Abstract

retrovírus endógeno humano K (HERV-K) é o retrovírus mais intacta nos do genoma humano. Existem vários full-length ou próximo full-length pr�v�us HERV-K nele. Para analisar quais provírus HERV-K dar origem a transcritos virais em linhas celulares de cancro e para testar se a radiação ionizante pode alterar os níveis de transcritos de HERV-K, estudos de RT-PCR foram realizadas utilizando várias linhas celulares de cancro humano. Iniciadores de várias posições no genoma viral foram utilizados e incluídos pares destinados a atravessar junções de união em RNAs virais. Na ausência de radiação ionizante, os transcritos foram detectados a partir de múltiplas provírus HERV-K em linhas celulares de próstata humana, cervical, cabeça e pescoço, os cancros da mama, ou, e os pró-virus a partir do qual os transcritos originados variou entre as diferentes linhas. Apenas um dos 13 linhas de células testadas (linha de câncer cervical C33A) não conseguiu mostrar transcrições HERV-K. RNAs emendados detectados incluídos RNAs virais emendados como se espera nos locais de emenda virais convencionais, além de vários RNAs de splicing alternativo. transcritos de splicing alternativo surgiu a partir de provírus específicos, e foram detectados na maioria das linhas celulares utilizadas. RT-PCR quantitativo foi realizado para avaliar os efeitos da radiação ionizante. Estas análises mostraram que as transcrições HERV-K foram elevadas em quatro das doze linhas testadas, especificamente todas as linhas de câncer de próstata de três usados ​​e uma linha de cancro da mama. Os aumentos foram de natureza transitória, atingindo um máximo de 24 horas após uma única dose de irradiação gama, que variou de 2,5 a 20 Gy, e retornando aos níveis basais 72 horas. Em resumo, estes estudos demonstraram que a radiação ionizante pode afectar os níveis de transcritos de HERV-K em células, e estes efeitos variam entre diferentes células. As mudanças nos níveis de transcrição HERV-K pode afetar vários processos biológicos em células, e futuros estudos sobre os efeitos da radiação ionizante sobre HERV-K são vale a pena perseguir

Citation:. Agoni L, Lenz J, Guha C ( 2013) Variant emenda e Influência da radiação ionizante na endógena Human Retrovirus K (HERV-K) Transcrições em linhas celulares de cancro. PLoS ONE 8 (10): e76472. doi: 10.1371 /journal.pone.0076472

editor: Robert Belshaw, Universidade de Plymouth, Reino Unido

Recebido: 03 de julho de 2013; Aceito: 27 de agosto de 2013; Publicação: 18 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Agoni et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por NIBIB 1 R01 EB009040 (CG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os efeitos da radiação (IR) sobre os retrovírus endógenos (ERVs) ionizante são em grande parte desconhecido. Os genomas de ADN de ERVs estão integradas no genoma das suas espécies hospedeiras, como resultado de infecções de células da linha germinal mais tempo evolutivo. Até à data, os efeitos da radiação ionizante sobre ERVs foram exploradas apenas em ratinhos [1], em que tem sido conhecido durante décadas que a radiação ionizante pode reactivar rato retrovírus endógenos (MERVs) [2] – [4]. A radiação ionizante também afecta as respostas imunitárias a células de cancro, e um estudo detectado CD8 + T-células reactivas para um antigénio num MERV murino, irradiadas modelo de carcinoma do cólon [5]. Assim, é plausível que os efeitos da radiação ionizante na expressão de retrovírus endógenos pode ter consequências para as respostas imunes em relação a células tumorais.

A radiação ionizante foi relatado para aumentar a actividade de transcrição de muitos vírus, incluindo CMV [6], [7 ], HPV [8] e HIV [9], [10] em células infectadas. Os mecanismos moleculares são ainda largamente não caracterizada, embora para o HIV, por IV foi relatado para aumentar a transcrição através da activação do promotor LTR [9], [10]. Ao nível clínico, os estudos mostraram uma taxa inesperadamente alta reactivação de uma infecção latente de HBV no carcinoma hepatocelular após a radioterapia [11]. Em células infectadas pelo HPV, o aumento da produção de transcritos e proteínas E6 /E7 foi demonstrado após irradiação y [8]. A um nível clínico, aumento de linfócitos citotóxicos específicos (CTL) contra antigénios respostas HPV E6 /E7 foram detectadas em doentes com cancro do colo do útero após a radioterapia [12]. Além dos efeitos sobre os níveis de expressão de vírus, a radiação ionizante é conhecida para modular respostas imunes contra o cancro [13] – [15]

