Abstract

Fundo

Os microRNAs ( função de miRNAs) como reguladores endógenos de comportamentos biológicos de cânceres humanos. Vários RNAs não-codificantes naturais são relatados para inibir miRNAs por interações de pares de bases. Estes fenómenos levantam questões sobre a capacidade do dispositivo artificial para regular miRNAs. O objetivo deste estudo é criar dispositivos sintéticos que têm como alvo um único miRNA ou um cluster miRNA e verificar seus efeitos terapêuticos sobre os fenótipos de células de câncer de bexiga.

Metodologia /Principais Achados

Tandem locais de ligação de miARN abaulada foram inseridos na região 3 ‘não traduzida (UTR) do gene da luciferase de Renilla conduzido pelo promotor de SV-40 para a construção de dois “cortadores de miARN-” para a supressão de aglomerado de miR-183-96-182 ou miR-210. Um terceiro dispositivo com sequências repetidas de tandem não complementares a qualquer miRNA conhecido foi gerado como um controle não segmentados. Em análises funcionais, cancro da bexiga T24 e células de UM-UC-3 foram transfectadas com cada um dos três aparelhos, seguido de ensaios para detecção dos seus impactos. Os ensaios de luciferase indicaram que as actividades dos repórteres de luciferase nas miARN de cortar relva foram diminuiu para 30-50% do controlo não segmentado-. Usando Real-Time qPCR, os níveis de miARN alvo de expressão foram mostrados para ser reduzida 2-3 vezes pela correspondente miARN-cortador. O crescimento celular, apoptose, e a migração foram testados por ensaio MTT, ensaio de citometria de fluxo, e no ensaio in vitro do zero, respectivamente. inibição do crescimento celular, aumento da apoptose e diminuição da motilidade foram observados em células de câncer de bexiga miRNA-cortadores-transf.

Conclusões /Significado

Não apenas um único alvo miRNA mas também todo o membros de uma cluster de destino miRNA pode ser bloqueado usando essa estratégia de design modular. Os efeitos anti-cancerígenos são induzidas pelos miARN de cortar relva sintéticas nas linhas celulares de cancro da bexiga. miR-183/96/182 de cluster e miR-210 são mostrados a desempenhar papéis oncogênicos no cancro da bexiga. A plataforma de biologia sintética potencialmente útil para miRNA perda de função de estudo e tratamento do câncer tem sido estabelecida neste trabalho

Citation:. Liu Y, Han Y, Zhang H, Nie L, Jiang Z, Fa P, et ai. (2012) Synthetic miRNA-Cortadores Segmentação miR-183-96-182 Cluster ou miR-210 Crescimento Inibição ea Migração e induzir a apoptose em células de cancro da bexiga. PLoS ONE 7 (12): e52280. doi: 10.1371 /journal.pone.0052280

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 31 de agosto de 2012; Aceito: 12 de novembro de 2012; Publicação: 17 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Ph.D. Fundação programas de Ministério da Educação da China (20100001110100 para ZC); O programa de promoção de Shenzhen Laboratory Key, Shenzhen, República Popular da China (CXB201005250016A para ZC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células transicionais da bexiga é o câncer do trato urinário mais comum em países orientais e ocidentais [1]. A maioria dos cânceres de bexiga são tumores de baixo grau não invasivos que podem progredir para o fenótipo invasivo. Em contraste com cancros da bexiga não invasivos, tumores músculo-invasivo tendem a metástase para outros órgãos e têm um prognóstico muito pobre [2] – [3]. Os tratamentos mais comuns para o câncer de bexiga são cirurgia, quimioterapia, imunoterapia e radioterapia. No entanto, eles estão longe de ser satisfatórios devido a vários fatores, incluindo a falta de eficácia, ausência de especificidade, e cheio de efeitos colaterais desagradáveis ​​[4] – [5]. Portanto, há uma necessidade crescente para o desenvolvimento de novas maneiras de tratar o cancro. Várias novas terapias antineoplásicos estão atualmente sob investigação clínica e experimental, mas sem grandes avanços foram alcançados com estas estratégias terapêuticas [6].

