Abstract

O CCT chaperona molecular /Tric desempenha um papel central na manutenção Proteostase celular, uma vez que medeia a dobragem dos principais tubulinas proteínas do citoesqueleto e actins . CCT /Tric também está envolvido na oncoproteína ciclina E, a proteína supressora de tumor de Von Hippel-Lindau, ciclina B e p21

ras dobragem o que sugere fortemente que está envolvida na proliferação celular e génese tumoral. Para avaliar o envolvimento do CCT /Tric na génese do tumor, nós quantificamos seus níveis de expressão e actividade em 18 de câncer, um linhas de células humanas não-cancerosas e um fígado humano não-câncer. Mostra-se que os níveis de expressão de TCR /TRIC em linhas celulares de cancro são mais elevados do que em células normais. No entanto, CCT atividade /Tric nem sempre se correlacionam com os seus níveis de expressão. Nós, portanto, documentou os níveis de CCT /moduladores Tric e parceiros PhLP3, Hop /P60, prefoldin ea HSC /Hsp70 de expressão. Nossa análise revela uma interação funcional entre chaperones moleculares que possam representam uma modulação precisa da atividade /Tric CCT na proliferação celular através de mudanças nos níveis celulares de prefoldin e /ou Hsc /p70 e CCT /Tric disponibilidade de proteína cliente. A nossa observação e abordagens trazer novas idéias no papel do CCT /Tric mediada por máquinas dobramento de proteínas no desenvolvimento de células de câncer

Citation:. Boudiaf-Benmammar C, Cresteil T, Melki R (2013) O citosólico Chaperonina CCT /Tric e câncer proliferação celular. PLoS ONE 8 (4): e60895. doi: 10.1371 /journal.pone.0060895

editor: Anna Alisi, Hospital Bambino Gesù Crianças, Itália |

Recebido: 22 de novembro de 2012; Aceito: 04 de março de 2013; Publicação: 16 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Boudiaf-Benmammar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Investigação e Tecnologia, o Ministério argelino do Ensino Superior e da Investigação, do Centre National de la Recherche Scientifique e da Universidade Paris Sud francês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Para garantir dobrar eficiente das cadeias de polipeptídeos nascentes dentro de células ambiente altamente lotados ter projetado uma classe de proteínas conhecidas como chaperones moleculares [1], [2]. Estas proteínas ligam-se, durante ou após a tradução, desdobrado, parcialmente dobrado e mal dobradas cadeias polipeptídicas, muitas vezes através de segmentos hidrofóbicos expostos [3]. A ligação de chaperones moleculares para seus clientes neutraliza a sua propensão para a agregação intrínseca e permite que uma cadeia de polipeptídeos para procurar a paisagem dobrar e chegar a seu estado nativo, funcional [4]. chaperones moleculares também controlam a homeostase da proteína em condições normais e de estresse. Eles constituem, portanto, um sistema de controle de qualidade para a manutenção da conformação da proteína nativa, a translocação de proteínas através das membranas e rotatividade normal de proteína [2].

O envolvimento das chaperones moleculares no desenvolvimento e progressão do câncer está sujeita a debate ativo. Vários estudos relatam que as chaperonas são encontradas em níveis aumentados em muitos tumores sólidos e doenças malignas hematológicas [5], [6]. A sua expressão pode em conta a parte para a capacidade das células malignas para manter a homeostase da proteína no ambiente hipóxico e ácido desfavorável do tumor. Através da sua interacção com proteínas reguladoras chave, as chaperonas moleculares regulam o ciclo celular e proteger as células de morte programada. Eles promovem a tumor de células de sobrevivência, o crescimento e a metástase, mesmo em condições privadas de factor de crescimento, por permitir que a proteína de tradução contínuo e proliferação celular [7]. Finalmente, as chaperonas moleculares são considerados críticos para permitir que as células tumorais a tolerar alterações genéticas que de outra forma seria fatal [5]. Com efeito, as chaperonas moleculares, tais como Hsp90 actuam como tampões bioquímicos para as numerosas lesões genéticas que são característicos da maior parte dos cancros humanos e unidades oncogenesis [8].