retrovírus endógenos estão presentes no genoma de cada célula de um indivíduo e pode ser. alvos para as respostas imunes, tais como aqueles contra MERVs [16]. Ambas as respostas T e linfócitos-B foram também observados contra os retrovírus humanos endógenos (HERV) [17] – [21]. Mais notavelmente, as respostas imunes têm sido observados em relação ao conjunto adquirida mais recentemente de retrovírus no genoma humano, HERV-K [18], [19], [22], [23]. HERV existem no genoma humano na forma de genomas de ADN retroviral integrado chamado provírus. Colectivamente eles foram estimados para compreender cerca de 8% do genoma humano [24]. Na ausência de pressão de selecção sobre o hospedeiro para manter estes provírus numa forma intacta, mutações inevitavelmente se acumulam ao longo do tempo neles evolutiva interrompendo assim os componentes genómicos virais e inactivação da infecciosidade virai. O subtipo HML2 de HERV-K é o único retrovírus ter entrado no genoma da linhagem humana desde a divergência das linhagens de humanos e chimpanzés ocorreu cerca de 6 milhões de anos atrás [25] – [31]. Porque é o mais recentemente inserido, HERV-K HML2 constitui o conjunto mais intacta de retrovírus no genoma humano [25], [32] – [39]. Apesar disso, não HERV-K proviral locus do indivíduo é conhecido que é totalmente funcional e capaz de produzir viriões infecciosos, embora a recombinação entre os loci hoje existentes no genoma humano pode restaurar a infecciosidade virai [37]. Muitos dos provírus HERV-K são suficientemente intacto para codificar proteínas que podem reter alguma funcionalidade [25], [35], [36], [38], [39], e da expressão destas proteínas tem sido sugerido que se correlacionam com doenças incluindo o cancro [40] – [44].

HERV-K é transcrito em graus diferentes em várias doenças humanas, incluindo o cancro [20], [45] – [48], a infecção por HIV [18], [49 ] – [51] e desordens auto-imunes [52], [53]. Pessoa loci de HERV-K no genoma humano diferem na integridade dos quadros de leitura aberta específicas, a funcionalidade das proteínas codificadas, a integridade dos elementos que actua em cis, e, possivelmente, na capacidade de sequências de ADN que flanqueia o ADN viral de afectar a transcrição. Elas variam de cerca de 97 a mais de 99% idêntica em comparações de pares para outra, e muitas das diferenças entre eles são alterações de pares de bases únicos. Portanto, para identificar os loci de HERV-K específico expresso numa amostra humana e a entender completamente o papel biológico de HERV-K em doenças humanas, se for o caso, é necessário incluir a análise de transcritos virais ao nível de um único nucleótido em qualquer estudo de los [54]. Nós previamente detectados transcritos de HERV-K em linhas celulares de cancro da próstata e observou-se que alguns dos transcritos foram unidas em posições não usuais no genoma viral [55]. A detecção de splicing variante de transcritos HERV-K em linhas de cancro da próstata foi inesperado. Neste relatório, a análise baseada nucleotídeos de loci HERV-K específica que são transcritos ea possibilidade de variantes de splicing incomuns foram alargado a outros tipos de linhas celulares de cancro. Também testámos a hipótese de que a radiação ionizante pode alterar os níveis de transcritos de retrovírus endógenos K humanos. proteínas de HERV-K são conhecidos por serem alvos para ambas as respostas de linfócitos T e B- [17] – [21], [46]. Como um primeiro passo para determinar se antigénios HERV-K pode ser sujeita a modulação induzida por irradiação e, talvez, constituem alvos candidatos para o anti-tumor, a imunoterapia base de células T para o cancro após a administração de radiação ionizante, nós investigamos se a radiação ionizante afecta os níveis de transcritos HERV-K em várias linhas celulares de cancro.

resultados

HERV-K transcrição em câncer linhas celulares

HERV-K transcrição foi relatado para ocorrer em câncer humano . No entanto, a resposta de HERV-K à radiação ionizante não foi testado no cancro ou células normais. Para verificar HERV-K transcrição e estabelecer uma linha de base de referência para as experiências com RI, foi realizada a primeira transcriptase reversa PCR (RT-PCR) em RNA isolado a partir de linhas de células de 13 de cancro a partir de sítios de cancro vulgarmente tratados com radioterapia: próstata, colo uterino, cabeça pescoço e peito. RT-PCR foram realizadas utilizando os pares de iniciadores a partir de várias partes do genoma viral mostrado na Figura 1. Os iniciadores a partir da protease viral (

