Abstract

As células cancerosas que migram dentro de um microambiente 3D são capazes de adotar, seja um mesenquimais ou modo amebóides da migração. migração Amoeboid é caracterizada pela formação de bolhas de membrana que é dependente dos efectores Rho, ROCK1 /2. Identificamos LIMK2 como o substrato preferido para encontrar ROCK1 mas que LIMK2 não induziu formação de bolhas de membrana, sugerindo que uma via LIMK2 não está envolvido na migração de modo amebóide. Em apoio a esta hipótese, romance FRET dados demonstram uma interação direta entre ROCK1 e LIMK2 em células polarizadas, mas não formação de bolhas. Nossos resultados apontam para um papel específico para o ROCK1:. Percurso LIMK2 na migração de modo mesenquimais

Citation: Shea KF, Wells CM, Garner AP, Jones GE (2008) ROCK1 e LIMK2 Interact do spread, mas não formação de bolhas Células cancerosas. PLoS ONE 3 (10): e3398. doi: 10.1371 /journal.pone.0003398

editor: Carl-Philipp Heisenberg, Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Alemanha |

Recebido: 08 de julho de 2008; Aceito: 16 de setembro de 2008; Publicação: 14 de outubro de 2008

Direitos de autor: © 2008 Shea et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Investigação médica (MRC), e a atribuição de uma bolsa de estudo de caso da BBSRC /AstraZeneca plc

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metástase do câncer de mama depende de migração celular, um processo complexo regulados espacialmente, bem como temporalmente pela família Rho GTPases Rho, Rac e Cdc42 [1]. Estas GTPases eliciar uma resposta a sinais extracelulares sobre o citoesqueleto de actina por meio de uma variedade de proteínas efectoras. Em um microambiente 3D células cancerosas podem adotar tanto mesenquimal e amebóides como fenótipos migratórios [2]. migração Amoeboid é caracterizada pela formação de bolhas de membrana [3] – [5] uma forma especializada de saliência célula que é reversível e pode ocorrer durante a migração celular ou durante a iniciação da citocinese [6]. vesiculação da membrana tem sido mostrado para ser induzida por Rho proteína efectora ROCHA [7] e movimento ameboide semelhante é completamente dependente da interacção entre a Rho e ROCHA [2], [5].

ROCK-1 e ROCHA -2 são serina /treonina-quinases, que têm um certo número de substratos celulares, incluindo a corrente Miosina luz e LIM-cinase (LIMK) [8]. migração dependente da ROCHA das células cancerosas é conhecido por ser conduzido por contrações actomiosina [9], [10]. No entanto, não se sabe se amebóides célula cancerosa dependente ROCHA locomoção requer um ROCK:. Interação LIMK

proteínas Limk activadas fosforilam e inativar a F-actina proteína corte, cofilina e isso proporciona um mecanismo alternativo para a sinalização de Rho-ROCK para mediar os seus efeitos sobre o citoesqueleto de actina F [11]. sinalização ROCK-LIMK é pensado para promover a retração de neurites através da regulação da atividade cofilina [12]. Além disso, um papel para as proteínas Rock e LIMK na epiderme humana foi identificado [13]. A inibição da actividade da cofilina por ROCK-LIMK parece ser necessária para a compactação de células em que uma diminuição da actividade LIMK leva a um aumento da actividade cofilina e uma diminuição na compactação de células [13].

Um aumento nos níveis de ROCHA tem sido detectado em vários cancros humanos [14] – [16], e os níveis de 1-LIMK aumento da mama e da próstata linhas celulares invasivo e metastático [17], [18]. Por isso buscou-se compreender melhor a contribuição de uma rocha:. Interação LIMK à migração de células cancerosas pela imagem da interação espacial entre o rock e LIMK em células de câncer de mama exibindo tanto mesenquimal e morfologias amebóides (formação de bolhas)

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

anti-ROCK1 foi adquirido de Transduction Laboratories, anti-LIMK2, anti-fosfo-LIMK1 /2 (Thr508 /Thr505) de Cell Signaling Technology. Os anticorpos secundários conjugados com HRP da Dako e Alexa-faloidina de Molecular Probes. Os plasmídeos de expressão que codificam para GFP, PCP, YFP e mRFP1 etiquetado LIMK1, ROCK1 LIMK2 e foram gerados usando tecnologia ™ Gateway (Invitrogen) e todos os plasmídeos foram sequenciados. A Y27632 inibidor da rocha foi comprada a Calbiochem.