tem sido proposto que as células cancerosas podem ser reprogramados por reunião de DNA diferente ou peças de RNA em novos dispositivos para dar origem a um comportamento biológico benigna [7] – [8]. terapia de biologia sintética com vários dispositivos direcionados a vias de genes específicos do cancro abre prometendo novos caminhos para melhorar o tratamento do câncer [9]. Com base de uma compreensão detalhada dos perfis genéticos de cancros, os biólogos sintéticos tentar produzir dispositivos biológicos previsíveis e estáveis, com novas funcionalidades de tratamento que não existem na natureza. Embora esse campo é relativamente novo e ainda está em fase de testes de laboratório, alguns dos trabalhos relacionados já mostraram grande potencial nos tratamentos de vários tipos de câncer [10] – [11].

microRNAs (miRNAs ), uma classe de RNAs curtos endógenos, regulam a expressão do gene através da ligação a sequências parcialmente complementares na 3’UTR do ARNm [12]. Numerosos estudos têm relatado que miARNs estão envolvidos no desenvolvimento e progressão de cancros humanos, incluindo o crescimento, a apoptose, invasão e metástase [13] – [14]. Em nosso trabalho anterior foram determinados os perfis de miRNA do genoma do câncer de bexiga humana por sequenciamento de profundidade. miR-183-96-182 cluster e miR-210 foram encontrados para ser regulada para cima no cancro da bexiga humana, sugerindo que eles podem desempenhar papéis importantes como oncogenes neste câncer [15].

Um dos principais objectivos da nossa investigação em biologia sintética é para conectar dispositivos genético sintético para o controlo de um fenótipo de células de tumor. Neste artigo, apresentamos dois úteis dispositivos do genéticas miR-183-96-182-cluster-deck (MIRM-183/96/182) e o miR-210-deck (MIRM-210) miRNAs alvo -que com a sequências parcialmente complementares. Nós também têm investigado seus efeitos terapêuticos sobre os fenótipos de células de câncer de bexiga. Esta abordagem fornece uma plataforma de biologia sintética potencialmente útil para o estudo e tratamento do câncer miRNA perda de função.

Resultados

Concepção e construção dos miRNA-cortadores

Inspirado as observações que algumas moléculas de RNA expressas a partir de

Herpesvírus Saimiri

ou os pseudogenes humanos regular os miRNAs endógenos por interações de pares de bases em células de mamíferos [16] – locais [18], nós criamos miRNA-cortadores contendo ligação parcialmente complementar aos miARN alvo para estudos miARN de perda de função em células humanas de cancro da bexiga (fig. 1). Para formar uma interacção mais estável com o miRNA, nós projetamos vários locais de ligação de miRNA de interesse com um bojo central nas posições de clivagem de Argonaute 2 [19]. Esta afirmação baseia-se também na descoberta de que o emparelhamento entre miARNs parcial e as suas sequências alvo é mais comum em animais do que nas plantas [12]. Os locais de ligação foram ligados por “ligantes” (de alguns nucleotídeos) para os fins de melhorar a ligação de complexos de proteína-miARN (miRNPs) para cada possível local de ligação, e aumentando a eficiência de miARN knockdown [20].

construiu-miARN de cortar relva, inserindo vários locais de ligação de miARN para a UTR 3 ‘de um gene de luciferase de Renilla. Cada construção sob o controle de um promotor de SV-40 terminou com um sinal de poliadenilação de SV40. Um gene que codifica TK desregulada de luciferase de pirilampo conduzido pelo promotor foi usado como um controlo. Os quadrados pretos representavam os elementos de ligação entre os sítios de ligação.

Fizemos 6 cópias em tandem vestida de sítios de ligação para o cluster de miR-183-96-182 (2 cópias para cada miRNA do cluster) . O MIRM-183/96/182, em seguida, foi construído por inserção destes locais de ligação para a UTR 3 ‘de um gene repórter de luciferase de SV-40 conduzido pelo promotor no vector siCHECKTM-2 (Promega, Madison, WI, EUA). Para demonstrar a modularidade dos aparelhos, que inserido mais 6 cópias em tandem dispostos de locais de ligação para o miR-210 para a UTR 3 ‘do gene repórter para gerar MIRM-210, utilizando o mesmo vector. Como um controle irrelevantes, que também criou um dispositivo com 6 em tandem repetidas sequências não complementares a quaisquer miRNAs conhecidos. As sequências utilizadas neste estudo estavam disponíveis na Tabela S1 e S2 tabela.