Pro

), polimerase (

pol

) foram capazes de detectar não excisado RNA viral, e envelope (

env

) primers gene foram capazes de detectar ambos os mRNAs de env não excisado e individualmente emendados. Os produtos tamanho esperado foram observadas em 12 linhas de células dos 13 testados para o

pro

e

pol

amplicons e em 11 linhas de células para o

env

amplicon (Fig . 2A). Paralelas RT-PCR foram realizadas com iniciadores para a

gene GAPDH

para verificar a carga equivalente do ARN precisas em todas as amostras e carregamento de géis. Controlos sem transcriptase reversa verificado que os produtos foram gerados a partir de moldes de ARN e não a partir de ADN genómico contaminante potencialmente (Fig. 2).

Um mapa genético de um provírus de HERV-K (cinzento) inserido no genoma do hospedeiro sequências f lanqueadoras é mostrado com uma sequência alvo duplicado 5 ou 6 pb (TDS) indicados como caixas pretas. A transcrição viral primária unspliced, isoladamente-emendados

env

mRNA e duplamente-emendados

rec

e

NP9

mRNAs são mostrados abaixo do genoma viral, juntamente com o RNA isoladamente emendados [56] que não é conhecido para codificar qualquer proteína. 3 ‘caudas poli (A) estão indicados (AAAA). A eliminação 292 nucleótidos de tipo 1 provírus HERV-K que atravessa a junção pol-env é indicada (Δ292). Tipo 2 pr�v�us HERV-K e suas transcrições contêm estes nucleotídeos. As posições dos pares de iniciadores de PCR estão apresentados na parte inferior como setas pretas com os nomes pelos quais eles são identificados ao longo do papel. As setas cinzentas identificar iniciadores utilizados para a PCR aninhada. A, linha angular tracejada mostra as sequências intrônicas excisadas que o 1X-env e pares de primers 2X-rec foram concebidos para atravessar. O par de iniciadores utilizado para a RT-PCR quantitativa é também mostrada (Q-env).

RT-PCR foi realizada para detectar transcritos virais em cinco posições diferentes em HERV-K genoma, dois dos quais entre junções de splicing para detectar RNAs emendados no cruzamento convencional mRNA env splice (1x-env) e as junções mRNA splicing rec. GAPDH RT-PCR foi realizada ao mesmo tempo e serviu como um controlo positivo para a integridade de ARN e carga como comparação. Os produtos foram resolvidos através de electroforese em gel de agarose. posições genómicas dos iniciadores utilizados são mostradas na Fig. 1. controles paralelos foram realizados sem transcriptase reversa (-RT) como controlos para excluir a contaminação do DNA. marcadores de tamanho de ADN são apresentadas à esquerda.

Estes dados confirmaram que os transcritos HERV-K estavam presentes na maioria das linhas celulares de cancro humano, testadas. Existem alguns casos em que os produtos de HERV-K de RT-PCR não foram detectados (Fig. 2). Uma linha celular de cancro cervical, C33A, não deu produtos de RT-PCR com qualquer um dos três pares de iniciadores, embora fez dar o produto esperado para

GAPDH

amplificação de controlo (Fig. 2A). linha de células de câncer de uma mama, MDA-MB-468, falhado consistentemente para produzir o

env

amplicon, embora o

pro

e

pol

produtos estavam presentes (Fig. 2A ). Para aumentar a sensibilidade, uma nested RT-PCR foi realizada para o

env

fragmento amplificado utilizando iniciadores posicionado como mostrado na Figura 1. O

env

produto foi detectado na MDA-MB-468 da mama linha de câncer, como foi em outros 11 linhas (Fig. 3a). No entanto, ainda não foi detectável em células de cancro cervical C33A, indicando que os não excisado e isoladamente splicing HERV-K RNAs não estavam presentes em niveis detectáveis ​​nesta linha celular. reacções de amplificação foram realizadas em paralelo, sem transcriptase reversa foram uniformemente negativas e, mostrando assim que a amplificação foi de moldes de ARN e não a partir de qualquer DNA genómico potencialmente contaminante (Fig. 3).

aninhada por PCR foi realizada sobre os produtos de RT-PCR mostrado na Fig. 2 para detectar transcritos virais em três posições diferentes em HERV-K genoma. Dois de RT-PCRs junções cruz splicing para detectar RNAs emendados no cruzamento convencional mRNA env splice (1x-env) e rec e mRNA NP9 (2X-rec, 2X-NP9) emendar cruzamentos. Os produtos foram resolvidos através de electroforese. posições genómicas dos iniciadores utilizados são mostradas na Fig. 1. controles paralelos foram realizados sem transcriptase reversa (-RT) como controlos para excluir a contaminação do DNA. marcadores de tamanho de DNA são mostrados à esquerda.

