Abstract

Embora os protocolos atuais anti-câncer são, efeitos colaterais razoavelmente eficazes associadas ao tratamento a longo prazo, induzidas pela falta de especificidade dos procedimentos anti-câncer, continuam a ser um problema desafiador em oncologia pediátrica. TAT-RasGAP

317-326 é um péptido de células-permeável RasGAP-derivado que actua como um sensibilizador para vários tratamentos anti-cancro nas células tumorais adultos. No presente estudo, avaliou-se o efeito de TAT-RasGAP

317-326 em várias linhas celulares de cancro da infância. A morte celular induzida por péptidos RasGAP derivada foi analisada em vários neuroblastoma, sarcoma de Ewing e linhas de células de leucemia (bem como em linfócitos normais). A morte celular foi avaliada utilizando métodos de citometria de fluxo, na ausência ou na presença do péptido em combinação com vários genotoxinas utilizados em clínicas (4-hydroperoxycyclophosphamide, etoposido, vincristina e doxorrubicina). Todos testados tumores pediátricos, em resposta a, pelo menos, um genotoxin, foram sensibilizados por TAT-RasGAP

317-326. O péptido-RasGAP derivado não aumentou a morte celular de linfócitos normais, sozinho ou em combinação com a maioria das quimioterapias testados. Consequentemente, TAT-RasGAP

317-326 podem beneficiar crianças com tumores, aumentando a eficácia de terapias anti-câncer nomeadamente permitindo reduções de dosagem da droga anti-câncer e os efeitos colaterais induzidos por drogas associadas.

citação: Chevalier N, Gross N, avaliação da actividade quimio-sensibilização da TAT-RasGAP

317-326 em cânceres infantis Widmann C (2015). PLoS ONE 10 (3): e0120487. doi: 10.1371 /journal.pone.0120487

Editor do Academic: Salvatore Papa, Institute of Hepatology – Birkbeck, University of London, Reino Unido

Recebido: 03 de outubro de 2014; Aceito: 23 de janeiro de 2015; Publicação: 31 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Chevalier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Os dados relativos os perfis de arrayCGH das linhas de células derivadas NB1 neuroblastoma foram obtidos de um terceiro: Dr. Aurélie Coulon ([email protected]) da Unidade de Oncologia pediátrica Research, University Hospital Center (CHUV), Lausanne, Suíça) onde os leitores podem enviar pedidos de dados

Financiamento:. O financiamento fornecida pela força fundação – https://www.force-fondation.ch/(NC NG); comunhão MD-PhD pela Swiss National Science Foundation (n ° 158116) (NC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro representa a segunda causa de morte em crianças após acidentes em países industrializados [1, 2]. Nossa compreensão do câncer na infância tem beneficiado de avanços significativos ao longo dos últimos quatro décadas. Os tratamentos padrão para curar tumor pediátrico incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia intensiva multi-agente como etoposídeo, vincristina, doxorrubicina e ciclofosfamida [3].

Nos países desenvolvidos, oitenta por cento das crianças que são diagnosticadas com câncer são esperados para sobreviver dentro de 5 anos após o tratamento. No entanto, a maior parte deles sofrem de doenças crónicas de 40 anos de idade [4]. vigilância alargada dos sobreviventes de câncer pediátrico mostra um alto risco de efeitos tardios que ameaçam a vida de segundas neoplasias, doenças cardíacas e doenças pulmonares [5, 6]. O risco de mortalidade precoce é principalmente determinado por factores específicos de tratamento, tais como a dose cumulativa de quimioterapia [7]. Por conseguinte, os efeitos colaterais a longo prazo associados com o tratamento induzidas por danos nas células não tumorais são um problema desafiante e permanecem em grande parte por resolver. Como as crianças são por sobreviventes definição a longo prazo, há uma forte necessidade de desenvolver baixa toxicidade, melhor orientada e eficiente de novas estratégias terapêuticas para todos os tipos de cânceres infantis [8]. Estratégias para contornar tais obstáculos incluem a melhoria da anti-câncer droga sensibilidade e especificidade para as células cancerosas [9-11].

