Abstract

A maioria das células cancerosas expressam altos níveis de telomerase e proliferar indefinidamente. Para além da sua função de manutenção dos telómeros, a telomerase também tem uma função pró-sobrevivência resultando num aumento da resistência contra danos no ADN e diminuiu a indução de apoptose. No entanto, os mecanismos moleculares para esta função de proteção são ainda imperceptíveis e não está claro se ele está conectado a manutenção dos telômeros, ou é sim uma função não-telomérica da proteína telomerase, TERT. Recentemente, foi demonstrado que a subunidade da proteína de telomerase pode shuttle a partir do núcleo para a mitocôndria após o stress oxidativo onde se protege a função mitocondrial e reduz o stress oxidativo intracelular. Aqui, mostramos que a telomerase endógena (proteína TERT) transporta a partir do núcleo para dentro da mitocôndria sobre o stress oxidativo em células cancerosas e analisados ​​os padrões de exclusão nucleares de telomerase endógena após o tratamento com peróxido de hidrogénio em diferentes linhas celulares. populações de células excluídos TERT do núcleo sobre o estresse oxidativo de forma heterogênea. Encontramos uma correlação significativa entre a localização nuclear da telomerase e danos alta DNA, enquanto as células que excluíam telomerase do núcleo não apresentaram nenhuma ou dano muito baixo DNA. Nós modelado telomerase nuclear e mitocondrial usando organelo vectores de localização específicas e confirmou que a localização mitocondrial da telomerase protege o núcleo a partir do dano infligido ADN e apoptose, enquanto, em contraste, a localização nuclear da telomerase correlacionados com valores mais elevados de danos no ADN e apoptose. Sabe-se que os danos do ADN nuclear pode ser causado por espécies de oxigénio reactivas geradas as mitocôndrias (ROS). Nós demonstramos aqui que a localização mitocondrial de telomerase impede especificamente o dano ao DNA nuclear, diminuindo os níveis de ROS mitocondrial. Sugere-se que esta diminuição do estresse oxidativo pode ser uma causa possível para a alta resistência ao estresse das células cancerosas e pode ser especialmente importante para as células-tronco do câncer

Citation:. Singhapol C, Pal D, Czapiewski R, Porika M, Nelson G, Saretzki GC (2013) mitocondrial telomerase protege as células cancerosas de danos no DNA nuclear e apoptose. PLoS ONE 8 (1): e52989. doi: 10.1371 /journal.pone.0052989

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Agosto, 2012; Aceito: 27 de novembro de 2012; Publicação: 09 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Singhapol et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Chatchawan Singhapol foi financiado por uma bolsa de estudos do governo tailandês. Glyn Nelson foi apoiado pelo nr concessão BBSRC. BB /C008200 /1 (CISBAN). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Gabriele Saretzki é um PLOS ONE editor e membro do Conselho Editorial. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A telomerase é uma enzima mais conhecido por seu papel na manutenção dos telômeros. As células com expressão baixa ou nenhuma telomerase perde repetições dos telômeros durante a divisão celular, resultando eventualmente em senescência celular. A maioria das células de cancro, células germinativas e células estaminais embrionárias expressam altos níveis de telomerase, contribuindo assim para a imortalidade e pluripotência. A fim de manter a enzima telómeros precisa sua subunidade catalítica (TERT), bem como o componente de RNA (TERC ou TR), que contém o molde para a síntese dos telómeros.

Nos últimos anos, no entanto, a evidência acumulada que a telomerase , e em particular a sua TERT subunidade catalítica, está envolvida em várias funções não-telomere relacionados, tais como a regulação da expressão do gene, factores de crescimento e proliferação de células [1] – [6]. Além disso, vários grupos demonstraram que as lançadeiras TERT do núcleo e efectua a translocação para a mitocôndria após o stress exógeno [7] – [12]. Nós e outros demonstraram um papel protector da telomerase dentro da mitocôndria [10] – [12] enquanto que a incapacidade de vaivém da telomerase conduz ao stress celular, impede a imortalização e aumenta a sensibilidade contra o stress genotóxico, como mostrado recentemente por grupo Santos [13] – [ ,,,0],15].

a maioria das células cancerosas expressam altos níveis de telomerase, um requisito importante para a proliferação indefinida e imortalidade. Além disso, a telomerase contribui para a tumorigénese através de mecanismos dependentes não-telómeros que não são bem compreendidos ainda [16].