chaperonas moleculares são proteínas ubíquos que são os produtos de distinta, altamente conservada , famílias de genes. Eles são classificados em diferentes categorias com base em suas massas moleculares, distribuição e função celular [9]. Os membros da família Hsp60 são peculiares em que eles formam complexos de elevado peso molecular em forma de anel de proteína. Estas partículas são verdadeiros nanomáquinas dobráveis ​​alimentadas por ATP e chaperoninas chamados. Duas classes de chaperoninas foram definidos [10]. As chaperoninas grupo I são constituídos por uma única cadeia polipeptídica e que constituem têm uma simetria de dobragem 7. Este grupo compreende GroEL [11] e sua cpn60 homólogo mitocondrial. Os chaperoninas grupo II constituam tem uma simetria dobra 8 e compreendem thermosomes archaebacterial eo citosólica bônus contendo chaperonin t-complexo polipeptídeo 1 (CCT), também conhecido como o complexo anel TCP1 (Tric) [12]; CCT /Tric é um complexo de 16 subunidades composto por dois anéis empilhados back-to-back, cada um contendo oito subunidades diferentes de aproximadamente 60 kDa (α, β, γ, δ, ε, ζ-1, η e θ) [13] ; [14]. CCT /Tric coopera com cofatores de proteínas de dobrar proteínas clientes-alvo. Hop /p60, um co-fator de Hsp70 e Hsp90, aumenta dobrar a eficiência facilitando o intercâmbio de nucleotídeos [15]. Phosducin como a proteína 3 (PhLP3) é um modulador negativo de dobragem e restringe o acesso proteína cliente para a câmara de dobragem [16]. Finalmente, a chaperona molecular prefoldin (PFD), também modula a actividade CCT /Tric uma vez que proporciona proteínas clientes [17], [18]

CCT /Tric medeia a dobra de tubulinas e actins [19].; [20], incluindo o γ-tubulina e centractin [21] centrosomal. A lista crescente de CCT /clientes Tric compreende proteínas envolvidas na gênese do tumor com ciclina E [22], a de Von Hippel-Lindau (VHL) proteína supressora de tumor [23], a ciclina B e p21

ras [24]. Para além da sua exigência de actins e tubulinas dobrar, existem evidências de que CCT /Tric é fortemente regulado para cima durante a transição de fase G1 /S do ciclo celular através da fase inicial S, e que este evento é controlado no nível de ARNm [ ,,,0],25]. Além disso, a regulação para baixo da expressão CCTα está associado com uma inibição da proliferação de células, uma diminuição na viabilidade celular, a paragem do ciclo celular e apoptose celular [26].

Em conjunto, estas observações sugerem fortemente que CCT /execuções Tric um papel fundamental na progressão do ciclo celular, e que pode estar implicado no desenvolvimento do tumor.

Aqui nós quantificar i) os níveis de expressão de TCR /TRIC e os seus parceiros incluindo Hsc 70 e Hsp70 (HSC /p70), PhLP3 , Hip /P60, prefoldin DNAJB1 e em linhas de células humanas cancerígenas e ii) a sua actividade nos extractos celulares. Em geral, os níveis de expressão de TCR /TRIC em linhas celulares de cancro são mais elevados do que em células normais. Notavelmente no entanto CCT atividade /Tric nem sempre se correlacionam com os seus níveis de expressão. Nós, portanto, documentou os níveis de moduladores CCT /Tric expressão. Nossa análise traz novas idéias no papel de proteína dobrar máquinas no desenvolvimento de células cancerígenas.

Materiais e Métodos

linhas de células humanas e extractos celulares Preparação

Quinze linhagens de células tumorais , derivada de cancros de diferentes órgãos e com características distintivas, e uma linha de células não-cancerosas estabelecidos a partir de tecido de pulmão fetal normal foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). Três outras linhas celulares veio de outras fontes: SH-5YSY foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA), OVCAR-8, uma linha de células do NCI, foi fornecida pelo Dr Liscovitch (Rehovot, Israel) e SF268 foram obtidas a partir da National Cancer Institute (NCI Frederick, MD, EUA). células MIA-PaCa-2, MRC5-SV2, HepG2 e KB foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). HCT116, SK-OV3, HT-29, K-562, HL-60, PC3, HeLa, MCF-7, MDA-MB-435S, MDA-MB-431, A549, SF-268, HCT15 e células OVCAR-8 foram rotineiramente cultivadas em 10% de FBS /RPMI 1640 suplementado com penicilina-estreptomicina, glutamina e fungizona. As células SH-5YSY foram cultivadas numa mistura de meio F12 de DMEM e Ham suplementado com FBS a 10%, glutamina e penicilina-estreptomicina. As características de linhas de células e as referências são dadas na Tabela 1.