Neste contexto, nós relatado anteriormente que um peptídeo de células-permeável derivado da proteína p120 RasGAP , chamado TAT-RasGAP

317-326, é um tumor-sensibilizador a várias drogas anti-câncer. Na verdade, embora ele não mostra qualquer toxicidade para as células em seu próprio país, de forma eficiente e, especificamente, sensibiliza células tumorais adultos

in vitro

e

in vivo

a várias terapias anti-câncer, incluindo quimioterapia [ ,,,0],12,13], e a terapia fotodinâmica [14]. É importante notar que exibe especificidade para as células cancerosas, uma vez que não sensibiliza células não tumorais induzida por genotoxin a apoptose [12, 14]. TAT-RasGAP

317-326 parece ter atividades anti-cancro adicionais do que a sensibilização de células tumorais como tem sido demonstrado recentemente que este péptido pode dificultar a migração celular e invasão

in vitro

[15, 16] e que esta atividade pode inibir o processo de metastatização

in vivo

[17]. Isto indica que o péptido RasGAP derivado tem a capacidade de actuar como um composto anti-metastático na parte superior dos seus efeitos de sensibilização do tumor. Recentemente, tem sido demonstrado que as propriedades anti-cancro de TAT-RasGAP

317-326 são dependentes de dois resíduos de triptofano na posição 317 e 319 [16]. No entanto, o modo de acção de TAT-RasGAP

317-326 não está completamente caracterizada. Foi previamente mostrado que este péptido não favorece a morte de células tumorais por modulação da actividade de Ras, as vias de sinalização MAPK, a actividade transcricional de NF-kB, os níveis de proteína Akt e estado de fosforilação [18, 19]. Além disso, os membros da família Bcl-2, que regulam a morte celular dependente de mitocondrial, foram mostradas para ser individualmente dispensável para a actividade de sensibilização do péptido [20].

O efeito deste péptido no cancro da infância é no entanto não conhecido. A biologia molecular de tumores pediátricos é distinto de cancros em adultos de muitas maneiras. Como a gênese da maioria dos cancros da infância parece vir de perturbações de desenvolvimento precoce normal, eles acumulam menos mutações do que tumores de adultos. Por outro lado, parece que o desenvolvimento de tumores pediátricos dependem fortemente de modificações epigenética [21-23]. No presente estudo, temos, portanto, investigou se TAT-RasGAP

317-326 foi capaz de tornar os tumores da infância mais sensíveis às drogas anti-tumorais clinicamente relevantes.

Métodos

As linhas celulares e células de cultura de

a CCRF-CEM [24], THP-1 [25] e A673 [26] as linhas celulares foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (CRL-8436 referências, TIB-202 , CRL-1598, respectivamente). A LAN-1 [27] e M-07e [28] linhas de células foram obtidas a partir do Leibniz Institute Coleção DSMZ-Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (referências ACC655, ACC104 respectivamente). A PE-11 [29], TC252 [30] e NB1-derivado [31] As linhas celulares foram descritos anteriormente. Todas as linhas celulares foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C. As linhas celulares de neuroblastoma (LAN-1, NB1-FBS, NB1-FBS a-Re) e a linha celular de sarcoma EW-11 Ewing foram cultivadas em Dulbecco Eagle Médium modificado (DMEM) (Gibco, Paisley, Reino Unido) contendo 10% de bovino fetal soro (FBS) (Gibco). As células de tumor de neuroblastoma primário NB1-NBM foram mantidas em meio de base neural feita de DMEM /F12 (Gibco) suplementado com 2% B27 suplemento isento de soro (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng /de factor de crescimento básico de fibroblastos recombinante humano ml ( bFGF) (Peprotech), e factor de 20 ng /mL de recombinante humana de crescimento epidérmico (EGF) (Peprotech). células de sarcoma A CCRF-CEM e THP-1 linhas celulares de leucemia aguda, e o A673 e TC252 Ewing, foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) contendo 10% de FBS. M07e, uma linha celular de leucemia mielóide aguda, foi mantida no mínimo alfa Meio Essencial (MEMα) (Gibco) suplementado com 10% de FBS e 5 ng /ml de recombinante humano de macrófagos de granulócitos factor estimulador de colónias (GM-CSF) (Peprotech). linfócitos do sangue periférico humano (PBL) foram isolados por centrifugação de densidade ao longo de um gradiente de Ficoll-Paque (Lymphoprep; StemCell Technologies) a partir de crostas inflamatórias de dadores humanos saudáveis, obtidos a partir do estado de serviço de transfusão de sangue Vaud. Os doadores deram consentimento por escrito para uso potencial de seu sangue para a investigação médica. Os PBLs foram cultivados em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 8% de soro humano reunido e suplementado com 100 U /ml de recombinante humano IL-2 (Proleukin, Roche Pharma AG).

