelha anti-ratinho ou de burro anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (GE Healthcare). As membranas foram visualizados utilizando o Kit ECL Plus (GE Healthcare).

Migration Assay

O efeito sobre a migração celular em cima do tratamento foi medido utilizando o xCELLigence RTCA DP Instrumento (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) [29]. Resumidamente, as células foram cultivadas em meio livre de soro durante 24 horas. A câmara inferior do CIM-chapa 16 foi preenchida com 160 ul de meio completo. O fundo e as câmaras superiores foram agarrados juntos. meio isento de soro foi colocada na câmara superior e incubaram-se durante 1 hora no CO

2 incubadora a 37 ° C. As células foram tripsinizadas, sedimentadas e ressuspensas de modo a que 80.000 células foram adicionadas a cada poço da câmara superior em meio isento de soro contendo cisplatina, H-4073 ou uma combinação de ambos. A CIM-chapa 16 foi colocado na estação de RTCA DP e migração foi monitorizada durante 24 horas.

Os estudos in vivo

Para os estudos de eficácia antitumoral, foram utilizados ratinhos atímicos nus portadores de xenoenxertos de tumores . Todos os experimentos com animais foram realizados sob as orientações do Comité de Ohio State University de utilização e tratamento dos animais. As células de tumor (1 × 10

6) foram misturados com 100 ul de Matrigel e injectado por via subcutânea na área do flanco dos ratinhos [30]. Após 8 dias, os ratinhos foram estratificados em diferentes grupos (n = 5), de modo que o volume médio do tumor em cada grupo foi comparável. Os animais foram tratados com H-4073, misturando-o com a ração (dose de 50 ppm, Harlan Teklad) começando no dia 8. Os animais foram tratados com cisplatina (5 mg /kg) nos dias 8, 11, 14, 17, 21, 24, e 28 através de injecções intraperitoneais. as medições de volume de tumor [volume (mm

3) = L x W

2/2 (comprimento L, mm; largura W, mm)] começou no dia 6 e continuaram, duas vezes por semana até ao fim do estudo. Após 30 dias, os tumores primários foram cuidadosamente removidos, fotografada e analisada para pSTAT3, as células TUNEL-positivo e angiogénese tumoral.

Imunohistoquímica

Os tecidos tumorais de xenoenxertos foram fixados em paraformaldeído a 4% durante a noite e embebidos em parafina. As secções de tecido foram deparffinized, pré-tratados com tampão de recuperação de antigénios (EDTA, pH 8,0; pSTAT3) (citrato, pH 6,0; CD31) [27]. A peroxidase endógena e sítios de ligação não específicos foram bloqueados e as secções foram incubadas com pSTAT3 (705 Tyr) ou CD31. A ligação do anticorpo primário foi detectada utilizando IgG de cabra biotinilado anti-coelho (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ou de cabra biotinilado anti-IgG de ratazana (BD Biosciences, San Jose, CA). As lâminas foram então incubadas com o complexo de avidina-biotina (Vector Laboratories). Os locais de reacção foram visualizadas utilizando 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma Aldrich, St. Louis, MO). As secções foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas com Permount.

O ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, MA) foi utilizado para detectar células em apoptose por desoxinucleotidilo terminal transferase rotulagem final dUTP nick ( TUNEL) coloração nas secções de tumores de xenoenxerto de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, os cortes foram desparafinados, re-hidratados e incubadas com Proteinase K durante 15 minutos à temperatura ambiente e depois lavou-se. A actividade de peroxidase endógena foi extinta e após a lavagem, as secções foram incubadas com a concentração de terminal de desoxinucleotidil-transferase (TdT) a trabalhar a 37 ° C durante 1 hora. As secções foram então lavadas e incubadas com conjugado anti-digoxigenina (peroxidase) à temperatura ambiente. O sinal foi visualizado com DAB como cromogénio.