As células foram contadas, lavadas e colhidas. A densidade celular foi ajustada a 24,10

7 células /ml em tampão de lise (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo). As células em suspensão foram colocadas em gelo e sujeita a 10 ciclos de sonicação constituídos por um segundo impulso um com uma potência de saída de 10 watts espaçados de 15 segundos usando um sonicador Branson 150, enquanto o fragmento de fígado humano (HNCL), que dão origem e recolha antes 1995, na sequência do comité de ética do Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale são descritas em [27], [28], foi homogeneizado em gelo utilizando um homogeneizador Kontes Teflon-vidro. lise celular completa foi verificada utilizando um microscópio e a força iónica do extracto foi ajustado a 140 mM de Tris /HCl, pH 7,5, MgCl 14 mM

2, DTT 1 mM, KCl 70 mM, ATP 4 mM e glicerol a 10% (v /v). Os extractos foram clarificados por centrifugação a 12000 × g durante 10 min a 4 ° C e a concentração de proteína no sobrenadante foi determinada pelo método de Bradford [29]. Coelho lisado de reticulócito (RRL) preparado como anteriormente descrito [30] foi utilizado como um controlo em todas as experiências.

Anticorpos

Rato anticorpos policlonais contra PhLP3 humano (anti TXNDC9), Hop /p60 ( anti STIP1) e PFD5 (anti PFDN5) foram adquiridos a Abnova (Ontario, Canadá). anticorpo monoclonal de ratinho contra Hsc70 /p70 foi comprado de StressGen (Victoria, BC, Canadá). anticorpo policlonal de coelho para DNAJB1 foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA). anticorpo policlonal de coelho contra CCTα foi gerado em laboratório [24].

Western Blot

A faixa padrão compreendendo CCTα (100, 50, 25, 12,5 ng /ml), PhLP3 (0,5, 0,25, 0,125? g /ml), PFD5 (25, 12,5, 6,25 ug /ml), Hop /p60 (6, 3, 1,5 ug /ml) e Hsp70 (80, 40, 20, 10 ug /ml) foi resolvido por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (PAGE), utilizando 12% de géis de poliacrilamida [31] com duas diluições (1/4 ou 1/8 e 1/16) de cada extracto celular e colocados a hibridar em filtro de nitrocelulose [32]. Cada filtro foi sondado, sucessivamente, com os cinco anticorpos primários após a regeneração da membrana por incubação a 50 ° C em Tris 62,5 mM /HCl pH 6,8, 100 mM de β-mercaptoetanol e SDS a 2% (v /v). bandas reactivas foram visualizadas por quimiluminescência usando substrato absorvente Pierce ECL Ocidental (Thermo Scientific, Rockville, EUA), seguindo as recomendações do fabricante e o sinal quimioluminescente foi capturada digitalmente com um analisador de imagem luminescente LAS-3000 (Fujifilm). Todos os experimentos foram realizados pelo menos em duplicado para repetições biológicas, o que corresponde a culturas de células independentes e os valores médios e desvio padrão foram derivados das duas medições independentes. As quantidades de CCT /tric, PhLP3, PFD5 e Hop /p60 nos diferentes extractos foram quantificados por comparação da luminescência nos extractos celulares com a dos padrões de concentração conhecida a electroforese no mesmo gel.

Actividade dobrável ensaio

[

35S] marcado com desdobrado proteína alvo β-actina foi gerado por expressão em

E. coli

e purificada tal como descrito por Gao et ai. [33]. As atividades de redobramento de extratos celulares, RRL e HNCL foram testadas e analisadas após a diluição do desnaturante de β-actina radiomarcados em extratos de células, RRL e HNCL diluídas em tampão de dobramento (MES 80 mM /KOH, pH 6,8, MgCl 1 mM

2, DTT 1 mM, EGTA 1 mM, ATP 1 mM). A concentração de proteína dentro dos extractos foi de 15 mg /ml ou 2,5 mg /ml. Os produtos da reacção foram resolvidos em géis de poliacrilamida não desnaturante 6%. Os géis foram então secos e expostos a um ecrã de fósforo de armazenamento (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, EUA) e desenvolvido em uma tempestade PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, EUA). Um exemplo de uma reacção de redobragem β-actina desdobrado mediada por TCR é mostrado na Figura S1. Todos os experimentos foram realizados em duplicado. Os valores médios e desvio padrão foram derivados das duas medições independentes.