Cultura celular

células MDA-MB231 foram cultivadas em DMEM (Sigma) suplementado com 10% de FBS (Helena Biosciences), L-glutamina e 100 U /ml de penicilina-estreptomicina. As células foram transitoriamente transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 de reagente de transfecção de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen)

A fosforilação ensaio

As células foram lisadas em tampão de lise NP40 (1% v /v de NP40;. 50 mM de HEPES pH 7,5; 0,5% w /v desoxicolato de sódio; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM). As amostras foram resolvidas por SDS-PAGE e coradas imunologicamente. Auto-radiografias foram digitalizadas e quantificadas utilizando o software Adobe. Média e S.E.M. Os valores foram calculados a partir dos dados de 3 experiências independentes

imunofluorescência e análise

As células cultivadas sobre lamelas de vidro foram fixadas com 4% paraformaldeído. PBS e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100: PBS como previamente descrito [19]. As células foram então incubadas com faloidina-TRITC conjugado durante 1 h à temperatura ambiente. Imagens de células foram obtidas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser-Zeiss LSM510 (Welwyn Garden City, Reino Unido) e foram processadas no Adobe Photoshop 7.0 ™. O teste t de Student pareado foi usado para comparar as diferenças entre os grupos. A significância estatística foi aceito para P ≤ 0,05

FRET: FLIM Microscopia

As células foram microinjeção com os plasmídeos apropriados 24 horas antes do assentamento. As células foram então fixadas como descrito acima e incubou-se com boro-hidreto de sódio fresco (1 mg /ml em PBS) para extinguir a fluorescência de fundo, como anteriormente descrito. FLIM foi realizada num microscópio multifotônica como previamente descrito [19]. análise FLIM para calcular vida GFP e FRET eficiência foi realizada usando software de tri2 [19]. O número de pixels para cada valor de eficiência de FRET foram obtidos a partir de tri2 e normalizado dividindo-o pela soma dos pixels para a imagem. Esta contagem de pixels normalizada foi em média mais de seis células por condição e, em seguida, conspiraram contra a eficiência FRET para gerar histogramas de eficiência traste.

Resultados

ROCK1 fosforila LIMK1 e LIMK2 em células de câncer de mama

Um número de laboratórios têm sugerido que o rock pode fosforilar e activar LIMK1 e LIMK2 [20] – [26] e, portanto, procurou-se determinar se este é o mesmo para células MDA-MB231. Pré-incubação com o inibidor Y27632 ROCHA reduziu o nível de fosforilação LIMK2 em células com sobre-expressa endógena e CFP-ROCK1. Em contraste, Y27632 reduz o rácio de fosfo para LIMK1 total nas células com sobre-expresso PCP-ROCK1, mas não nos que com os níveis endógenos de proteína ROCHA (Fig. 1). O tratamento de células com Y27632 induziu um pequeno decréscimo na LIMK1 e LIMK2 níveis sobre-expressão (Fig. 1A e B). No entanto, enquanto a fosforilação LIMK2 é sempre sensível a atividade ROCHA LIMK1 fosforilação só é sensível à atividade ROCHA quando CFP-ROCK1 é abundante. Assim, os nossos resultados demonstram que a sobre-expressão de ROCK1 altera o nível de fosforilação de ambos LIMK1 e 2, mas sugerem que LIMK2 é o substrato preferido da ROCK1 nestas células.

A) e B) CFP-LIMK1 ou 2 e PCP quer-ROCK1 ou CFP sozinho foram transientemente transfectados em células MDA-MB231 e tratou-se com 10 uM Y27632 durante 24 horas. Os lisados ​​resultantes foram coradas imunologicamente com anti-fosfo-LIMK, -LIMK1, -LIMK2 e -ROCK1 anticorpos. (NSB = ligao n especica do anticorpo anti-ROCK1 a uma proteína /s a ​​220 kDa). C) Rácio de fosfo /total de LIMK1 CFP-LIMK1 e D) Rácio de fosfo LIMK2 /total. (* = P 0,05).