A telomerase foi, portanto, sugerida como sendo um importante alvo anti-cancro, com os primeiros ensaios clínicos da imetelstat inibidor de telomerase com sucesso em curso [17], [18]. A telomerase é regulada em vários níveis e localização subcelular é um deles. sobrevivência de células de cancro após tratamentos terapêuticos pode ser heterogéneo com algumas células que respondem ao tratamento, enquanto outros parecem ser resistentes, contribuindo para a sobrevivência de células de tumor. A melhor visão sobre as consequências biológicas de diferentes localizações subcelulares de TERT pode levar ao desenvolvimento de tratamentos mais eficazes anti-câncer.

Para a caracterização da exclusão de telomerase a partir do núcleo, a seu pedido estresse e encontrou um estresse heterogêneo resposta em populações de células de cancro. Importante, houve uma correlação notável entre a telomerase /TERT retida dentro do núcleo e dano de DNA de alta. Em contraste, as células que excluíam telomerase rapidamente a partir do núcleo ou não acumulado quantidades muito baixas de danos no ADN. Ao modelar as diferentes localizações subcelulares de telomerase utilizando vectores “Shooter” alvo organelos-demonstramos aqui que a telomerase mitocondrial impede danos nucleares de ADN, bem como a indução de apoptose após tratamento com H

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2 e irradiação. Sugerimos que a redução da geração de espécies de oxigénio reactivas mitocondriais (ROS) poderia ser o mecanismo subjacente para explicar como mitocondrial TERT evita danos no ADN nuclear.

Assim, a exclusão de telomerase a partir do núcleo, após o stress, tais como anti-cancro tratamento terapêutico pode ser um mecanismo de protecção que diminui o dano de ADN nuclear e apoptose, reduzindo o stress oxidativo dentro da mitocôndria. Isto pode contribuir para o aumento da resistência das referidas células cancerosas contra os diversos tratamentos anti-cancro.

Resultados e Discussão

vaivém subcelular da proteína TERT do núcleo para as mitocôndrias tinha sido mostrado anteriormente em vários tipos de células , células cancerosas, incluindo [7], [10] – [12]. Confirmámos esta vaivém da telomerase endógena após o H

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2 tratamento de células HeLa e MCF-7 (Fig. 1A) a partir do núcleo para a mitocôndria e quantificada a exclusão em comparação com células MRC-5 /hTERT (Tabela 1). A fim de avaliar a cinética de vaivém de TERT em mais detalhe foram analisados ​​3 linhas celulares, incluindo linhas celulares de cancro 2, bem como sobre-expressam hTERT MRC-5 de fibroblastos, e seguiu-os ao longo de 5 dias.

Exemplo rendeu projeções de volume 3D de imagens confocal deconvolved de células HeLa e MCF-7 não tratada (controle, painel da esquerda) ou tratadas com 400? M H

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2 para 3 horas (painel direito). O verde representa MitoTracker fluorescência verde, vermelho anti-TERT imuno-fluorescência e DNA nuclear azul (DAPI). co-localização marcada entre MitoTracker verde e TERT é exibido pela mistura vermelho-verde que está sendo exibido como o amarelo. B-D: cinética de localização TERT em 3 populações de linhas celulares após tratamento com 400 mM H

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2 mais de 5 dias. B: HeLa C: MCF7 D: MRC-5 /hTERT. barras pretas: Dissolveu nuclear, barras vermelhas: Dissolveu citoplasmática. Bares são médias ± SE de pelo menos 30 células por ponto de tempo e linha de células a partir de 3 experiências independentes.