Análise estatística

Os dados de todas as experiências são expressos como média ± SEM de um mínimo de 3 experiências independentes. A significância estatística dos resultados foi avaliado por análise de duas vias da variância ou o teste t de Student (sempre que aplicável) e um valor de p 0,05 foi considerado significativo. IC

50 valores para a H-4073 e cisplatina, para inibição da proliferação de células de tumor foi calculado utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Sofware, Inc., San Diego, CA) e o índice de combinação (Cl) foi calculada utilizando o software CompuSyn (ComboSyn, Inc ., Paramus, NJ).

resultados

H-4073 é um potente inibidor da proliferação HNSCC

Os efeitos inibidores de crescimento de cisplatina em um painel de linhas de células de carcinoma epidermóide foram avaliada utilizando o ensaio de MTT. Como mostrado na Fig. 1A, o tratamento com cisplatina inibiu o crescimento das linhas de células de carcinoma epidermóide de uma forma dependente da dose. Selecionamos duas linhas de células (CAL27-CISR e UM-SCC-74A) que foram mais resistentes à cisplatina para outras experiências. UM-SCC-74A é uma linha de células de carcinoma de células escamosas derivada a partir de uma base do tumor língua. Esta linha celular foi escolhido para imitar a resistência cisplatina inerente ou natural. CAL27-CISR foi seleccionado por crescimento da linha parental língua carcinoma de células escamosas (CAL27) em concentrações crescentes de cisplatina durante um período prolongado de tempo [27]. Esta linha celular foi gerado para imitar fenótipo resistente à cisplatina adquirida. A curcumina foi extensa estudada pelas suas propriedades de inibição da STAT3 e actividade anti-tumor [31]. No entanto, devido à sua fraca biodisponibilidade e metabolismo rápido, a curcumina tem não transitou para a clínica. Por conseguinte, temos desenvolvido um análogo sintético da curcumina, H-4073 (Fig. 1B). No nosso estudo, H-4073 (10? M) demonstrou 5 vezes maior absorção celular de uma linha celular de cancro da cabeça e pescoço (UM-SCC-74A), em comparação com a curcumina (100 pM, Fig 1 C.). H-4073 foi altamente eficaz na inibição da proliferação de células de todas as linhas de células de carcinoma epidermóide que foram testadas, independentemente do seu estado de p53 ou o estado do papiloma humano (VPH, Figura 1D). No nosso estudo mecanicista, observou-se uma inibição marcada da STAT3, FAK e fosforilação de Akt por tratamento H-4073 de uma maneira dependente da concentração (Fig. 1E). Além disso, o tratamento com H-4073 também induziu a activação da MAPK p38, uma cinase activada stress que é conhecido por mediar a morte celular

A:. Linhas de células de carcinoma epidermóide

foram tratadas com diferentes concentrações de cisplatina (CDDP) e proliferação celular foi avaliada por um ensaio MTT.

B:

estruturas químicas de curcumina e H-4073.

C:

células SCC-UM-74A foram cultivadas em placas de cultura de 10 cm e tratou-se com a curcumina ou H-4073 durante 1 hora. a absorção celular de curcumina e H-4073 foi medida com um espectrofotómetro de UV /Vis.

D: linhas celulares

CECP foram tratadas com diferentes concentrações de H-4073 e proliferação celular foi avaliada por um ensaio MTT.

E:

células SCC-UM-74A foram tratadas com diferentes concentrações de H-4073 durante 2 horas. STAT3, FAK, fosforilação de Akt e p38 foi analisada por Western blotting e igual carga de proteína foi verificada por meio de remoção das manchas e reprobing com anticorpo GAPDH.

H-4073 sinergicamente aumentada a eficácia antitumoral da cisplatina em células de CECP

a seguir, analisou se o tratamento H-4073 poderia reverter a resistência a cisplatina em células de câncer de cabeça e pescoço e aumentar a sua eficácia anti-tumor de uma maneira sinérgica. Selecionamos duas linhas de células resistentes à cisplatina, UM-SCC-74A (naturalmente cisplatina resistente) e CAL27-Cis-R (gerado em nosso laboratório) para todos os nossos estudos. O efeito anti-proliferativo de H-4073 e tratamento de combinação com cisplatina (CDDP) foi medida por cálculo do índice de combinação (IC) de acordo com o método de Chou-Talalay [28] utilizando uma proporção de dosagem fixa. Tanto o H-4073 e CDDP foram adicionados às culturas de células do tumor a 0,25 ×, 0,5 ×, 1 ×, 1,5 × e 2 × seu respectivo IC