ROCK1 mas não LIMK2 induz formação de bolhas nas células do câncer de mama

Descobrimos que, enquanto a sobre-expressão de GFP sozinho faz com que um pequeno, mas estatisticamente significativo, aumento da número de células de formação de bolhas sobre-expressão de GFP-ROCK1 induz um aumento altamente significativo na percentagem de células de formação de bolhas (Fig. 2A e B). Embora não seja mostrado antes em células MDA-MB231 esta tem sido relatada em outros tipos de células [9], [27] – [30]. Em contraste a sobre-expressão de GFP-LIMK2 não induzir um elevado nível de formação de bolhas de membrana, também viu qualquer indicação de formação de bolhas de células após a sobre-expressão de LIMK1 (dados não mostrados). Em todos os casos as células de vesículas tinham um núcleo intacto que não fragmento (Fig. 2A), indicando que este não está associada com formação de bolhas de membrana apoptose [31].

) células MDA-MB231 A foram transfectadas com GFP-ROCK1 ou GFP-LIMK2, fixadas e coradas com Alexa Fluor 594-faloidina e DAPI. 150 células por 3 experimentos independentes foram marcados para a formação de bolhas visíveis +/- S.E.M. P 0,05; *** P 0,001. B) Imagens representativas de variando fatias de óptica de uma célula blebbing superexpressão GFP-ROCK1. (Bar = 20 mm).

ROCK1 e LIMK2 não interagem em células de câncer de mama blebbing

Nossos resultados mostram que existe uma interação entre ROCK1 e LIMK2 mas sugerem que esta interacção não está envolvido na formação de bolhas de membrana. Nós procurado para confirmar esta hipótese por imagem diretamente a interação entre ROCK1 e LIMK2 em células de formação de bolhas e não-formação de bolhas usando FRET: microscopia de FLIM. Este método não só permite uma interacção entre ROCK1 e LIMK2 a ser detectado, mas também a localização de uma tal interacção, a ser determinado espacialmente ao longo de toda a célula. A fim de comparar a interacção de ROCK1 LIMK2 e propagação em células e formação de bolhas foi utilizado microinjecção para moderar o nível de expressão ROCK1. Usando este método, a maior parte das células, (63%), exibiram um spread /morfologia polarizada, com menor número de células de formação de bolhas (23%). Em células de formação de bolhas que não detectou FRET entre GFP-ROCK-1 e MRFP-LIMK-2 (Fig. 3).

células MDA-MB231 receberam microinjeções GFP-ROCK1 e MRFP-LIMK2, fixo, fotografada e analisados ​​por meio de microscopia de FLIM eo programa de análise Tri2. A) Imagens da vida GFP e intensidades GFP e MRFP através de uma célula de formação de bolhas típico foi exibido para uma célula que expressa tanto o doador GFP-ROCK1 eo receptor MRFP-LIMK2 e, para comparação, apenas o GFP -ROCK1 doador. B) Histograma do número de contagens de pixel normalizados detectados em cada tempo de vida de GFP. n = 9.

ROCK1 e LIMK2 interagir em células de cancro da mama polarizadas

Tendo estabelecido que ROCK1 e LIMK2 não estão interagindo em células de formação de bolhas analisamos a localização e interação de ROCK1 e LIMK2 em células espalhadas. Em células espalhar a maioria de expressão LIMK2 e ROCK está localizada no citoplasma, mas a expressão de ambas as proteínas podem ser detectados no núcleo (Fig. 4). Em células MDA-MB231 com um spread /fenótipo polarizada detectamos uma vida GFP diminuiu quando ROCK1 e LIMK2 foram co-expressos, mostrando que ROCK1 e LIMK2 interagir em células espalhadas (Fig. 4). A diminuição GFP vida é visto em todo o citoplasma da célula em uma distribuição ponteada. Em comparação, duas células polarizadas microinjetados apenas com GFP-ROCK1 não exibir qualquer diminuição da GFP vida (Fig. 4). Não há queda significativa na vida GFP abaixo dos níveis de controle quando as células que expressam ROCK1 e LIMK2 são pré-incubadas com o Y27632 inibidor ROCHA (Fig 4). Curiosamente, em muitas células, há uma falta de qualquer interacção detectável entre ROCK1 e LIMK2 na periferia da célula (destacada por pontas de seta na Fig. 4).