Em todas as linhas 3 celulares exclusão TERT nuclear começou por volta de 45 minutos após o início do H

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2 tratamento. Em hTERT que sobre-expressam a exclusão fibroblastos atingiu o seu valor máximo de 60% após 3 horas ao mesmo tempo que levou ambas as linhas celulares de cancro de até um dia para chegar a um nível de exclusão de 50-60% (Fig. 1B-D). Isto corresponde bem com os dados de co-localização dos seus TERT mitocondrial imagens confocais a partir das linhas de células 3 (Tabela 1). Curiosamente, o nível de exclusão nuclear de 50-60% persistiu em todas as linhas de células 3 até 5 dias, os pontos de tempo mais longos analisados ​​(Fig. 1B-D e S1). Assim, a exclusão TERT nuclear é um processo bastante persistente, que pode durar até vários dias após uma única dose de bolus de 400? M H

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2. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que a cinética de exclusão TERT foi investigada em detalhe e comparada em três linhas de células diferentes ao longo de um prazo de 5 dias. A longa persistência de proteína TERT fora do núcleo nas linhas celulares de cancro pode ser um importante contribuinte para o aumento da resistência e diminuição da apoptose em células de cancro após tratamento medicamentoso ou irradiação em comparação com as células não cancerosas, o qual na maioria dos casos não expressam ou bastante baixos níveis de telomerase. Temos demonstrado anteriormente que a telomerase fibroblastos negativos são muito mais suscetíveis à apoptose após o tratamento com H

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2 e etoposídeo do que a sua telomerase sobre-expressar homólogos [10]. Nós também já tinha demonstrado [10] que a exclusão TERT do núcleo é reversível ao longo de um período de tempo de cerca de 10 dias. No entanto, não sabemos se a proteína TERT persistente dentro da mitocôndria vem sempre a partir do núcleo ou se a proteína TERT recém-sintetizado é importado diretamente para dentro da mitocôndria. Esta questão requer uma investigação mais aprofundada.

Em seguida, correlacionados exclusão telomerase para cada célula individual com o seu nível de danos no DNA em 3 horas após H

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2 tratamento. Foram quantificados o nível exclusão TERT para cada única célula quer como nuclear, se mais do que 75% de carbamato de terc total foi de no núcleo ou citoplasma /mitocondrial se mais do que 75% de carbamato de terc estava fora do núcleo com as células restantes, sendo classificados como um fenótipo intermediário.

Nós encontramos uma heterogeneidade clara de exclusão TERT nuclear entre as células dentro de uma população (Fig. 2A e S2A). Curiosamente, verificou-se que as células que tinham excluídos da telomerase 3 horas após o tratamento não mostraram nenhuma ou muito baixa danos de ADN, enquanto aqueles com telomerase nuclear tinha uma quantidade significativamente maior de danos no ADN nuclear em todas as 3 linhas de células (Fig. 2). Além disso, as células com um padrão de exclusão intermediária mostrou um nível de dano intermediária, ainda significativamente maior do que as células com telomerase completamente excluída, mas não significativamente diferentes daqueles com telomerase predominantemente nuclear. Estes dados sugerem que um elevado nível de exclusão nuclear ( 75%) e de localização mitocondrial TERT é necessária, a fim de exercer a sua função de protecção [10] – [15]. níveis de danos no DNA absolutos foram diferentes entre os 3 linhas de células com as duas linhas celulares de cancro que apresentam níveis de danos muito maiores do que TERT sobre-expressar fibroblastos. Nós também mediu as intensidades de sinal TERT absolutos para as 3 localizações diferentes e descobriu que o sinal TERT mitocondrial foi sempre menor do que no núcleo ou no estado intermediário (Fig. S2B). Ele tinha sido mostrado anteriormente que a nível de proteína TERT é regulada negativamente dentro da mitocôndria após H

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2 tratamento que poderia explicar esta observação [19].

enquanto telomerase mitocondrial impede. A-C: Imagens representativas de localização TERT (verde), e a coloração γH2A.X (vermelho). Azul: DAPI contraste nuclear A: HeLa B: MCF7 C: células MRC-5 /hTERT. As células foram tratadas durante 3 h com 400 ^ M H