Chemicals

os fármacos utilizados eram vincristina (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA), etoposido (Sigma-Aldrich), 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC) (Niomech, Bielefeld, Alemanha) e doxorrubicina (Pfizer AG, Zurique, Suíça). A coloração utilizado para realizar a citometria de fluxo foram aminoactinomycin 7-D (7-AAD) e anexina V-FITC (kit de anexina V-FITC /7-AAD, Beckman Coulter, Miami, EUA).

Síntese peptídica

TAT-RasGAP

317-326 (GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD), TAT

48-57 (a partir de agora referido como TAT) (GRKKRRQRRR), TAT-Scrambled (GRKKRRQRRRGGWLDMTTVNRW) e TAT-Mutante (GRKKRRQRRRGGAMWVTNLRTD ) foram sintetizados no Departamento de Bioquímica da Universidade de Lausanne, Suíça como descrito anteriormente [12].

citotóxica ensaio

Para as células que crescem em suspensão (THP-1, M07e, CCRF-CEM , e linfócitos) e trezentos mil células foram semeadas em placas de 6 poços e directamente tratados com as doses indicadas de 4-HC, et opôs ido, vincristina, ou doxorrubicina na presença ou na ausência de 10 uM de TAT-RasGAP

317-326, TAT, TAT-mexidos ou TAT-mutado. Para as linhas de células aderentes (NB1 nbm, NB1-FBS, NB1-FBS a-Re, LAN-1, EW-11, TC252, e A673), duzentos mil células foram deixadas aderir durante 48 horas em placas de 6 poços e foram então tratados como células de crescimento em suspensão. Vinte e quatro horas após a incubação da droga, as células foram sujeitas a citometria de fluxo para avaliar a morte celular. Resumidamente, as linhas de células aderentes foram separadas por tripsina-EDTA (Gibco) e as suspensões unicelulares foram processados ​​e corados com 1 ug /ml de 7-AAD e 50 ng /ml de anexina V-FITC em 500 ul de tampão de ligação. Foram analisados ​​Um mínimo de dez mil células. O sinal derivado de corante 7-AAD não pode ser utilizado quando as células foram tratadas com doxorrubicina porque 7-AAD e doxorrubicina tem propriedades fluorescentes semelhantes (7-AAD de onda de emissão: 525 nm; comprimento de onda de emissão de doxorubicina: 530 nm [32]).

A análise estatística

A menos que indicado em contrário, todos os experimentos foram obtidos a partir de três ou mais experiências independentes. Os resultados foram expressos como médias ± intervalos de confiança de 95%. A significância foi avaliada usando t-testes realizados com o Microsoft Excel 2010 seguido de correções de Bonferroni (isto é, as diferenças foram consideradas significativas quando os valores p 0,05 /n, onde n é o número de comparações feitas). Asteriscos representam diferenças estatisticamente significativas. Na última figura, a significância foi avaliada por ANOVAs one-way, seguido por testes de Bonferroni (Dunn) t post-hoc utilizando o software SAS 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados

neste estudo, foram analisados ​​três tipos de cânceres infantis: neuroblastoma, leucemia e sarcoma de Ewing. Entre neoplasias da infância, o neuroblastoma é o mais frequente de câncer sólido extracraniana. Mortes resultantes de conta neuroblastoma por 15% de toda a morte relacionada com tumor em crianças [33]. multirresistência, adquirida durante a exposição às quimioterapias, desempenha um papel importante neste resultado ruim [34, 35]. A leucemia é o tipo de câncer infantil mais comum e representa um terço de todos os tumores pediátricos [36]. Apesar de ser menos prevalente do que a leucemia, sarcoma de Ewing é um câncer agressivo com um prognóstico pobre e uma alta taxa de recaída com doença metastática [37]. As drogas utilizadas aqui são todos usados ​​nas clínicas. As suas propriedades são apresentadas na Tabela 1.