Diminuição atividades de repórteres de luciferase em miRNA-cortadores podem contribuir para os locais de ligação de miRNA

Para testar a eficácia do miRNA- cortadores, nós ensaiada atividade luciferase Renilla em relação à actividade de luciferase de vaga-lume em T24 ou células UM-UC-3 48 h após a transfecção com cada dispositivo. Os ensaios de repórter de luciferase mostraram que as actividades dos repórteres que contêm os locais de ligação de miARN abauladas foram diminuídas em células de cancro da bexiga, em comparação com o não segmentado-controlo (P 0,01 para cada grupo). As inibições (%) das expressões luciferase foram apresentados na Tabela 1.

Os miRNA-cortadores alcançado a supressão eficaz dos níveis de miRNA-alvo em linhas celulares de cancro da bexiga

Para investigar mais a funcionalidade de miARN de cortar relva, foram examinados os níveis de expressão relativa das miARN alvo no cancro da bexiga T24 humana dispositivos-transfectadas e células de UM-UC-3. Os resultados demonstraram que a expressão de qPCR do correspondente miARN-cortador de induziu um decréscimo dramático nos níveis de expressão dos miARN alvo nas duas linhas celulares de cancro da bexiga (P 0,05 para cada grupo). As inibições (%) da expressão de miARN foram mostrados na Tabela 2. Os níveis de expressão de miR-96, o miR-182 e miR-183 não podia ser suprimida pelo MIRM-210. Ao mesmo tempo, o nível de expressão de miR-210 também não podem ser alterados por MIRM-183/96/182. Os resultados da experiência qPCR foram apresentados na Tabela S3.

A inibição do crescimento celular induzida pelos miRNA-cortadores em linhas celulares de cancro da bexiga

linhas celulares de cancro da bexiga humana T24 e um- UC-3 foram transfectadas transitoriamente com os dispositivos em placas de 96 poços. Em ambas as linhas de células da bexiga, MIRM-183/96/182 ou o MIRM-210 diminuiu a reactividade do MTT (Fig. 2). Tal observação pode indicar tanto uma paragem do crescimento celular ou a morte celular.

T24 e células de UM-UC-3 foram transfectadas com os dispositivos em placas de 96 poços. O crescimento celular foi medida pelo ensaio de MTT em intervalos de tempo diferentes. ANOVA foi utilizado para a comparação das curvas de crescimento das células. (A) 183-MIRM /96/182 inibiu o crescimento celular em células T24 (P 0,05). 183 MIRM-/96/182 crescimento (B) inibiu celular em células de UM-UC-3 (P 0,05). (C) MIRM-210 inibiu o crescimento celular em células T24 (P 0,01). crescimento (D) MIRM-210 inibiu a célula em células de UM-UC-3 (P 0,01). Os dados foram a média de três experiências independentes; bares, SD.

Iniciação de apoptose celular induzida pelos miRNA-cortadores em linhas celulares de cancro da bexiga

Para testar a morte celular, foram realizados experimentos de apoptose. Ambas as duas linhas celulares foram semeadas em placas de seis poços e transfectaram-se com dispositivos. Realizou-se ensaios de apoptose utilizando um kit de detecção de apoptose Anexina V-PE para determinar se os dois tipos de cortadores de nossos miARN-sintéticos induzir apoptose celular em células cancerosas da bexiga. Os resultados mostrados na Fig. 3 demonstra que as células apoptóticas (T24%) de linhas celulares e de UM-UC-3 transfectadas com o MIRM-183/96/182 ou o MIRM-210 foram mais elevados do que as transfectadas com o controlo não segmentado-.