células MDA-MB231 foram microinjectados com GFP-ROCK1 e mRFP- LIMK2, fixo, fotografadas e analisadas utilizando microscopia de FLIM e o programa de análise de tri2. A) Imagens da vida GFP e intensidades GFP e MRFP através de uma célula alongada típica foi exibido para uma célula que expressa tanto o doador GFP-ROCK1 eo receptor MRFP-LIMK2 e, para comparação, apenas o GFP -ROCK1 doador. B) Histograma do número de contagens de pixel normalizados detectados em cada tempo de vida de GFP. C) um histograma do número médio de contagens de pixel normalizados detectados em cada tempo de vida da GFP em células que expressam tanto GFP-ROCK1 dador e aceitador MRFP-LIMK2 em células de morfologias alongados ou formação de bolhas foi construído juntamente com as células que expressam apenas o dador GFP-ROCK1. 18 células ao longo de três experiências independentes foram fotografadas para cada ponto de tempo. D) um histograma do número de contagens de pixel normalizados detectados em cada tempo de vida GFP para células que expressam ambas GFP-ROCK-1 e MRFP dador-aceitador LIMK-2 em células MDA-MB231 pré-tratadas com Y27632. n = 9.

Discussão

Estudos anteriores não identificados se um ROCK: pathway LIMK contribuiu para a indução da formação de bolhas de membrana. Nós fornecemos aqui para a primeira evidência de tempo de uma interacção directa e concreta entre ROCK1 e LIMK 2 em células mesenquimais bem espalhadas que está ausente em células de formação de bolhas arredondadas. Utilizando microscopia de FRET encontramos nenhuma interacção entre ROCK-1 e LIMK-2 em células que exibiram um feno tipo de vesículas de membrana, apesar da nossa própria evidência que LIMK2 é o substrato preferido ROCHA nestas células. Os nossos resultados sugerem que um ROCK1: LIMK2 interacção não está envolvido na /fenótipo arredondado formação de bolhas e não ser necessária para a migração amebóide. De facto sobre-expressão de LIMK2 não induz a formação de bolhas de membrana em células. Relatórios recentes sugerem que eventos celulares a jusante da ativação ROCHA são, de facto coordenada separadamente embora MLC e fosforilação cofilina [32].

Em contraste nossos estudos FRET identificou uma interação direta entre ROCK1 e LIMK2 em focos concentrada no citoplasma de câncer as células com uma morfologia mesenquimal. A fosforilação de LIMK-2 por ROCK-1 no centro da célula iria aumentar o nível de fosforiladas cofilina, diminuindo assim de corte F-actina. Isto estabilizar os filamentos de actomiosina presentes no corpo celular e promover a geração da força contráctil necessária para retracção da cauda e a migração de células [33]. De facto, tem sido mostrado previamente que a formação de fibras de stress de actina induzida por TGF é mediada por um ROCK-1 /LIMK-2 /cofilina via [26]. Recentemente, um ROCK: LIMK1 pathway foi implicada na coordenação da atividade cofilina na membrana plasmática de células de carcinoma mamário de rato invasivos [34], [35]. Nossos resultados apontam para uma função distinta para LIMK1 e LIMK2 jusante do Rock durante a migração de células de câncer de mama. Especula-se que a interacção entre ROCK1 e LIMK2 não desempenha um papel significativo na formação de bolhas de membrana associada a migração celular nem na regulação da fosforilação cofilina na periferia da célula. Pelo contrário, a interacção entre ROCK1 e LIMK2 é restrito para o corpo celular de células bem espalhadas polarizados onde é contribui para a estabilização de filamentos de actomiosina e a geração de força contráctil através de inactivação de cofilina.