celular Extrai Imuno-esgotamento

Dois extratos de células arbitrariamente escolhidos (MIA-PaCa-2 e OVCAR-8) eo controle foram imuno-empobrecido usando PhLP3 anti-, anti-Hop /p60, anti-PFD5, anti-HSC /p70 ou anticorpos anti-CCTα. Os extractos foram incubados durante 2 h a 4 ° C, sob suave movimento com o anticorpo adequado e os complexos proteína-anticorpo foram sedimentados após incubação durante a noite a 4 ° C com esferas de proteína A Sephrose CL-4B (GE Healthcare) equilibrada em 50 mM de Tris -HCl, pH 7,0. Os sobrenadantes foram recuperados, a concentração de proteína foi medida e a capacidade do extracto de depleção de imuno redobrar [

35S] marcado com desdobrado β-actina foi ensaiada

In vitro

.

Análise de imagem, Análise e cálculos estatísticos

as imagens digitais obtidas com o analisador Fujifilm LAS-3000 ea tempestade PhosphorImager foram analisados ​​utilizando o software NIH imagem (Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD).

as intensidades derivadas de análise de imagem foram analisados ​​por meio de duas amostras, uma cauda testes t de Student independente.

o número de /Tric e PFD partículas CCT por célula foi derivado a partir de medições de concentração usando a seguinte equação : em que: n é o número de CCT /TRIC ou partículas PFD, C, a quantidade de CCT /TRIC ou PFD estimado a partir de medições de western blot, por comparação com quantidades conhecidas de CCTα ou PFD5 em mg /ml, C

N, é o número de células /ml, Mw, é o peso molecular de partículas CCT /Tric ou PFD (750000 para CCT /Tric, 100.670 para PFD) e

N of the constante de Avogadro (6.023 × 10

23).

resultados

CCT /Tric expressão e atividade

CCT /Tric é estritamente necessário para a dobragem das duas principais proteínas do citoesqueleto actins e tubulinas

em vivo

. No entanto, pouco se sabe sobre a sua expressão e actividade em células cancerosas. Foram comparados os níveis de expressão e a actividade de CCT /TRIC em 18 cancro linhas de células de diferentes órgãos e uma linha celular normal (MRC5-SV2), um homogenato de fígado humano não-cancro (HNCL) e lisado de reticulócitos de coelho (RRL), onde CCT /Tric é conhecido por ser expresso e altamente activa. A quantificação da CCT /TRIC em transferências de Western (Figura 1) revelou que, a concentração média de CCT /TRIC em extractos de células de cancro é de cerca de 5 mg por mg de proteínas totais e cerca de 3-4,10

8 CCT partículas /TRIC ( consulte a secção de procedimentos experimentais para o cálculo Tabela S1 para CCT /Tric partículas número nas diferentes linhas de células), exceto para MIA-PaCa2, MRC5-SV2, MDA-MB-231 e linhas de células HL-60, onde CCT /quantidades Tric são de 2 a 3 fold o valor médio. Em HNCL e RRL, a quantidade de CCT /Tric é metade da média medida para as linhas celulares de cancro. Também é importante notar que este montante é o mais baixo (1.6μg /mg de proteínas totais) na linha de células SH-SY5Y de neuroblastoma humano. CCT expressão /Tric aparece, assim, regulada positivamente em todas as linhas celulares de cancro, em particular, em MIA-PaCa2, MDA-MB-231 e as linhas celulares HL-60 (Figura 1). Para determinar se a expressão CCT /Tric se correlaciona com a sua actividade nos quantificada radioactivamente, desnaturado, actina de dobragem nos extractos de células suplementadas com Mg

2 + e ATP, tal como descrito na secção de procedimentos experimentais. Os resultados, apresentados na Figura 2 mostram que a actividade de CCT /Tric nem sempre se correlaciona com o seu nível de expressão. Com efeito, enquanto que a actividade de dobragem da CCT /TRIC em MIA-PaCa2, MDA-MB-231 e extractos de linha celular MDA-MB-435S foi altamente consistentes com os níveis importantes de CCT /Tric dentro dos extractos, verificou-se muito baixo em extrato de linha HL-60 de célula, ou seja, a linha de células que contém a maior quantidade de CCT /Tric, compare Figura 1 a Figura 2.