Presença de HERV-K emendado Transcrições em linhas celulares de cancro

Para avaliar se as transcrições HERV-K tem integridade suficiente para os RNAs para ser emendados, foi realizada RT-PCR nas duas junções de splicing convencionais virais. Várias splicing HERV-K mRNAs foram caracterizados [40], [56] – [58], incluindo o ARNm isoladamente splicing que codifica a proteína Env, e três RNAs duplamente splicing, uma das quais codifica Rec, e outra das quais codifica NP9 (Fig . 1). existem provírus HERV-K HML2 como dois tipos diferentes chamadas tipo 1 e tipo 2, dependendo se um trecho de 292 pb de nucleótidos está presente (tipo 2) ou suprimidas (tipo 1). No tipo 1 pr�v�us, a exclusão remove o amino porção terminal-codificação de

env

e

rec

, e provoca um na fusão de quadros do

pol

e

env

grelhas de leitura aberta (Fig. 1). Por outro lado, no tipo 2 pr�v�us, a porção terminal de codificação carboxilo de

pol

e que, para amino terminais de

env

e

rec Quais são totalmente presente. local de splicing 3 ‘(3’SS) para

env

mRNA eo primeiro íntron do

rec

mRNA está situado a montante do trecho bp 292, mas o 5’SS para o segundo intron de

rec

ARNm está localizado dentro do 292 pb (Fig. 1). Assim, tipo 1 pr�v�us não gerar o

forma

rec de RNA duplamente emendado (Fig. 1) ou codificar a proteína Rec.

Usando primers desenhados para detectar a isoladamente-emendados

env

mRNA (1X-env, Fig. 1) e as duas junções de união em duplamente emendados

rec

ou

NP9

mRNAs (chamado 2X-rec, Fig. 1), 11 de 13 linhas de células foram encontrados para ser positiva com o 1X-

env

primers, e 10 de 13 produziram produtos com os primers 2X-REC (Fig. 2B). A detecção dos produtos de splicing também forneceu mais evidência de que os produtos de RT-PCR foram derivados, de facto, a partir de ARN codificadas viralmente, e não a partir de qualquer DNA genómico celular potencialmente contaminantes. A detecção de múltiplos produtos de tamanho com os iniciadores 1X-env foi inesperado.

Para verificar que as bandas de tamanho inesperadas foram obtidas a partir de HERV-K ARN e para alcançar uma melhor resolução dos produtos de PCR bandas em electroforese em gel de agarose , foi realizada PCR aninhados (Figura 1). Várias bandas foram novamente observado, e não há produtos foram detectados na ausência de transcriptase inversa, confirmando assim que eles eram derivados de ARN virais de splicing (Fig. 3). Os produtos de PCR foram identificados para amplicão 1X-env em 12 das 13 linhagens de células e bandas de três tamanhos diferentes foram detectados, com as razões de intensidade das três bandas que variam entre as diferentes linhas. Também foram observados vários produtos de tamanho para o amplicon 2X-rec, incluindo a banda fraca de aproximadamente 500 pb e uma banda proeminente de cerca de 250 pb. Ambos os produtos de PCR estavam presentes em células MDA-MB-468 células cancerígenas da mama, mostrando assim que o RNA viral emendado estava presente nesta linha celular. Para as células de cancro cervical C33A, nenhum dos produtos aninhados de ARN splicing foi detectado, confirmando assim a ausência de transcritos detectáveis ​​HERV-K nesta linha celular. Esta análise também detectada a presença de transcritos de NP9 em cinco das linhas (Fig. 3).