T24 e células de UM-UC-3 foram transfectadas com os dispositivos em placas de 6 poços. apoptose celular foi medida pela citometria de fluxo às 48 horas pós transfecção. (UMA). Imagens representativas de análise de citometria de fluxo em células T24. (B). Imagens representativas da análise de citometria de fluxo em células de UM-UC-3. (C). indução da apoptose celular foi observada em células /96/182 transfectadas cancro da bexiga T24 183 MIRM-e UM-UC-3 utilizando análise de citometria de fluxo. (D). indução de apoptose celular foi observada em T24 cancro da bexiga MIRM-210 transfectadas e células UM-UC-3, utilizando citometria de fluxo. Realizamos cada experiência pelo menos três vezes. As barras de erro, SD. ** P 0,01, em comparação com o untargeted-control

A inibição da migração celular induzida pelos miRNA-cortadores em linhas celulares de cancro da bexiga

As células foram semeadas em 12 poços. e placas transfectadas com os dispositivos. Em seguida, examinou-se o papel de cada dispositivo na migração de células tumorais através da realização de ensaios de zero. Como mostrado na Fig. 4, as distâncias de migração de células nos grupos transfectados com os cortadores-miARN foram significativamente mais baixos do que aqueles nos grupos transfectados com o controlo não segmentado-.

T24 e células de UM-UC-3 foram transfectadas com os dispositivos em placas de 12 poços. A migração celular foi medida pelo ensaio de zero. (A) MIRM-183/96/182 e inibiu a migração de células MIRM-210 em células T24 de forma independente. (B) MIRM-183/96/182 e MIRM-210 migração celular inibida em UM-UC-3 células de forma independente. Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes e uma imagem representativa foi mostrado. Os resultados foram apresentados em média ± SD. ** P . 0,01, em comparação com o untargeted-control

Discussão

é amplamente reconhecido que os miRNAs induzir a degradação do mRNA através de interacções específicas para a sequência. No entanto, trabalho recente tem proposto que a função principal de algumas interacções miARN-ARNm é bloquear a miARN, em oposição para suprimir a expressão dos genes alvo [12]. Vários resultados experimentais apoiar esta nova concepção da regulação miRNA. Em células de mamíferos, o

PTENP1

pseudogene com sítios de ligação de miRNA conservados na sua 3’UTR foi mostrado para regular

expressão de PTEN

através da interacção de emparelhamento de bases com os miRNAs. Um fenômeno semelhante também foi descoberto em

KRAS

e seu pseudogene

KRAS1P

[16] – [17]. degradação miRNA específico da sequência foi recentemente observada em células T sagüi transformadas com

Herpesvírus Saimiri

(HVS). O vírus codifica uma pequena não-codificante-RNA chamado HSUR1-que contém sites com grande complementaridade com o miR-27a. emparelhamento de bases entre miR-27a e HSUR1 pode regular negativamente os níveis de miR-27a [18] expressão. Com base nestes resultados, especula-se que uma molécula de ARN natural, pequena pode estar a actuar como um cortador para miARNs que se ligam aos locais de reconhecimento específicos na sua sequência de nucleótidos. Por isso, parece razoável que artificiais dispositivos regulamentares de miRNA com sequências parcialmente complementares para miRNA de interesse também têm a capacidade de inibir a atividade de miRNA endógeno correspondente e /ou expressão.

Para testar esta hipótese, construímos dispositivos sintéticos contendo múltiplos incharam locais de ligação de miRNA e nomeou-os de “miRNA-cortadores”. Obviamente, a razão para a escolha deste nome para o dispositivo sintético é que ele pode “cortarem” expressão miRNA apenas como um cortador de grama. Os dispositivos foram concebidos para ser modular, em que os locais de ligação em tandem pode ser modificado pelos outros. Sua expressão foi levado a alto nível pelo forte promotor viral SV-40 em células de câncer de bexiga humanos. Usando dois experimentos de validação, mostramos que os miRNA-cortadores construídos por nós eram funcionais. Em primeiro lugar, ensaios de luciferase confirmou que as atividades dos repórteres de luciferase nas miRNA-cortadores foram suprimidos nas duas células de câncer de bexiga. Em segundo lugar, em tempo real qPCR foi realizado para detectar os níveis de miARN alvo de expressão em células de cancro da bexiga, transfectados com os dispositivos, e demonstrou-se que as quantidades destes miARNs foram reduzidos no correspondente miARN-cortador. De acordo com estes dois resultados, podemos concluir que os miRNA-cortadores podem funcionalmente inibir um único alvo miRNA ou bloquear todo um conjunto de miRNAs relacionados.