a quantidade de CCT /Tric em 18 cancro e um normal (MRC5-SV2) linhas celulares de extractos, preparados como descrito na secção de procedimentos experimentais, um homogenato de fígado de não-cancro (HNCL) e lisado de reticulócitos de coelho (RRL) foi determinada por comparação da intensidade CCTα medido para extractos de células diluída 4 e 16 vezes para a de quantidades conhecidas de CCTα (100, 50, 25, 12,5 ug /ml) migrou sobre o mesmo 12% de gel de poliacrilamida de SDS por Western blotting. Os valores médios da CCT /Tric nos diferentes extractos são expressos como uma função do total de proteínas dos extractos de conteúdo.

CCT /Tric actividade de dobragem nas linhas de células de cancro 18, a linha celular normal MRC5-SV2 e o fígado não-canceroso humano foi ensaiada utilizando [

35S] marcado com, desnaturado dobragem β-actina, tal como descrito na secção de procedimentos experimentais. Os produtos de reacção foram analisados ​​em géis de poliacrilamida não desnaturante 6%. CCT actividade específica /tric, derivado da quantificação das bandas de? -actina Intensidades é expressa como uma função da concentração de proteína total. As imagens gravadas, utilizando um Phosphorimager para [

35S] marcado com actina reacções de redobragem em tampão de renaturação, extractos celulares RRL, MIA-PaCa-2 e HeLa resolvidas num gel de poliacrilamida a 6% nativo, está representada na inserção.

expressão da CCT /Tric atividade moduladores

como o nível de expressão da CCT /Tric não se correlaciona com a sua actividade e para entender melhor como o último é modulada em células cancerosas, quantificamos CCT /Tric moduladores de actividade, prefoldin, Hop /P60 e PhLP3, nos lisados ​​celulares. Os dados apresentados na Figura 3A mostra que a concentração de HOP /p60 dentro das linhas de células utilizado é cerca de 0,4 ug /mg de proteínas totais, em média. Hop /p60 aparece sob-expresso na maioria das linhas celulares que utilizado quando o seu nível de expressão é normalizado para que no homogenato de fígado de não-cancro (HNCL) utilizado ao longo deste estudo (Figura S2). expressão Hop /p60 é o mais alto em MRC5-SV2, HCT116, PC3 e HL-60 linhas de células, uma vez que está em HNCL.

A quantidade de (A) Hop /p60, (B) PhLP3 e (C ) PFD em 18 de cancro e de uma linha normal (MRC5-SV2) linhas celulares de extractos, um fígado homogeneizado não cancerosa (HNCL) e lisado de reticulócitos de coelho (RRL) foi determinada por comparação do sinal de quimioluminescência registados para Hop /p60, PhLP3 e PFD em extractos de células diluída 4 e 16 vezes para a de quantidades conhecidas das proteínas sobre as mesmas transferências de Western.

CCT /Tric expressão também é rico em MRC5-SV2 e HL-60. Surpreendentemente no entanto, dado que Hop /p60 é um factor de troca do nucleótido esperado para favorecer CCT /dobragem Tric-mediada, a actividade de dobragem de extractos de células HL-60 e MRC5-SV2 é baixo. Da mesma forma, enquanto CCT /TRIC e concentrações /P60 de lúpulo são relativamente elevadas em extractos de células HCT116, a actividade de dobragem do extracto é entre os mais baixos. Concluímos a partir dessas observações que o nível de Hop /p60 expressão não é o único responsável de aumento ou diminuição da CCT /eficiência de dobragem de Tric-mediada. Nós portanto PhLP3 documentado, o antagonista funcional da Hop /p60, a expressão em linhas celulares de cancro foram utilizados. expressão PhLP3 varia significativamente de uma linha de células para outro. A proteína não foi detectada em 11 linhas celulares de cancro foram utilizados e de cerca de 0,03 mg /mg de proteínas totais (Figura 3B) em 8 de outras linhas celulares. Quando detectável, ao longo PhLP3 aparece expresso quando o seu nível de expressão é normalizado para que em HNCL (Figura S2). Aqui, novamente, não fomos capazes de correlacionar um alto nível de expressão PhLP3 com uma atividade de baixo CCT /Tric. Na verdade, a concentração PhLP3 está entre as mais altas PC3 e extratos de células MDA-MB-231 (Figura 3B), onde CCT /atividade Tric é das mais elevadas (Figura 2).