Identificação individual de HERV-K Activo Loci

A razão para a detecção de bandas múltiplas em tamanho RT-PCR das Figuras 2B e 3, em particular para a 1X-env de RT-PCR, foi incerto. Uma possibilidade era que eles poderiam refletir deleções únicas ou inserções que tinha acumulados em loci específicos HERV-K ao longo do tempo evolutivo resultando em transcrições de tamanhos alterados, e estes loci particular, foram os transcritos nas linhas celulares utilizadas. Outro foi a de que os locais de splicing utilizado variou entre loci individuais HERV-K no genoma humano, resultando deste modo em diferentes produtos de tamanho. Para distinguir entre estas hipóteses e para identificar os loci específico a partir do qual os transcritos originado, os produtos de PCR mostrados na Figura 2 foram sequenciados. Isto exigiu a análise dos transcritos ao nível dos nucleótidos, porque os pró-virus são tão semelhantes uns aos outros. Enquanto provírus individuais acumulam mutações únicas ao longo do tempo evolutiva, alguns dos provírus HERV-K no genoma humano são tão novos que são mais de 99% idênticas, e o nível de identidade pode variar em diferentes partes do genoma viral. Pr�v�us que se formaram no início do tempo tornaram-se gradualmente mais divergentes. A sequenciação de produtos de PCR longos suficientemente pode ser usada para deduzir os loci viral específica que corresponde mais de perto os transcritos, mesmo quando as diferenças são menores do que um nucleótido em 100 entre duas provírus particulares e transcritos de ARN a partir deles. A Tabela 1 lista 23 das mais intactas pr�v�us HERV-K HML2 no genoma humano ao qual as sequências foram comparadas [39].

Inicialmente, o

pro

,

pol

e

env

produtos de PCR foram sequenciados directamente. Um exemplo de

Pro

sequências de quatro linhas de células alinhadas com muitos dos provírus relativamente intactas HERV-K no genoma humano é mostrada na Figura 4. A comparação das sequências revelou que os transcritos de HERV-K detectados combinando aqueles compartilhado por pr�v�us específicos de humanos, mostrando que eles derivam, pelo menos, predominantemente do subconjunto de pr�v�us HERV-K HML2 que se formou após as linhagens de humanos e chimpanzés divergiram. Em outras posições, houve vários picos secundários nas cromatógrafos de sequenciação, indicando que os produtos de PCR foram derivados a partir de misturas de transcritos a partir de vários loci. A tabela 1 resume os nucleotídeos mais predominantes ( “pluralidade”, Tabela 1) em cada uma das posições em que vários nucleotídeos foram inequivocamente observados dentro dos

pro

amplicons. Embora, esta correspondência mais de perto o provírus HERV-K102 (Tabela 1), que não era possível de discernir por este análise se este provírus foi, de facto, transcritas, porque ela também era plausível que a sequência pluralidade de uma mistura de provírus transcritas apenas coincidentemente correspondeu a esse provirus. As misturas de sequência variar em certa medida, entre as diferentes linhas de células (Tabela 1), e foram similarmente observado nas outras partes do genoma viral (dados não apresentados). Enquanto os insights que poderia ser adquirida a partir do seqüenciamento direto dos produtos de RT-PCR foram assim limitada, as misturas mostrou que múltiplas pr�v�us foram transcritas entre as várias linhas celulares de cancro.

No painel inferior, a HERV -K pr�v�us completos utilizados como referência para identificar os loci de origem dos transcritos de mRNA são mostrados. À esquerda, os principais ramos de hominídeos existentes são apresentados, juntamente com os tempos aproximados de sua ramificação da linhagem que leva aos humanos modernos em milhões de anos atrás (Ma). Pr�v�us que são inseridos nas posições precisamente ortólogos em humanos e outros hominídeos, e, portanto, são idênticos por descendência, são indicados.

Para investigar mais precisamente quais loci HERV-K foram transcritas, misturas de RT-PCR produtos foram separados em sequências individuais por clonagem em vectores plasmídicos. Isto também permitiu a investigação do que representavam os vários produtos de tamanho (Figs. 2 e 3). O 1X-

env de produtos a partir de RT-PCR (Fig. 2A) foram espingarda clonado em vectores plasmídicos. Para os produtos 1X-env, vinte e quatro clones individuais a partir de cada linha celular foram ensaiados por rastreio por PCR para determinar o tamanho do fragmento amplificado clonado. Para as várias amostras, 4 a 13 clones foram escolhidos para sequenciação, e os resultados foram resumidos na Tabela 2. Os clones foram escolhidos para incluir o conjunto de diferentes produtos de tamanho em cada linha, e, portanto, o número de vezes que foi obtido qualquer sequência não fez reflectir a sua abundância relativa entre as transcrições HERV-K em cada linha de células. Além disso, a extensão da sequenciação foi limitado a olhar para os produtos mais comuns, e é provável que provírus menos abundantemente transcritos não foram detectados por esta análise.