50 doses. A proliferação celular em ambas as linhas celulares foram marcadamente diminuída após o tratamento com combinações, nas concentrações múltiplas emparelhados quando comparado com o tratamento com qualquer dos agentes isolados sozinhos (Fig. 2). índice de combinação (CI) para diferentes doses eficazes (ED) foi calculado usando software CompuSyn. valores de CI para as células SCC-UM-74A a ED50, ED75 e ED90 foram 0,550, 0,537 e 0,244 respectivamente. Os valores CI para células CAL27-CISR foram 0,628, 0,606 e 0,507 em ED50, ED75 e ED90, respectivamente. Estes resultados sugerem que a H-4073 e tratamento de combinação de cisplatina foi altamente eficaz na inibição da proliferação de células de tumor de um modo sinérgico em ambas as linhas de células resistentes à cisplatina

A e C:.

UM-SCC -74

(

A

)

ou CAL27-CISR

(

C

)

células foram tratada com H-4073 ou cisplatina (CDDP), isoladamente ou em combinação a 0,25, 0,5, 1, 1,5 e 2 vezes o seu respectivo

50 doses e proliferação de células de IC foi avaliada pelo ensaio de MTT. Os resultados foram analisados ​​de acordo com o método de Chou-Talalay e os valores do índice de combinação (CI) calculado pelo software CompuSyn.

B e D: diagramas Bar

mostrando resultados de proliferação celular para UM-SCC-74A

(

B

) Comprar e CAL27-CISR

(

D

) Restaurant at IC

50 doses de H-4073 e cisplatina (CDDP). *, Representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com nenhum grupo de tratamento e **, representa uma diferença significativa (p 0,05). Em comparação com os grupos de tratamento individuais

A seguir investigou o efeito de H-4073 sozinho ou em combinação com a cisplatina na formação de colónias de células de tumor. Tal como observado com ensaio de proliferação celular, um tratamento de combinação com H-4073 e cisplatina na sua respectiva IC

50 doses inibiu a formação de colónias de células de tumor de um modo sinérgico (93% de UM-SCC-74A e 92% em CAL27-CISR células) (Fig. 3A-C).

CAL27-CISR

(

A-B

)

ou UM-SCC-74a

(

C

)

células foram tratadas com H-4073 ou cisplatina (CDDP) por si só ou em combinação, durante 48 horas. Quatro mil células viáveis ​​de cada grupo foram cultivados durante mais 10 dias em placas de 6 cm. Cada ensaio foi fotografado e o número de colónias analisadas. *, Representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com nenhum grupo de tratamento e **, representa uma diferença significativa (p 0,05). Em comparação com os grupos de tratamento individuais

H-4073 inibiu a migração celular e a apoptose de células de tumor melhorada

próxima examinou o efeito de H-4073 e tratamento de combinação de cisplatina sobre a motilidade de células tumorais por ensaio de zero. H-4073 e o tratamento com cisplatina sozinha mostrou 48% de inibição e 44% de motilidade celular UM-SCC-74A e 46% e% de inibição da motilidade celular CAL27-CISR, respectivamente (Fig. 4A-B) 42. H-4073 quando combinada com cisplatina apresentaram inibição significativamente maior da UM-SCC-74A e motilidade CAL27-CISR célula (85% e 82%), respectivamente. No próximo conjunto de experiências, nós examinamos se efeitos anti-tumorais H-4073-mediadas são mediados por apoptose. Com efeito, H-4073 no tratamento de combinação com cisplatina mostraram significativamente maior apoptose de células de tumor (Anexina V coloração, a Fig. 4C), em comparação com células não tratadas ou H-4073 e de células tratadas com cisplatina isoladamente. Além disso, o tratamento de combinação inibiu significativamente a ativação STAT3 e marcadamente aumentou os níveis de caspase ativada 3 e p21 (Fig 4D.)

A-B:.

Motilidade celular do tumor foi analisada pelo ensaio zero . Cada ensaio foi fotografado e as distâncias entre as bordas de células que migram foram quantificadas e migração de células de percentagem foi calculada. *, Representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com nenhum grupo de tratamento e **, representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com os grupos de tratamento individuais.

C-D:

células SCC-UM-74A foi tratada com H-4073 ou cisplatina (CDDP) por si só ou em combinação. Após 24 horas, as células foram quer coradas com Anexina V e analisadas por citometria de fluxo ou Western blotted para pSTAT3, p21 ou caspase 3. Carga igual de proteína foi verificada por meio de remoção das manchas e reprobing com anticorpo GAPDH.