Finalmente quantificados prefoldin níveis de expressão como esta co-chaperona auxilia CCT /Tric em concentrações de proteína cliente de tamponamento no citosol e entregá-los para CCT /Tric. Prefoldin concentração varia muito pouco de uma célula para outra e é, em média, 2 ug /mg de proteínas totais (Figura 3C). Prefoldin nível de expressão é duas vezes menor do que a média no MIA-PaCa2, MRC5-SV2, HCT116, SH-SY5Y e extratos de células SK-OV-3 e é significativamente mais elevada do que a média na HL-60, K562, HeLa, KB, MDA -MB-231 e MCF-7 extractos celulares. Assim, existe uma correlação entre a atividade /Tric CCT eo nível de prefoldin expressão. A maior prefoldin é expressa, o menor a atividade do CCT /Tric é. Finalmente, é importante notar que PFD é expressa a níveis mais elevados em todas as linhas celulares de cancro, em comparação com HNCL (Figura S2). Uma vez que esta proteína é uma parte de um complexo composto de 6 subunidades, o número médio de partículas por célula activas varia 5-24 10

8 (Tabela S1).

A falta de correlação entre o aumento ou diminuição dos níveis de Hop /p60 e PhLP3 ea atividade /Tric CCT expressão sugere que este não é eficientemente modulada por estes polipeptídeos. Para certificar-se este é realmente o caso e entender melhor como Hop /p60 e PhLP3 afetar CCT atividade folding /Tric, examinamos as consequências do que empobrecem a imuno Hop /p60 ou PhLP3 de dois extratos de células arbitrariamente escolhidos: MIA-PaCa-2 ( Figura 4A) e OVCAR-8 (Figura 4C) sobre a atividade /Tric CCT. A imuno-depleção de lúpulo /p60 não teve nenhum efeito sobre a actividade CCT /TRIC (Figura 4B, D). Em contraste, PhLP3 imuno-esgotamento a partir de um extracto celular em que é expressa de forma significativa, tal como OVCAR-8, levou a uma diminuição dramática na actividade de CCT /TRIC (Figura 4B, D). Isto sugere fortemente que PhLP3 está fortemente envolvido na modulação /atividade Tric CCT.

CCT /Tric atividade dobrar em MIA-PACA-2 e (C) OVCAR-8 extractos celulares (A) antes e depois CCT /Tric , Hop /p60 ou PhLP3 imunodepleção foi testada usando [

35S] marcado com, desnaturados β-actina. A concentração de proteínas dos extractos de células MIA PaCa-2-e OVCAR-8, foi de 2,5 e 15 mg /ml, respectivamente. Nativo intensidade da banda β-actina foi medida utilizando um PhosphorImager. A quantidade de β-actina nativo medida após imunodepleção é expressa como uma fracção do valor medido para os extractos de células antes imunodepleção em (B) extractos de MIA-PaCa-2 e (D) OVCAR-8 de células.

Hsc /p70 Modular CCT /Tric Atividade

CCT /Tric coopera com outras chaperonas moleculares [2]. HSC 70 e Hsp70 (HSC /p70) têm sido mostrados para promover a proteínas de ligação ao cliente CCT /Tric por exemplo [34], [35]. Para determinar se os níveis Hsc /expressão de p70 que se correlacionam com a actividade da /Tric pac, as quantidades de Hsc /p70 nos extractos de linha celular de cancro foi utilizado ao longo deste estudo foram quantificados por Western blotting. As bandas doublet observados nos borrões origem no constitutiva (Hsc70, 73 kDa) e estresse forma induzida (Hsp70, 72 kDa) do acompanhante. Hsp70 aparece sobre-expresso nas linhas celulares foram utilizados como testemunhado pela intensidade das bandas mais claras sobre as transferências de Western. Isto sugere fortemente que a forma associada ao stress da chaperona é induzida em linhas celulares de cancro. A quantidade de Hsc /p70 nos diferentes extractos celulares que medida é de 5 ug /mg de proteínas totais, em média, excepto para MRC5-SV2, A549, K-562, MDA-MB-435S e KB linhas celulares onde Hsc concentração /p70 é 2 a 3 vezes maior e SH-5YSY onde é 2 vezes mais baixos (Figura 5). Do mesmo modo, na linha celular de adenocarcinoma de mama MCF7 e a linha celular de hepatocarcinoma HepG2, a HSC /p70 é de 7 a 12 vezes o valor médio. Finalmente, vale a pena notar que a HSC expressão /p70 é regulada positivamente em todas as linhas celulares de cancro com os níveis de expressão de longo alcance em células HepG2 160 dobra que dentro do homogenato de fígado de não-cancro (HNCL), utilizado como uma referência em células HepG2 (Figura 5).