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2. TERT localização foi determinada como descrito para a Figura 1B e agrupados em 3 categorias: TERT nuclear (N) TERT (C) e terc intermediário (I), localization. Exemplos para os 3 diferentes localizações estão indicadas com setas. D: Correlação entre a localização subcelular TERT e de DNA níveis de danos nucleares (Número de γH2A.X focos). Citoplasmática localização TERT se correlaciona com baixo dano DNA nuclear em todas as linhas de células 3, enquanto TERT nuclear de localização resulta em danos nucleares alta após 3 h de tratamento com 400 mM H

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2. Intermediários resultados TERT localização nos níveis de danos no DNA intermediários. Barras pretas: HeLa, barras vermelhas: MCF7, barras verdes: MRC-5 /hTERT. Barras são a média ± SE de pelo menos 40-100 células por linha de células em experiências repetidas. * P . 0,05

A correlação entre danos ao DNA mais elevada em células cancerosas e telomerase nuclearmente confinados incapaz de shuttle devido a uma mutação no seu sinal de exportação nuclear foi descrito recentemente por Kovalenko e colegas [13]. O TERT mutante induziu um aumento na telomérica espontânea, bem como danos no ADN nuclear não-telomérica em 2 linhas celulares de cancro em comparação com as mesmas células sem a TERT mutante [13]. Além disso, as células cancerosas com um grupo terc mutante que foi confinada ao núcleo e incapazes de transporte para o perderam a sua capacidade de proliferação, não foram capazes de formar colónias em agar mole e mostraram um aumento da quantidade de danos no ADN mitocondrial [13]. Juntos, estes resultados sugerem que a sub-celular de vaivém de TERT pode ter implicações importantes para a sensibilidade das células contra danos no ADN. Este aumento da resistência devido à alta expressão de telomerase e da exclusão nuclear de TERT poderia favorecer a sobrevivência de células-tronco cancerosas que podem resultar em recaída após o tratamento [17]. Existem também dados previamente publicados de um papel protector de carbamato de terc estaurosporina nuclear contra a apoptose induzida por [9]. No entanto, a estaurosporina é um inibidor da proteína-quinase que activa a apoptose de uma forma rápida sem induzir danos no ADN e independente das mitocôndrias. Sugerimos, portanto, um mecanismo de acção diferente em ambos os experimentos.

A seguir, modelou as diferentes localizações TERT separadamente por sobre-expressão vetores específicos organela nuclear e mitocondrial expressando a TERT subunidade catalítica da telomerase fundido a um myc-tag em 3 linhas celulares de cancro: HeLa, MCF7 e U87 de glioblastoma (Fig. 3). Transientemente transfectadas células foram tratadas quer com H

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2 ou irradiação e analisadas para o ADN γH2A.X focos danos e TERT localização usando o marcador myc fundida. A localização para mitocondrial (TERT Mito) e terc nuclear é mostrado na Fig. 3A e B (painéis superiores). Não houve diferença no ADN níveis de danos entre as células transfectadas com vector ou células de un-transfectadas antes do tratamento. No entanto, verificou-se que em todas as 3 linhas de células e os dois tratamentos, as células com uma localização mitocondrial TERT tinham significativamente menos danos no DNA em comparação com as células que sejam expressas TERT nuclear ou foram un-transfectadas (Fig. 3 A-D). A fim de excluir que a telomerase endógena interagiu com a proteína atirador TERT sobre-expresso que repetiu a experiência em um SV40 imortalizado linha de células MRC-5, que mantém seus telômeros através de um mecanismo de alongamento alternativa [20]. pós-irradiação, encontramos o mesmo efeito protetor da telomerase mitocondrial (Fig. 3 E). Nós também utilizado um anticorpo contra 53BP1, outra proteína envolvida na resposta a danos no ADN para confirmar os resultados que danificam o DNA focos são ricos em células transfectadas com tert nuclear, enquanto em contraste com as transfectadas com tert mitocondrial mostrar menos danos no ADN de células de un-transfectadas ( Fig. S3).