H-4073 aumentou significativamente a eficácia terapêutica da cisplatina em câncer de cabeça resistente à cisplatina e pescoço

o

in vitro

dados sugerem que H-4073 reverteu significativamente a resistência a cisplatina em células de câncer de cabeça e pescoço . Nós ainda validado a nossa

in vitro

resultados usando um mouse modelo de xenotransplante atímicos. No primeiro conjunto de experiências, utilizou-se uma linha de células de câncer de cabeça e pescoço naturalmente resistente (UM-SCC-74A). H-4073 (50 ppm) e o tratamento com cisplatina (5 mg /kg) sozinho mostrou 33% inibição do crescimento tumoral e de 39% no dia 30, respectivamente (Fig. 5A-B). H-4073 em combinação com cisplatina apresentaram inibição do crescimento do tumor significativamente maior em relação ao grupo não tratado (84%) ou um único agente sozinho (Fig. 5A-B). Além disso, o tratamento de combinação foi muito bem tolerada e não causou qualquer toxicidade animal ou induzir diminuição significativa no peso corporal.

Os animais portadores de UM-SCC-74A, CAL27 e CAL27-CISR foram tratados com H -4073 (50 ppm) ou de cisplatina (CDDP, 5 mg /kg) isoladamente ou em combinação.

A:

microfotografias representativos de tumores UM-SCC-74A de tratada, a cisplatina (CDDP), H-4073, ou CDDP e grupos tratados-H-4073.

B:

curvas de crescimento do tumor para tumores UM-SCC-74A tratados com cisplatina (CDDP), H-4073, ou CDDP e H-4073.

C: curvas de crescimento do tumor Compra de CAL27 e CAL27-CISR tumores tratados com cisplatina (CDDP), H-4073, ou CDDP e H-4073. *, Representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com nenhum grupo de tratamento e **, representa uma diferença significativa (p 0,05). Em comparação com os grupos de tratamento individuais

No segundo conjunto de experiências, utilizou-se linha de células resistentes à cisplatina (CAL27-CISR, IC

50 28 nmol /L) e a linha parental sensível a cisplatina célula (CAL27, IC

3 50 nmol /L). Como já demonstrado anteriormente [27], o tratamento com cisplatina (5 mg /kg) de animais portadores de tumores CAL27-CISR não afectou significativamente o crescimento do tumor (9%) no dia 30, enquanto que o tratamento com cisplatina das suas células progenitoras (CAL27) diminuiu marcadamente crescimento do tumor (45%). tratamento de H-4073 em células CAL27-CISR foi significativamente mais eficaz na redução da carga de tumor (32%). H-4073 e combinação de cisplatina tratamento foi mais eficaz no crescimento do tumor inibindo de tumores CAL27-CISR (77%, Fig. 5C).

H-4073 e tratamento de combinação de cisplatina inibiu significativamente a fosforilação STAT3

in vivo Comprar e reforçada a apoptose de células tumorais

no nosso

in vitro

estudo, observou-se que H-4073 é um potente inibidor de STAT3 fosforilação. A seguir, analisou se H-4073 tratamento inibiu a fosforilação SAT3

in vivo

. tumores UM-SCC-74A de rato modelo de xenotransplante foram coradas com anticorpo pSTAT3. H-4073 e o tratamento com cisplatina inibiu significativamente a fosforilação da STAT3 (43% e 30%, respectivamente). H-4073 e combinação de cisplatina do tratamento foi mais eficaz na inibição da fosforilação de STAT3 (94%) (Fig. 6A-B). Da mesma forma, H-4073 e combinação de cisplatina tratamento foi mais eficaz na indução de apoptose em células tumorais

A-D (Fig 6C-D.):.

Parafina-embedded UM-SCC-74A amostras de tumor foram coradas para pSTAT3 (Y705) e células em apoptose (Apop Tag kit).

A:

microfotografias representativos de amostras de tumor coradas para pSTAT3 de tratada, a cisplatina (CDDP) ou H-4073 sozinhos ou grupos de combinação.

B:

pSTAT3 células positivas foram quantificados em 5 campos de potência elevada (400 ×) de cada amostra de tumor e a percentagem de células positivas calculados.