TAT-RasGAP

317-326 sensibiliza linfoblástica aguda e células de leucemia mielóide com vários agentes quimioterapêuticos sem mostrar qualquer efeito em relação às células tumorais, por si só

para investigar o efeito de sensibilização de TAT-RasGAP

317-326 em células de leucemia, três linhas de células diferentes foram submetidas a concentrações crescentes de agentes citostáticos na ausência ou na presença de 10 uM TAT-RasGAP

317 -326. O etoposido, vincristina, doxorrubicina, e 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC), a forma activa de ciclofosfamida, foram os fármacos utilizados aqui e estão cada actualmente empregues na prática clínica. A morte celular foi avaliada utilizando 7-AAD que rotula células mortas que permeabilizadas membrana de plasma e com anexina V se liga a fosfatidilserina que exposta nas células mortas. Algumas das drogas anti-cancro aqui utilizados induziram uma aparência concomitante dos sinais de 7-AAD e anexina V (Figura 1A mostra o caso representativo de 4-HC). Em outras palavras, logo que uma célula tornou-Anexina V positiva é também levantado o corante de 7-AAD. Por isso, nas nossas mãos, drogas anti-cancerosas, tais como 4-HC induzida necrose um tipo semelhante de morte. Nas figuras seguintes, os dados de 7-AAD são relatados como nós encontrado para ser associado com um desvio menor do que aqueles obtidos com coloração Anexina V (Figura 1B). A única exceção foi quando foi usada a doxorrubicina. Na verdade, este corante fluorescente em comprimentos de onda semelhantes aos 7 ADD. Neste caso, portanto, os dados de anexina V são apresentados. Estas experiências revelaram que TAT-RasGAP

317-326 sensibiliza significativamente células de leucemia para quase todos os fármacos testados (Fig 2A). No entanto, em determinadas condições (por exemplo, quando as células THP-1 são tratados com vincristina) células tumorais não respondem bem à TAT-RasGAP

317-326. Um efeito de sensibilização limitada do péptido RasGAP derivado não é necessariamente uma consequência da resistência intrínseca a uma droga como a linha celular CCRF-CEM, que é resistente à vincristina-, foi eficientemente sensibilizados por TAT-RasGAP

317-326. Este ponto é de particular relevância clínica, pois indica que TAT-RasGAP

317-326 pode exercer um efeito de sensibilização nas células quimio-resistentes.

A. Trezentos mil células CCRF-CEM foram semeadas em placas de 6 poços e directamente tratado com 50 uM 4-HC. A morte celular foi avaliada após vários pontos no tempo (0, 3, 6, 12 e 24 horas), utilizando 7-AAD e coloração de anexina V-FITC. B. células CCRF-CEM foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas directamente com as doses indicadas de 4-HC, et opôs ido ou vincristina, na presença ou na ausência de 10 uM de TAT-RasGAP

317-326. Após 24 horas de incubação da droga, 7-AAD e coloração de anexina V-FITC foi realizada para avaliar a morte celular. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide.

A. Duas linhas de leucemia mielóide aguda de células (células THP-1 e H-07e) e uma linha celular de leucemia linfoblástica aguda T (CCRF-CEM) foram semeadas em placas de 6 poços e directamente tratada com 4-HC, et opôs ido, a vincristina ou doxorrubicina na concentrações indicadas, na presença ou na ausência de 10 uM de TAT-RasGAP

317-326. Após 24 horas de incubação da droga, 7-AAD ou de coloração de anexina V-FITC foi realizada para avaliar a morte celular (últimas quatro colunas). Alternativamente (primeira coluna), as células foram tratadas com concentrações crescentes de TAT ou TAT-RasGAP

317-326 sozinho. Após 24 horas, a avaliação de morte celular foi realizado utilizando a coloração de 7-AAD. B. Isolado linfócitos de três indivíduos saudáveis ​​distintas foram tratados tal como descrito na Fig. 2A. As dosagens de agentes quimioterapêuticos utilizados para tratar os linfócitos saudáveis ​​dos três indivíduos são semelhantes aos utilizados para tratar as células de LLA-T CCRF-CEM. Note-se que os gráficos são derivados das experiências individuais onde os linfócitos são imediatamente usados ​​após o seu isolamento (se cultivados

in vitro

, eles iriam experimentar altos níveis de apoptose espontânea que impediriam medição precisa da droga e peptídeo anti-câncer morte induzida). T-ALL, leucemia linfoblástica aguda T-; AML, leucemia mieloide aguda; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P . 0,05 teste t de Bonferroni, após correcção

TAT-RasGAP

317-326 por si só não induziu morte celular em linhas celulares de leucemia testadas, mesmo a uma de duas vezes maior concentração (20 pM) do que a utilizada para induzir um efeito de sensibilização (10 pM) (Fig 2A).