H

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2 tratamento, em comparação com a localização TERT nuclear em 4 linhas de células diferentes. A: vetores TERT específicos organela transfectado em células HeLa. Painel superior: imagens representativas de células transfectadas com vectores TERT atirador mitocondriais e nucleares com e sem tratamento com 200 mM H

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2 para 3 horas. coloração TERT (usando myc-tag) fundido com a proteína TERT (verde) e coloração γH2A.X (vermelho) para focos de danos no ADN. As setas indicam células transfectadas. painel inferior: Quantificação de células com altos níveis de DNA danos focos de células transfectadas e não-transfectadas com e sem H

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2 tratamento. As barras são médias ± DP de 3 experiências independentes, * P 0,05. B: vetores TERT específicos organela transfectadas em células MCF-7. Os painéis como descritos por A. C-F: A quantificação de células com níveis elevados de ADN de danos focos de células transfectadas e não-transfectadas com e sem irradiação-x. C: MCF7 após 20 Gy irradiação X. D: U87 após 20 Gy irradiação-X. E: MRC-5 /SV40 após 10 Gy irradiação-X. As barras são média ± DP de 3 experiências independentes. * P . 0,05

Uma vez que grandes quantidades de dano ao DNA nuclear são pensadas para diminuir a sobrevivência das células analisadas se os tratamentos de estresse utilizados também comprometeria a sobrevivência das células e induzir a apoptose. Nós tratada 3 linhas celulares transfectadas com ambos os vectores TERT shooter com H

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2 e X-irradiação e determinada indução de apoptose utilizando um anticorpo contra caspase ativada 3. Curiosamente, nem uma única célula transfectada com TERT mitocondrial mostrou qualquer sinal de apoptose, enquanto cerca de 20% das células transfectadas com un e entre 40-60% de células que expressam o atirador nucleares foram apoptótica (Fig. 4). Este resultado confirma que de fato o dano ao DNA induzido encontrada em células com impactos de localização TERT nuclear diretamente na célula de sobrevivência, enquanto TERT mitocondrial protege eficazmente contra a apoptose. A fim de elucidar o mecanismo pelo qual TERT mitocondrial pode proteger as células cancerosas de danos no ADN nuclear foi medida a quantidade de ROS mitocondrial após H

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2 de tratamento e irradiação utilizando coloração mitosox como uma medida da geração de superóxido mitocondrial além a myc-terc coloração para vectores “Shooter” nucleares e mitocondriais nas mesmas 3 linhas celulares de cancro (Fig. 5 a-e). Mitosox corante é absorvido pelas mitocôndrias num potencial de membrana de modo específico. A fim de excluir que o potencial de membrana diferente causado os efeitos, nós medimos potencial de membrana mitocondrial em células HeLa e MCF-7 transfectadas com ambos os atiradores TERT e comparou-os para as células un-transfectadas após H

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2 tratamento, bem como X -irradiação. De acordo com as nossas descobertas anteriores do aumento do potencial de membrana mitocondrial em células MRC-5 /hTERT comparado com fibroblastos parentais os resultados confirmam um potencial de membrana significativamente maior em células que sobre-expressam TERT mitocondrial, o qual é em células HeLa já evidente, mesmo antes de qualquer tratamento de stress (Fig. S4). Portanto, os níveis mitosox encontrados em nossos experimentos realmente representam diferentes níveis de ROS que dependem da localização TERT. Verificou-se que a sobre-expressão de TERT mitocondrial em todos os tipos de células resultou em níveis significativamente inferiores ROS depois H

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2 de tratamento e irradiação em comparação com as células de un-transfectadas ou aqueles que sobre-expressa TERT nuclear (Fig. S4 )

imagens representativas de caspase ativada 3 (mostrados em vermelho) em a:. Hela, B: MRC /SV40, C: células U87 transfectadas com TERT mito e TERT nuclear (myc-tag, mostrado em verde) depois de 400? M H

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2 tratamento para 3 h ou irradiação com 20 Gy. D: A quantificação da percentagem de células apoptóticas das linhas celulares após 3 H

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2 tratamento, E: A quantificação da percentagem de células apoptóticas das 3 linhas de células após a irradiação com raios X. Bares presente média e erro padrão de cerca de 45 células transfectadas por condição e linha de células. * P 0,05