Mais e mais estudos têm mostrado que miRNAs são frequentemente desregulado em muitos tipos de cancros humanos. Como os papéis críticos de miRNAs em cancros são gradualmente explorado, as suas aplicações como potenciais alvos terapêuticos têm gerado grande interesse no desenvolvimento de nova estratégia para tratar o cancro [21] – [22]. Individualmente ou como um grupo, os níveis de miR-96, o miR-182 e miR-183 de expressão têm sido mostrados para ser regulados positivamente em vários cancros, incluindo o cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulm, meduloblastoma, cancro da bexiga e etc. [23] – [27]. Lin et ai. encontrado que o miR-96 induziram a proliferação e o crescimento independente de ancoragem de linhas celulares de cancro da mama [28]. Segura et ai. encontrado que o miR-182 sobre-expressão promovida a migração de células de melanoma humano in vitro e as suas metástases in vivo [29]. Sarver et al. encontrado que o miR-183 funciona como um oncogene por aumento da migração de células cancerosas [30]. miR-210 tem emergido como um novo biomarcador de tumor regulado por hipoxia. A região única semente de miR-210 distingue de todos os outros miARNs. Expressão de miR-210 foi ligada ao crescimento do tumor, invasão e sobrevivência do paciente pobre [31]. Yang et ai. descobriu que o miR-210 downregulation inibiu o crescimento celular e a apoptose celular induzida em células do hepatoma humano [32]. Fasanaro et ai. descoberto que o anti-miR-210 diminuiu a transfecção migração celular, crescimento celular e inibiu a apoptose induzida por [33]. Estes estudos fornecem evidências para o papel importante dos quatro miRNAs seletivos na patogênese dos cancros humanos. No entanto, os seus efeitos sobre os fenótipos de células de câncer de bexiga permanecem largamente desconhecidos.

Neste estudo, nós mostramos que o miR-183-96-182 cluster ou miR-210 supressão pela correspondente miRNA-cortador não só inibiu o crescimento ea migração, mas também induziu apoptose em células de cancro da bexiga humanos. A inibição do crescimento celular era devida à indução de apoptose de células. Estes resultados sugerem que o miR-183/96/182 cluster e miR-210 desempenham papéis importantes na regulação das funções biológicas de células cancerosas da bexiga.

Todas as alterações observadas no fenótipo deve ser mediada por genes regulados miARN . Demonstrou-se no trabalho anterior que knockdown do aglomerado de miR-183/96/182 resultou no processo de enriquecimento de vias de apoptose e a desregulação da via PI3K /Akt /mTOR [26]. Os componentes da via PI3K /Akt /mTOR foram relatados para ser crítico para a tumorigénese, incluindo a proliferação celular, o crescimento, a sobrevivência e a mobilidade [34]. Há também foi o relatório demonstrando que este cluster inibiu a absorção de zinco através da supressão dos transportadores de zinco [23]. O zinco é um inibidor de HIF-1α em cancros humanos que reprime genes importantes envolvidos em progressão tumoral, tais como VEGF, MDR1 e Bcl2 [35]. miR-210 tem sido conhecida para regular a hipoxia, o que é importante para a sobrevivência de células de cancro e invasão. Vários miR-210 alvos que influenciam o crescimento celular, apoptose, e a migração já foram identificadas, tal como o factor de transcrição E2F 3 (E2F3) [36], o receptor do factor de crescimento de fibroblastos como um (FGFRL1) [37], homeobox A1 (HOXA1) [38], enorme proteína associada a FLICE (FLASH) /caspase-8-associado da proteína-2 (Casp8ap2) [39] e Ephrin-A3 (EFNA3) [33]. Análises adicionais são necessários para investigar a sua regulação genética nas células de câncer de bexiga.