TAT-RasGAP

317-326 não exibe toxicidade para com os linfócitos não tumorais a partir de indivíduos saudáveis .

foi mostrado anteriormente usando não tumoral imortalizada queratinócitos humanos (HaCaT) e endotélio vascular umbilical (HUV-EC-C), as células que os péptidos TAT-RasGAP

317-326, em combinação com vários genotoxinas, não sensibilizaram células não tumorais [12]. No presente estudo, utilizou-se linfócitos isolados a partir de sangue inteiro de pacientes saudáveis ​​para investigar a selectividade do péptido RasGAP-derivado para as células cancerosas. Utilizou-se as mesmas doses de agentes quimioterapêuticos para o tratamento de linfócitos saudáveis ​​como os utilizados para tratar a linha de células CCRF-CEM, T-leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) (figura 2A). Figura 2B mostra a resposta de linfócitos de sangue periférico (PBL) derivada a partir de três indivíduos saudáveis ​​diferentes (indivíduos A-C) para o péptido-RasGAP derivado em combinação ou não com os genotoxinas utilizados na Fig 2A. O peptídeo RasGAP derivado por si só não apresenta nenhuma toxicidade para os PBL. A sensibilidade dos linfócitos não tumorais para as quimioterapias testados isoladamente foi semelhante para a sensibilidade da linha celular CCRF-CEM (mesmo ligeiramente aumentada, no caso da doxorubicina para os indivíduos saudáveis ​​A e C). A observação de que os linfócitos normais e cancerosas foram igualmente sensíveis à genotoxinas foi de alguma forma surpreendente, porque a razão para usar uma determinada quimioterapia é que terá como alvo, preferencialmente, as células malignas. No entanto, as informações importantes extraídas Fig 2B é que TAT-RasGAP

317-326 não sensibiliza PBL para etoposide-, morte vincristine- e mediada por doxorrubicina. O peptídeo no entanto que, por vezes, sensibilizar PBLs a 4-HC (Fig 2B), sugerindo que a TAT-RasGAP

317-326 pode afetar a viabilidade das células normais em algumas combinações de tratamento.

TAT-RasGAP

317-326 pode potenciar a morte celular induzida por genotoxin no sarcoma de Ewing

Para estender a investigação sobre TAT-RasGAP

317-326 em câncer infantil não-leucemia, a eficácia da TAT-RasGAP

317-326 foi também testado em células de sarcoma de Ewing. Os resultados mostram que o péptido derivado de RasGAP também é capaz de sensibilizar estas células a várias genotoxinas, embora numa extensão menor do que nas leucemias (Figura 3). Em alguns casos, não se observou sensibilização (por exemplo, vincristina, quando foi usado nas linhas de células A673 e TC252). Aqui, novamente, TAT-RasGAP

sozinho 317-326 não apresentar qualquer toxicidade para as células de sarcoma de Ewing (Fig 3).

Três linhas celulares de sarcoma de Ewing (EW-11, A673 e TC252) foram semeadas em placas de 6 poços e após 24 horas foram tratados com 4-HC, et opôs ido, vincristina, doxorrubicina ou nas concentrações indicadas na presença ou na ausência de 10 uM de TAT-RasGAP

317-326. Um dia mais tarde, avaliou-se a morte celular. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P . 0,05 t-teste após a correção de Bonferroni

As linhas de células derivadas de neuroblastoma NB1 estão diretamente morto por TAT-RasGAP

317-326

chemoresistance Adquirida é um importante causa de fracasso do tratamento de neuroblastoma. Para avaliar o efeito de TAT-RasGAP