Painel superior:. Imagens representativas de coloração ROS (vermelho, mitosox) e localização TERT (myc-tag, verde) após organela transfecção TERT específica e 100 M H

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2 tratamento durante 3 h, em células HeLa. linha superior: TERT mito-, inferior consecutivas: TERT nuclear. As setas indicam células transfectadas. painel inferior: Quantificação dos níveis de ROS medidos em percentagem do mitosox área positiva do citoplasma inteira usando ImageJ em células transfectadas e un-transf. B: células MCF-7, painéis como descritos para A. C: quantificação de ROS em células U87 após 3 h de 100 M H

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2 tratamento. D-F: A quantificação de níveis de ROS após irradiação-X. D: MCF7 após 20 Gy irradiação-X. E: U87 após 20 Gy irradiação-X F: MRC-5 /SV40 após 10 Gy irradiação-X. Barras representam a média ± SE de 3 experiências independentes. * P . 0,05

Novamente usamos células /SV40-5 MRC sem telomerase endógena para confirmar os resultados das linhas de células de câncer de 3 e encontrou o mesmo efeito protetor do TERT mitocôndrias localizadas nos níveis de ROS ( Fig. 5F). níveis de ROS em células que expressam o TERT “shooter” nuclear eram geralmente não diferentes das células un-transfectadas com excepção de MCF7 e as células MRC-5 /SV40 após a irradiação, onde as células transfectadas atirador nuclear apresentaram menores níveis de ROS que as células un-transf.

Estes dados sugerem que pelo vaivém em telomerase mitocôndrias /TERT não só protege a organela, mas diminuindo a produção de superóxido mitocondrial protege também indirectamente pelo núcleo de danos no DNA. Observações semelhantes de telomerase vaivém do nucleoplasma para nucléolo tinha sido relatado anteriormente sob radiação ionizante em células primárias e câncer [21]. Os autores especularam que a telomerase pode interferir negativamente com enzimas de reparo no núcleo em condições de aumento de danos ao DNA e estresse. Os nossos resultados parecem suportar esta sugestão que a telomerase pode ser “indesejável” dentro do núcleo, sob condições de dano de ADN. Telomerase foi mostrado para “curar” cromossomos, tentando uma forma de reparação do DNA pela adição de sequências dos telômeros para quebrado extremidades dos telômeros [22]. No entanto, este pode não levar à reparação do ADN apropriada, tal como é conhecida para ser levada a cabo pelos verdadeiros sistemas de reparo de ADN.

Os nossos resultados demonstram que a localização da telomerase mitocondrial diminui especificamente geração de ROS mitocondrial e stress oxidativo celular após a indução do stress exógeno gerado por H

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2 ou irradiação em células de cancro e poderia, assim, evitar danos ao ADN nuclear. Também poderia explicar por vaivém de telomerase a partir do núcleo para as mitocôndrias parece promover a sobrevivência celular, enquanto que em células em que a telomerase não é capaz de deixar a acumulação de danos do ADN núcleo é observado.

Diehn e colegas relataram recentemente que o cancro células que produziam menos ROS devido à maior expressão antioxidante acumularam menos danos no DNA após a radiação [23] ionizante-tronco. Seria interessante determinar se estas células têm também a telomerase excluídos mais do que as células estaminais não cancerígenas após a irradiação. Tem sido demonstrado que as células estaminais cancro expressam actividade de nível elevado de telomerase; no entanto nada se sabe sobre TERT vaivém nestas células [24].

Temos demonstrado anteriormente que a geração de ROS exógena por irradiação em fibroblastos danos mitocôndrias e acelera o dano ao DNA nuclear criando um ciclo de feedback positivo [25]. Sugerimos que uma interacção funcional entre tais mitocôndria e o núcleo também existe nas células cancerosas e as células positivas de telomerase outro, onde entra a telomerase mitocôndrias, a fim de diminuir de ROS, que são induzidos por fármacos quimioterápicos e irradiação. Assim, parece que os tratamentos anti-câncer pode induzir um romance, até então mecanismo desconhecido de vaivém telomerase que impede danos no DNA nuclear, diminuindo a geração de ROS mitocondrial via indução de vaivém telomerase. Devido ao seu padrão heterogêneo que poderia também explicar a resistência de alguns, mas não todos, as células cancerosas contra tratamentos terapêuticos.