a quantidade de Hsc /p70 em 18 de cancro e de uma linha normal (MRC5-SV2) linhas celulares de extractos, um homogenato de fígado (HNCL) e lisado de reticulócitos de coelho (RRL) foi determinada por comparação do sinal de quimioluminescência registados para Hsc /p70 em extractos de células diluída 4 e 16 vezes para a de quantidades conhecidas da proteína, nas mesmas manchas de Western. Os valores médios de Hsc /p70 nos diferentes extractos são expressos como uma função do total de proteínas conteúdo dos extratos.

Nossos resultados sugerem que CCT atividade /Tric é das mais baixas em linhas celulares expressando os mais altos níveis Hsc /p70 (compare CCT atividade /Tric às quantidades de Hsc /p70 em MCF7 HepG2 e K-562). Da mesma forma, CCT atividade /Tric aparece o mais elevado na linha de células extratos onde os níveis de Hsc /p70 são mais baixos do que a média (compare /atividade Tric CCT às quantidades de Hsc /p70 em MIA-PaCa-2, HCT15, PC-3, e MDA -MB-231). Este poderia muito bem ser a consequência de particionamento proteína cliente entre a HSC /p70 e CCT /Tric com maiores quantidades de proteínas clientes indisponíveis para ligação a CCT /Tric na presença de concentrações /p70 altos Hsc.

Para outro documento HSC /p70 e CCT cooperação /Tric no dobramento de proteínas, nós ensaiada atividade dobramento de proteínas cliente CCT /Tric em extratos de células de câncer seguinte HSC /p70 imunodepleção. Os dados apresentados na Figura 6 mostram claramente que CCT /Tric-mediada diminuições de dobragem de p-actina por mais de 65% em MIA-PaCa-2 e OVCAR-8 mediante Hsc /p70 imunodepleção. Estes resultados demonstram claramente que a HSC /p70 e CCT /Tric cooperar.

CCT /Tric-mediada marcado, desnaturado dobragem β-actina em extractos (A) MIA-PaCa-2 e de células OVCAR-8, antes e depois Hsc imunodepleção /p70. A concentração de proteínas dos extractos de células MIA PaCa-2-e OVCAR-8, foi de 2,5 e 15 mg /ml, respectivamente. Native intensidade da banda β-actina foi registrada usando um PhosphorImager. A quantidade de β-actina nativo medida após imunodepleção é expressa como uma fracção do valor medido para os extractos de células antes imunodepleção em (B) extractos de MIA-PaCa-2 e (C) OVCAR-8 de células.

as nossas observações são compatíveis com a visão de que proteínas clientes Hsc /p70 buffers CCT /Tric [36]. Na verdade, o imunodepleção de Hsc /p70 leva a uma redução da CCT /Tric piscina polipeptídeo cliente devido a uma diminuição da quantidade de proteínas clientes CCT /Tric disponíveis.

Discussão

CCT /Tric desempenha um papel central na proliferação celular através da sua capacidade para facilitar a dobragem de i) – as proteínas do citoesqueleto envolvidas em divisão celular, por exemplo, α, β e y-tubulinas [23], [15], [31], [25], a e p actins e centractin [14], [36], [25], ii) – oncoproteínas, tais como ciclina E [ ,,,0],22], a de Von Hippel-Lindau (VHL) proteína supressora de tumor [23], a ciclina B e p21

ras [24]. CCT expressão /Tric é, além disso, sobre-regulado durante a transição de fase G1 /S do ciclo celular [25] enquanto que a sua infra-regulação leva à inibição da proliferação celular, a diminuição na viabilidade celular, a paragem do ciclo celular e apoptose celular [26 ].