317-326, em células que foram expostos a elevadas doses de quimioterapia e, por conseguinte, que potencialmente adquiriram resistência a estes agentes citotóxicos, foram selecionados células de tumor primário de um único paciente em diferentes fases do doença. As células NB1 estão estágio 4 células do neuroblastoma primários de alto risco derivadas de amostras de medula óssea que foram estabelecidas no diagnóstico inicial (NB1-NBM e NB1-FBS) e na recaída subsequente após multi-agente de quimioterapia (NB1-FBS-Re) (Fig 4A ). NB1-FBS e NB1-FBS a-Re as linhas celulares foram cultivadas em soro de bovino fetal a 10% (FBS) meio DMEM molecular contendo, enquanto que as células NB1-NBM foram estabelecidas em meio básico neural (NBM). NBM é uma célula estaminal permissiva isento de soro, bFGF, EGF e de meio B27 suplementado para suportar o crescimento de células da crista neural, o tecido de origem de neuroblastoma [38, 39].

. A seta grossa cinza claro na parte superior da figura representa o regime de tratamento administrado ao paciente do qual as três linhas celulares foram derivadas NB1-estabelecida. As células NB1 são derivados a partir de amostras de medula óssea primárias elevados de neuroblastoma de risco. NB1-NBM e NB1-FBS foram estabelecidos no momento do diagnóstico inicial, e cultivadas em meio NBM e DMEM, respectivamente. NB1-NBM-Re foi estabelecida em uma recaída posterior e cultivadas em DMEM. As três linhas de células-derivadas NB1 foram tratados como descrito na Figura 3. B. A linha celular de LAN-1 é derivada de um neuroblastoma de alto risco. células LAN-1 foram tratados como descrito na Figura 3. H, meses; BM, medula óssea; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P . 0,05 t-teste após a correção de Bonferroni

Figura 4A mostra que as linhas de células NB1-NBM e NB1-FBS não exibem a mesma sensibilidade para com as quimioterapias testados. Além disso, a eficácia dos péptidos TAT-RasGAP

317-326 para melhorar a eficiência de morte de 4-HC varia entre estas duas linhas celulares: as células NB1-FBS foram encontrados para ser muito sensível ao efeito de sensibilização do péptido, enquanto as células NB1-NBM não foram afetados pela presença de TAT-RasGAP

317-326. Como a única diferença entre as linhas celulares NB1-NBM e NB1-FBS é a forma na qual elas são cultivadas, pode-se supor que o metabolismo das células NB1 varia de uma condição de cultura para o outro e que esta modula diferencialmente a sensibilidade as células tumorais a TAT-RasGAP

317-326.

Para investigar se o efeito de sensibilização da TAT-RasGAP

317-326 ainda foi eficiente em células de neuroblastoma recidiva, comparou a sua eficácia entre a células NB1-FBS e a NB1-FBS a-Re células. Ambas as linhas celulares são cultivadas no mesmo meio de cultura. O regime de tratamento que foi utilizada para tratar o paciente está ilustrado na Fig 4A. O paciente, as células recidiva dos quais foram derivados, foi exposto às quatro drogas (4-HC, etoposido, vincristina e doxorrubicina) testados neste estudo. No entanto, excepto para as condições tratados com 4-HC onde podemos observar uma ligeira resistência a esta droga na NB1-FBS-Re células, as células recidiva não são mais resistentes ao etoposídeo, vincristina e doxorrubicina do que as células derivadas de diagnóstico inicial (Fig 4A). Pelo contrário, NB1-FBS a-Re células mostram um aumento da sensibilidade à doxorrubicina em comparação com as células NB1-FBS. No entanto, os péptidos TAT-RasGAP

317-326 sensibiliza as três linhas de células derivadas de NB1 primários, embora a um nível diferente de eficácia de acordo com a linha de células e a quimioterapia testados (Fig 4A).

Na maioria casos, TAT-RasGAP

317-326 não induz a morte das células tumorais por si só. No entanto, descobrimos que as três linhas de células derivadas NB1 pode ser directamente morto pelo péptido RasGAP-derivado (Fig 4A). A dose necessária para induzir a morte celular (20? M), no entanto, é mais elevada do que a dose utilizada para sensibilizar as células para genotoxinas (10 uM).