Materiais e Métodos

Células

HeLa, MCF7, células MRC5 e U87 /SV40 originado a partir de ATCC. MRC5 foram adquiridos a partir de ECACC (Londres). a sobre-expressão de hTERT foi realizada utilizando transfecção retroviral de hTERT como descrito anteriormente [10]. U 87 e MRC5 /SV40 células foram cultivadas em MEM e DMEM suplementado com, respectivamente, 1% de ácido não essencial amino, 10% de FCS (Sigma), glutamina 2 mM e 1% de penicilina /estreptomicina. Todos os outros tipos de células foram cultivadas em DMEM (PAA) contendo 10% de FCS (Sigma), 1% de penicilina /estreptomicina (PAA) e glutamato 2 mM (Gibco). As células foram incubadas a 37 ° C em ambiente de oxigénio e 5% de CO

2.

Tratamentos

As células foram semeadas 1 ou 2 dias antes do tratamento em 19 lamelas mm em placas de 12 poços para a coloração imuno-fluorescência (5 × 10

4 por poço).

H

2 tratamento 2O (Sigma) foram realizados em meio isento de soro durante os tempos e as concentrações indicadas. O H usado

2O

2 concentrações tinha sido otimizado para cada tipo diferente de experiência. X-irradiação a 10 e 20 Gy, foi realizada utilizando um Faxitron (Elektron Tecnologia, Reino Unido). Para todas as experiências de irradiação (excepto análise apoptose), as células foram fixadas e analisadas 20 minutos após o tratamento. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min.

Coloração imuno-fluorescência e imagem

As células foram fixadas em lamelas usando 4% de paraformaldeído durante 10 min. imuno-coloração simples ou dupla foi realizada com os seguintes anticorpos primários: rato γH2A.X (Upstate), anticorpo de coelho anti-terc (Rockland), de coelho anti-Ki67 (Abcam) e anti-myc tag (Abcam). A especificidade e ausência de coloração do anticorpo utilizado TERT fundo foi confirmada (Fig. S5). anticorpos secundários foram: cabra anti-rato e coelho AlexaFluor 594 e 488 (Molecular Probes /Invitrogen). A coloração nuclear foi observada utilizando DAPI. Imagens para cada canal foram obtidas usando um microscópio de AxioImager Z1 (Zeiss) equipado com cubos de filtro adequado para espectralmente distinguir AlexaFluor

488 e AlexaFluor

594, garantir a ausência de exsudação em /a partir de qualquer fluoróforo (estabelecido anteriormente, os dados não mostrados) . As imagens foram posteriormente analisados ​​utilizando o ImageJ. Limiares foram definidos para cada imagem individualmente.

confocal microscopia de fluorescência e co-localização Análise

As células foram carregadas com 400 nM verde MitoTracker (sondas moleculares) durante 30 minutos a 37 ° C antes da fixação e em seguida, coradas com anticorpo anti-terc Fluor® e Alexa 594. as imagens foram capturadas usando uma Zeiss LSM 510 equipado com um 63 × 1,4 objectivo nA com o conjunto de orifício para uma unidade de Airy (Zeiss, Alemanha). pilhas Z foram obtidos todos os 100 nm para cada célula (amostragem 2 × critério de Nyquist). As imagens foram deconvolved e depois analisada para co-localização de objeto em 3D usando software Huygens (SVI, Países Baixos). Para a análise de co-localização e preparação da imagem, as imagens deconvolved foram fundidas em 3 volumes tridimensionais. células individuais foram isolados dentro da imagem e, objetos unificadas individuais (mitocondriais e terc) foram identificados usando ‘co-localização de objeto’ em Huygens com um cut-off de excluir quaisquer objetos menores do que uma mitocôndria no canal verde MitoTracker. Huygens, em seguida, calculado coefficent de correlação de Pearson para cada célula de 3 co-localização dimensional entre mitocôndrias e coloração Terc. Isto permitiu-nos para prever com precisão verdadeira co-localização (dentro dos limites da limitação de difração) dos dois corantes independentemente dos seus diferentes comprimentos de onda.