Para determinar se a actividade de CCT /Tric depende simplesmente do seu nível de expressão, foram comparados os níveis de expressão de TCR /TRIC em 18 linhas celulares de cancro humano, uma linha de células normais e de fígado humano normal. Mostrámos que a actividade de CCT /Tric nem sempre se correlaciona com o seu nível de expressão. Por conseguinte, quantificado CCT /moduladores de actividade TRIC em linhas celulares de cancro utilizadas ao longo deste estudo. Nós mostramos que Hop /p60 não é o único responsável de aumento ou diminuição da CCT /Tric-mediada eficiência dobrável. Da mesma forma, não fomos capazes de revelar uma correlação entre o nível de expressão PhLP3 ea atividade /Tric CCT nas linhas celulares onde a expressão PhLP3 foi detectável. Por conseguinte, quantificado os níveis de proteínas que auxiliam especificamente CCT /tricas, tais como prefoldin, ou proteínas clientes tampões piscina dentro do citoplasma, como Hsc /p70. Mostrámos que a maior prefoldin é expresso, menor a actividade de CCT /Tric é. Também mostraram que a atividade CCT /Tric é o mais alto na linha de células extrai onde os níveis de Hsc /p70 são os mais baixos. Estes resultados sugerem fortemente que a partição de proteínas clientes entre prefoldin e /ou Hsc /p70 e CCT /Tric. Na presença de alta prefoldin e /ou concentrações /p70 HSC, de uma fracção significativa de proteínas clientes são tamponados pelos chaperones moleculares últimos e não está disponível para a ligação ao CCT /Tric tempo quando prefoldin e /ou concentrações /p70 Hsc são baixos a fração de proteínas clientes ligados a CCT /Tric aumenta. Assim, as variações nos níveis de prefoldin e /ou Hsc /p70 expressão modular a disponibilidade de proteína de cliente para CCT /TRIC. Isto é ilustrado pela descoberta de que a depleção de imuno-Hsc /p70 piscina citosólica leva a uma depleção de proteínas sequestradas cliente e um decréscimo significativo na actividade constante CCT estado /TRIC. A constatação de que o número de CCT /TRIC e partículas prefoldin dentro do citossol das linhas celulares de cancro não diferem em mais de uma ordem de magnitude indicam quer que a máquina de dobragem evoluiu de tal modo que prefoldin e /ou função Hsc /p70 em CCT conjunto com, ou que a quantidade máxima de cliente polipéptidos a máquinas de dobragem pode armazenar /tampão e a célula pode acomodar é da mesma ordem de grandeza do que a de partículas de TCR /TRIC. Isto é particularmente verdadeiro no caso da piscina de polipeptídeos associados à prefoldin e /ou Hsc /p70 dentro do citoplasma representa a única fonte de proteínas clientes CCT /Tric.

No geral, nosso estudo revela uma interação funcional entre chaperones moleculares que possam representam uma modulação precisa da atividade /Tric CCT na proliferação celular através de mudanças nos níveis celulares de prefoldin e /ou Hsc /p70. Nossas observações demonstram também que a disponibilidade de proteína de cliente para CCT /Tric é o passo limitante que modula a actividade CCT /Tric. Na verdade, o aumento prefoldin e /ou /concentrações intracelulares p70 Hsc leva à diminuição da quantidade de proteínas clientes livres e neutralizar /atividade Tric CCT. Do mesmo modo, um aumento da quantidade de concentrações de proteína de cliente num determinado prefoldin e /ou Hsc /p70 rendimentos concentração proteínas clientes livres e restaura a actividade de CCT /TRIC. Assim, uma interacção tripartida entre CCT /tric, prefoldin e /ou Hsc /p70, por um lado, as proteínas do cliente, por outro lado, parece crucial para a modulação da proliferação celular, em particular, num contexto em que o citoesqueleto e proteínas onco que são críticos para a proliferação celular e viabilidade estão entre os principais clientes da CCT /Tric.

HSC /p70 co-chaperonas da família Hsp40 modular a interacção de Hsc /p70 com as suas proteínas clientes [37]. Por conseguinte, quantificado o nível de um dos principais membros da família Hsp40 indutíveis [38] em linhas celulares de cancro utilizadas ao longo deste estudo expressão. DNAJB1 nível de expressão é o mais elevado na MIA-PaCa-2, as células HT29 MDA-MB-231 e (não mostrado). Esta observação é consistente com um volume de negócios mais elevado de proteínas clientes Hsc /-bound p70 ea subsequente atividade CCT acima da média /Tric medidas para esses extratos.