C:

microfotografias representativos de amostras de tumor coradas para células em apoptose de tratada, a cisplatina (CDDP) ou H-4073 sozinhos ou grupos de combinação.

D: células

TUNEL positivos foram quantificados em 5 campos de potência elevada (400 ×) de cada amostra de tumor e a percentagem de células positivas calculados. *, Representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com nenhum grupo de tratamento e **, representa uma diferença significativa (p 0,05). Em comparação com os grupos de tratamento individuais

H-4073 inibiu angiogénese tumoral por regulação negativa da secreção de VEGF a partir de células tumorais

uma série de estudos tenham demonstrado que a STAT3 é um regulador chave da angiogénese [16], [32]. A seguir, analisou se H-4073 e combinação de cisplatina tratamento afetados angiogénese tumoral. H-4073 e o tratamento com cisplatina sozinha mostraram 24% e 31% de inibição de angiogénese de tumor no UM-SCC-74A (Fig. 7A-B), enquanto que H-4073 e tratamento de combinação de cisplatina mostraram 62% de inibição da angiogénese tumoral. A seguir, analisou se H-4073 inibiu a angiogênese do tumor, bloqueando a produção de VEGF por células tumorais. células de UM-SCC-74A foi tratada com H-4073 e os níveis de VEGF nos sobrenadantes da cultura foram medidos por ELISA. células UM-SCC-74A não tratadas produziu altos níveis de VEGF (1121 pg /ml /10

6 células, Fig. 7C). H-4073 e o tratamento com cisplatina sozinha mostraram 36% e% de inibição dos níveis de VEGF 55. H-4073 e tratamento de combinação de cisplatina inibiu significativamente a produção de VEGF (83%). No próximo conjunto de experimentos, examinamos se H-4073 pode afetar diretamente a função angiogênico de células endoteliais inibindo a sinalização VEGF. Os resultados deste estudo demonstram que a H-4073 inibe marcadamente mediada por VEGF de ERK1 /2 e a fosforilação de Akt (Fig. 7D). Para além de inibir a pró-sobrevivência moléculas de sinalização (ERK1 /2 e AKT) H-4073 também p38 MAPK activada (uma molécula pró-apoptótica) de um modo dependente da dose (Fig. 7D).

a:

microfotografias representativos de coloração dos vasos sanguíneos do tumor para não tratada, cisplatina (CDDP) ou H-4073 sozinhos ou grupos de combinação para tumores UM-SCC-74A.

B:

densidade de microvasos nas amostras de tumores foi calculado por contagem de 5 campos aleatórios (200 ×) e expresso como a densidade de vasos ± DP.

C:

células SCC-UM-74A foram tratados com cisplatina ou H-4073 sozinho ou em combinação. Após 72 horas, os sobrenadantes de cultura foram recolhidos e ensaiados quanto a níveis de VEGF. *, Representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com nenhum grupo de tratamento e **, representa uma diferença significativa (p 0,05), em comparação com os grupos de tratamento individuais.

D:

células endoteliais foram tratadas com VEGF na presença ou ausência de diferentes concentrações de H-4073 durante 30 minutos. ERK1 /2, Akt e p38 fosforilação foi examinado por Western blot e carga de proteína igual foi verificada por fraccionamento dos borrões e reprobing com anticorpo GAPDH.

Discussão

Os pacientes com cabeça e pescoço câncer de abranger um grupo heterogêneo e até mesmo com o avanço nas opções de tratamento, a taxa de sobrevida global em pacientes com doença avançada não mudou substancialmente ao longo de décadas recentes [33]. Cirurgia seguida de radioterapia adjuvante tem sido muito utilizada no tratamento de doentes com carcinoma epidermóide [34]. Mais recentemente, os regimes à base de platina estão sendo integradas as opções de tratamento [35]. No entanto, muitos dos pacientes que desenvolvem resistência a cisplatina, um agente da platina mais amplamente utilizado, o que leva à falha do tratamento [21], [36]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver novos agentes terapêuticos que tem como alvo especificamente vias pró-sobrevivência. Estudos recentes têm demonstrado que a STAT3 é activada constitutivamente nas células tumorais e é sobre-expresso em linhas celulares resistentes à cisplatina [21], [37].