Organela específico transfecção

TERT contendo vetores específicos organela nuclear e mitocondrial ( pCMV-myc-mitoTERT e pCMV-myc-nucTERT foram um presente amável de J. Haendeler e Joachim Altschmied, Duesseldorf, Alemanha e descrito anteriormente [9], [11]). transfecção transiente foi realizada utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, EUA) de MITO-TERT e nuc-hTERT vectores “Shooter”. As eficiências médias de transfecção 48 horas após a transfecção foram entre 25 e 30%. células transitoriamente transfectadas foram tratadas 2 dias após a transfecção, quer com H

2O

2 ou irradiação.

Determinação da ROS Nível

As células foram coradas com 5 mM mitosox (Invitrogen, EUA ) durante 15 min, depois H

2O

2 ou o tratamento de irradiação antes da fixação e coloração com anticorpo. níveis de ROS foram determinados como a percentagem de sinal mitosox citoplasmática do total da área citoplasmática usando o Image J (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Análise de DNA danos

Análise de danos do ADN foi realizada utilizando imuno-fluorescência, quer como uma única coloração com γ-H2A.X ou coloração dupla com tert. As células foram fixadas, permeabilizadas com PBG (PBS, BSA, Fishskin gelatina e 0,5% de triton) e anticorpo γ-H2A.X foi aplicada às células e, em seguida, corado com Alexa 594. Fluor® anti-myc tag e Alexa 488 foram Fluor® usado para visualizar proteína TERT transfectadas. As lâminas foram examinadas utilizando um microscópio de fluorescência Zeiss Axiovision (Zeiss, Alemanha). Para a análise do DNA danificar o número de focos de dano ao DNA foi contado para cada tipo de localização TERT separadamente de 20-40 células por linha de grupo e celular.

Medição de TERT Exclusão Taxa

Para cada célula individual, TERT localização foi quantificada manualmente comparando os sinais de telomerase dentro e fora do núcleo usando a imagem áreas J. subcelulares foram determinados para as regiões nucleares e citosólicos usando seleção à mão livre. sinais de expressão na área selecionada foram avaliados usando a função de cálculo da área após limiarizar para remover o ruído. O resultado de cada célula individual indicou uma percentagem do sinal de TERT expressa no compartimento subcelular:

expressão nuclear TERT% = sinal na área TERT núcleo /sinal total TERT × 100,

% TERT citoplasmática expressão = sinal de TERT na área citosólica sinal TERT /total × 100. O percentual médio de localização nuclear e citoplasmática de TERT de pelo menos 30 células individuais foi feita para determinar a percentagem média de toda a população.

Correlation of Cellular TERT Localização e DNA nível de dano

classificada a localização de TERT em 3 classes: Dissolveu nuclear (N): 75% -100% de sinal TERT reside no interior do núcleo, terc citoplasmático (C): 75% -100% de sinal TERT reside fora do núcleo e todas as outras percentagens para a classe de localização intermédia (I). Para cada uma das 3 classes foi determinado o número de γH2A.X focos de cerca de 40-100 células por linha de células.

Análise da apoptose

Hela, U87 e células /SV40 MRC foram transfectadas com atirador TERT nuclear e mitocondrial. Após 2 dias, eles foram tratados com 400 mM H

2O

2 ou 20 irradiação Gy e partiu para mais um dia (U87 e MRC /SV40) ou 2 dias para HeLa devido a um atraso conhecido na indução de apoptose em estas células. Após as células de fixação foram coradas com myc-tag para TERT e activado de caspase 3 (Abcam), a fim de marcar as células apoptóticas. Os resultados foram determinados a partir de 30-150 células transfectadas por linha celular e condição.

Estatísticas

Uma maneira ANOVA foi realizada utilizando Sigma Plot (Systat Software Inc, EUA).

Informações de Apoio

Figura S1.

Immuno-blot da fracção nuclear e mitocondrial em células HeLa e MCF-7 tratadas com 400 uM H

2O

2 durante 5 dias.