Deve também ser notado que os dois miRNA-cortadores não são absolutamente eficiente, porque eles só resultaram em mudanças marginais fenotípicas em células de câncer de bexiga . Há vários fatores que podem afetar a eficiência dos dispositivos. A função de um miARN-cortador não depende apenas do número de locais de ligação de miARN, mas também da quantidade de ARN do cortador em relação à quantidade dos miARNs endógenos. Para proporcionar um tratamento contra o cancro mais eficazes, vários pontos pode ser tida em consideração. A adição de mais miARN sítios de ligação para os dispositivos podem aumentar a concentração das sequências parcialmente complementares e, por conseguinte, irá aumentar os efeitos inibidores de miARN-cortadores. Para expressar os dispositivos a um nível elevado, pode-se selecionar mais potenciais promotores fortes para dirigir a transcrição e usar vetores virais para entregar os miRNA-cortadores. Algumas outras possibilidades continuam a ser mostrado.

Em resumo, os efeitos anti-crescimento mediada por efeitos de apoptose e anti-migração foram ambos induzidos pelos miRNA-cortadores sintéticos visando miR-183-96-182 cluster ou miR- 210 nas células de câncer de bexiga. Outras pesquisas ainda são necessárias para comprovar a utilidade da nossa plataforma de biologia sintética em miRNAs funções estudos e tratamentos de câncer.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura de células

Bexiga humana linhas celulares de carcinoma de células de transição T24 e UM-UC-3 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Ambos foram mantidas em meio RPMI-1640 (1640) meio suplementado com antibióticos 10% de soro fetal bovino e 1% (100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina) sulfatos. As células foram rotineiramente cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2.

Criação dos miRNA-cortadores

sítios de ligação inflado miRNA para o miR-96, miR- 182, miR-183 e miR-210 e os elementos de ligação entre eles foram concebidos e sintetizados quimicamente. Ou a parte de ADN combinação para o cluster de miR-183-96-182 contendo 2 cópias de sítios de ligação para cada cluster miRNA ou a parte do DNA específico para miR-210 contendo 6 cópias de sites para miR-210 de ligação foi clonado siCHECKTM-2 vector luciferase (Promega, Madison, WI, EUA) digerido com

Xhol

e

Notl

. Como um controle não segmentado, com um dispositivo em tandem repetido seis sítios complementares para não miARNs conhecidos de ligação também foi construída utilizando os mesmos métodos, como descrito acima. descrições completas das sequências relacionadas foram apresentados na Tabela S1 e S2 Tabela.

transfecção celular

As células foram plaqueadas vinte e quatro horas antes da transfecção para atingir 70-80% de confluência no momento da transfecção. 1 ug de cada dispositivo foi transfectado em células utilizando Hiperfect Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante.

repórter luciferase ensaio

As células foram semeadas em placas de seis poços (5 × 10

5 /po) e transfectadas com os miARN de cortar relva ou a não segmentado-controlo. A actividade de luciferase foi detectada utilizando o sistema de ensaio de luciferase duplo (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante a 48 horas após a transfecção. A actividade da luciferase de Renilla foi normalizada para a actividade de luciferase de pirilampo. A inibição (%) da expressão da luciferase foi calculada pela seguinte fórmula: Inibição (%) = (actividade relativa de luciferase na irrelevantes-controlo – actividade de luciferase relativa no miARN-cortador de) /actividade de luciferase relativa no irrelevantes-controlo × 100 %. Os experimentos foram realizados em duplicado e repetidos pelo menos três vezes.

extracção de ARN e em Tempo Real qPCR

Os ARNs totais foram isolados a partir de células T24 e UM-UC-3 células utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os cDNAs foram sintetizados utilizando o M-MLV da transcriptase reversa (Promega, Madison, WI, EUA). PCR em tempo real foi realizado utilizando o all-in-one