Para completar a investigação do efeito de TAT-RasGAP

317 -326 no tipo de tumor de neuroblastoma, que também testado o péptido na LAN-1, uma outra linha de células de neuroblastoma derivadas de uma agressiva fase 4 do neuroblastoma. Figura 4B mostra que o péptido derivado de RasGAP exibe um efeito de sensibilização ligeira para esta linha celular. Ao contrário das linhas de células derivadas NB1, TAT-RasGAP

317-326 por si só não foi capaz de matar células LAN-1 (Figura 4B), o que significa que os péptidos TAT-RasGAP

317-326 induzida morte celular não é um especificidade partilhada por todos os neuroblastomas.

a actividade de sensibilização de TAT-RasGAP

317-326 é realizada pela sequência derivada RasGAP-

Para avaliar a especificidade da actividade quimio-sensibilizador de TAT-RasGAP

317-326, três péptidos de controlo diferentes foram testados: um péptido composto por a sequência TAT única (TAT), um péptido no qual a sequência foi RasGAP mexidos (TAT-mexidos), e um péptido em que o primeiro triptofano da sequência RasGAP foi substituído em um resíduo de alanina (TAT-Mutante). Este triptofano foi recentemente mostrado ser essencial para a actividade de sensibilização de TAT-RasGAP

317-326 tumores em adultos [16]. O efeito de TAT-RasGAP

317-326 e os três péptidos de controlo foi testado em células CCRF-CEM em combinação com várias drogas anti-cancro em doses que permitiram a maior actividade de sensibilização a ser detectado. As células CCRF-CEM foram usadas porque esta linha celular de leucemia foi o mais eficiente sensibilizados pelo péptido derivado RasGAP. Figura 5A mostra que todos os três péptidos de controlo tinham uma tendência a favorecer ligeiramente a morte de células CCRF-CEM, quando combinados com as diferentes drogas anti-cancerosas, mas na maioria dos casos, esta não atingiu significância estatística. Em contraste, TAT-RasGAP

317-326 marcadamente, e sempre de forma significativa, sensibilizados estas células para as drogas. O efeito de sensibilização ligeira dos péptidos de controlo é muito provavelmente devido à actividade de células penetrante da porção de TAT, o qual tem o potencial para afectar de forma negativa a homeostase celular [40]. Resultados semelhantes foram obtidos quando foram usadas a linha celular de sarcoma de Ewing TC252 e a linha de células de neuroblastoma NB1-FBS: TAT-RasGAP

317-326 aumentou significativamente a sua sensibilidade à 4-HC, enquanto os três péptidos de contraprova não, ou apenas fez minimamente (Fig 5B e 5C). Estes dados indicam que a actividade de sensibilização de tumores de TAT-RasGAP

317-326 baseia-se apenas marginalmente na sua capacidade de penetrar nas células por meio da sequência de célula-permeável TAT. Portanto, pode concluir-se que a actividade de sensibilização de TAT-RasGAP

317-326 é realizada, principalmente, pela sequência RasGAP-derivado.

. As células CCRF-CEM foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas directamente com 10 uM TAT-RasGAP

317-326, TAT, TAT-mexidos ou TAT-mutado na ausência ou na presença de 4-HC, et opôs ido, vincristina ou doxorrubicina nas concentrações indicadas. Após 24 horas de incubação da droga, 7-AAD ou de coloração de anexina V-FITC foi realizada para avaliar a morte celular. B-C. As linhas celulares TC252 (B) e NB1-FBS (C) foram tratadas de forma semelhante, mas em combinação com apenas 4-HC. P10, TAT-RasGAP

317-326; TAT-S, TAT-mexidos; TAT-H, TAT-Mutante; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. Significa com a mesma letra não são significativamente diferentes.

Discussão

As terapias actualmente aplicadas para tratar a infância cancros sólidos, tais como neuroblastoma e sarcoma de Ewing, precisa ser mais eficiente e específica para melhorar o resultado clínico. Leucemia tem geralmente uma melhor taxa de sobrevida em 5 anos de tumores sólidos pediátricos, mas os efeitos a longo prazo da terapia continuam a ser uma importante causa de morbidade e mortalidade. Além disso, a resistência adquirida aos tratamentos convencionais é responsável por recaídas e mau resultado. Por conseguinte, encontrar agentes terapêuticos menos tóxicos e mais eficientes para tratar cancros pediátricos é uma necessidade para diminuir os efeitos colaterais deletérios induzidos por drogas e a mortalidade associada [3].

No presente estudo, avaliou-se o efeito de TAT -RasGAP

317-326 em várias linhas celulares de cancro da infância. Este peptídeo RasGAP derivada já era conhecido para sensibilizar células tumorais adultos

in vitro

e

in vivo

a várias terapias anti-câncer [12]. Nossos resultados mostram que TAT-RasGAP

317-326 sensibiliza significativamente as células cancerosas a infância na maioria das condições testadas. No entanto, em alguns casos, as células de tumor não, ou minimamente, responder ao péptido. O efeito tumor sensibilizante pediátrica ilustrado neste estudo foi obtida com metade da concentração de peptídeo usado anteriormente para sensibilizar células cancerosas adulto (10 mM TAT-RasGAP

317-326 neste estudo, em vez de 20? M no papel de Michod et al. [12]). Possivelmente, a dose de TAT-RasGAP

317-326 poderia ser dobrado para aumentar a eficácia de sensibilização do péptido nas condições em que era menos eficiente. Dado que as células de tumor primárias representar uma condição clinicamente mais relevante, também testaram o peptídeo em células de neuroblastoma primárias derivadas de amostras de medula óssea a partir de um único doente (as três linhas de células-derivadas NB1 mostrou na Figura 4). Os resultados mostram que o péptido derivado RasGAP-sensibiliza as células de tumor primárias, sugerindo que pode exercer a sua actividade anti-cancerígena em tumores em um

no contexto in vivo

.

O mecanismo de acção da TAT -RasGAP

317-326 continua a ser determinada com precisão [18-20]. Inicialmente presumiu que trabalhando com um grande painel de linhas de células e agentes citotóxicos permitir-nos desenhar um padrão que pode ser utilizado para predizer que tipo de tumores de infância exibir sensibilidade à TAT-RasGAP

317-326, em resposta a um dado droga. Tal informação seria útil para decifrar o modo de ação da TAT-RasGAP

317-326. Para este efeito, analisou-se a forma como a metade da concentração máxima inibitória (IC

50) para cada agente quimioterapêutico foi modificado pela presença de TAT-RasGAP

317-326 para uma dada linha celular (Tabela 2). O péptido derivado RasGAP diminuiu o IC

50 para a maioria das genotoxinas na maioria das linhas celulares. No entanto, sem um padrão específico baseado na origem do tumor ou o tipo de droga pode ser deduzida a partir dos dados apresentados na Tabela 2. Também parecia se havia algumas mutações específicas comuns em oncogenes bem conhecidos ou genes supressores de tumor (por exemplo HRAS, KRAS, ARN, HDM2, N-MYC, C-MYC, TAL1, FLI-1, MLL, p53 e Rb1) nas linhas celulares analisadas. Mais uma vez, nenhuma associação poderia ser encontrado entre a presença de mutações específicas em uma linha de células de câncer e sua capacidade de ser sensibilizado pelo peptídeo RasGAP derivado.

Um aspecto interessante desta pesquisa é que a sensibilização efeito de TAT-RasGAP

317-326 pode ser diferencialmente modulada pelas condições de cultura de células. Esta função é ilustrada pelo facto de que as células-NB1 de FBS, mas não as células NB1 nbm, são sensíveis ao efeito do péptido. Estas duas linhas de células são derivadas do mesmo tumor neuroblastoma no momento do diagnóstico inicial (ver Figura 4) mas elas foram cultivadas em diferentes meios. Estas duas linhas celulares parecem ter as mesmas alterações genómicas. Na verdade, eles possuem perfis array CGH idênticos com as mesmas alterações cromossômicas segmentares associada ao neuroblastoma típicos (dados não publicados). Portanto, se estas duas linhas de células têm perfis array CGH idênticos, o que poderia explicar a sua sensibilidade diferente para TAT-RasGAP

317-326? Uma possibilidade é que a forma em que eles são cultivados modular o seu metabolismo diferencialmente. Isto pode, por sua vez afecta a sua sensibilidade aos tratamentos anti-câncer. Há, de facto acumular evidência que o estado metabólico das células cancerosas desempenham um papel importante no caminho que respondem aos fármacos anti-cancro [41]. Outra hipótese é que as populações de células diferentes são selecionados mediante passagens em meio diferente.