TM miARN qRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc., Rockville, MD, EUA). ARN nuclear pequeno U6 (snRNA) foi seleccionada como controlo endógeno. Os miRNA qPCR Primers foram encomendados à GeneCopoeia, Inc. Os números de catálogo de All-in-One ™ miRNA qPCR Primers foram os seguintes: hsa-miR-96~HmiRQP0852; HSA-miR-182~HmiRQP0239; HSA-miR-183~HmiRQP0244; tem-miR-210~HmiRQP0317; snRNA U6 ~ HmiRQP9001 (A empresa não forneceu informações sequência destes iniciadores). As misturas de PCR foram preparados de acordo com os protocolos do fabricante, com as condições de PCR de 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C, 20 seg a 55 ° C, e 30 seg a 70 ° C num ABI PRISM 7000 fluorescente quantitativa PCR System (Applied Biosystems , Foster City, CA, EUA). A expressão relativa de cada miARN foi calculada usando 2

-ΔΔCt métodos. A inibição (%) da expressão de miARN foi calculada pela seguinte fórmula: Inibição (%) = (nível relativo de expressão de miARN em células transfectadas com o não segmentado-controle – nível de expressão de miARN relativo em células transfectadas com o miARN-cortador de) /miARN relativa nível de expressão em células transf ectadas com o controlo não segmentado-× 100%.

crescimento celular ensaio

os efeitos dos dispositivos concebidos sobre a proliferação de células foram examinados por ensaio MTT de acordo com os métodos relatados [40 ]. 24, 48 ou 72 horas após a transfecção, 20 ul de MTT (5 mg /ml) foi adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços e as células foram cultivadas durante 5 horas. Em seguida, as misturas médias de MTT foram descartados e 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço. A absorvância foi medida a um comprimento de onda de 490 nm (com 630 nm como o comprimento de onda de referência), utilizando um leitor de microplacas de ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Os ensaios foram repetidos pelo menos três vezes.

apoptose celular ensaio

celular apoptose foi detectada utilizando um isotiocianato de fluoresceína anexina V-(FITC) /iodeto de propídio (PI) kit de detecção de apoptose (BD, San Jose, CA, EUA) de acordo com os protocolos do fornecedor. 48 horas após a transfecção, as células foram recolhidas, centrifugadas, e ressuspensas em 500 ul de 1 × tampão de ligação. Anexina V-FITC (5 ul) e 10 ul de PI foram então adicionados a cada tubo. Os tubos foram incubados no escuro a temperatura ambiente durante 15 min. ensaio celular foi realizado imediatamente a apoptose em um citometria de fluxo (EPICS, XL-4, Beckman, CA, EUA). Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes.

A migração celular ensaio

motilidade celular foi analisada por ensaio de zero de acordo com os métodos anteriormente descritos [41]. As células foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 1,0 x 10

5 células por poço. Nós células transfectadas com os dispositivos e os pratos incubados a 37 ° C até as células atingiram 100% de confluência. Um fosso artificial foi então gerada pelo coçar com uma ponta de pipeta. As imagens fotográficas foram retirados de cada poço e novamente imediatamente depois de 20 h, usando um sistema de câmara digital. foi utilizado o programa de software HMIAS-2000 para calcular a distância de migração de células (um). Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes.

Análise estatística

Os dados de todos os experimentos foram expressos como média ± o desvio padrão (SD). A significância estatística foi determinada pelo teste t ou ANOVA e P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os testes estatísticos foram realizados usando SPSS versão 17.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA).

Informações de Apoio

Tabela S1.

Mirna sequências no Estudo

doi: 10.1371. /journal.pone.0052280.s001

(DOC)

Tabela S2.

miRNA de grama sintética sequências no Vector

doi: 10.1371. /journal.pone.0052280.s002

(DOC)

Tabela S3. valores

Delt-CT de Real-Time qPCR em ambas as células de câncer de bexiga linhas transfectadas com os dispositivos sintéticos

doi: 10.1371. /journal.pone.0052280.s003

(DOC)

Agradecimentos

os autores agradecem aos doadores, cujos nomes não foram incluídos na lista de autor, mas que participaram neste programa.