Estas análises identificado um total de seis diferentes loci individuais HERV-K entre as linhas 12 celulares (Tabela 2). Dois destes eram HERV-K102 e K108-HERV (provírus futuramente são identificados simplesmente como K102, K108, etc). Juntamente com uma terceira provírus, K (I), estes foram detectados em várias linhas de células (Tabela 2). Os produtos de RT-PCR foram detectados a partir de três provírus adicionais, K107, K111, K117 e em uma ou algumas linhas de células de cada um. Transcrições de múltiplos provírus foram detectados na maioria das linhas. É provável que mais extensa sequenciação de clones iria aumentar o número de loci de HERV-K detectado. Cinco dos loci a partir do qual foram detectados transcritos virais eram específicos provírus-humano HERV-K, o que confirma que os transcritos detectados em grande parte derivado do subconjunto de provírus HERV-K HML2 que se formou após as linhagens humanos e de chimpanzés divergiram. Assim, o mais frequentemente detectada HERV-K spliced ​​

env

transcritos nas linhas celulares de cancro humano, foram obtidas a partir do subconjunto adquirida mais recentemente de retrovírus no genoma humano.

splicing alternativo de Pessoa HERV- K Activo Loci

Sequenciação do 1X-env produtos de RT-PCR mostrou splicing nas posições esperadas dentro do genoma HERV-K, mas, inesperadamente, também demonstrou transcritos de splicing em locais adicionais (Figura 5). Os sites convencionais foram detectados para o tipo 2 pr�v�us, K108, K109, e K (I), e tipo 1 pr�v�us, K102 e K117 (Fig. 5). K108 é uma das mais pró-virus intactos no genoma humano de comprimento completo possuindo sequências de leitura aberta para todas as proteínas virais [25], [35], e convencionalmente spliced ​​transcritos a partir dele foi detectado em sete linhas diferentes (Fig. 5). No entanto quatro loci, K102, K (I), K117, K111 e, mostrou variantes de splicing 1X-env incomuns formados a partir da utilização da alternativa 5 ‘e 3’ locais de splice. Os locais de splicing alternativos que foram utilizadas variaram entre as pró-virus (Fig. 5). Aqueles que foram detectados (Fig. 5), em alguns casos combinados os sinais de consenso para as maiores ou menores spliceossoma, enquanto que em outros casos, eles não o fizeram (Fig. 5). A maioria dos transcritos de splicing alternativo eram de tipo 1 provírus, mas um deles, K (I), era de um tipo de 2 provírus. Assim, a utilização local de splicing alternativo não era apenas uma consequência da ausência de 292 pb. K111 é um provírus mais velhos que se formaram antes da divergência da linhagem gorila da linhagem humana-chimpanzé aproximadamente 8 milhões de anos [25], [59], mas o outro provírus a partir do qual os transcritos de splicing foram detectados aqui são específicos humanos.

as porções 5 ‘e 3’ de um provirus HERV-K são mostrados no topo separados por /e /. 5’SS e 3’SS indicam os sítios de união convencionais de HERV-K, e as suas posições são marcados por círculos pretos. As posições dos iniciadores de PCR externos utilizados para a PCR aninhado são mostradas como setas. Estruturas de env spliced ​​produtos de RT-PCR a partir das linhas celulares e provírus indicados são esquematizados abaixo do genoma viral. linhas angulares tracejadas mostram os íntrons excisadas. círculos vermelhos mostram as posições das sequências onde splicing não convencional ocorreram. Para cada produto de splicing, a sequência superior mostra a sequência de transcrição primária inferido que determinada a partir do locus genómico de cognato, e a sequência inferior mostra a sequência do produto de RT-PCR. nucleotídeos vermelhos se juntaram no produto emendados. nucleotídeos cinzentas mostram as extremidades das sequências intrônicas excisadas. A posição da delecção 292 nucleótidos definitivo do tipo 1 provírus é mostrado.

As linhas celulares em que os locais de splice alternativos 1X-env foram detectados estão resumidos na Tabela 2 e Figura 5. Para K102, os mesmos locais de splicing alternativos foram detectados em seis linhas de células diferentes, e para K117, os mesmos sítios foram detectados em dois (Fig. 5). Isto sugeriu que as sequências dos transcritos específicos (e os pró-virus a partir do qual eles foram derivados) determinada utilização local de splicing alternativo. transcritos de splicing alternativo foram detectados na maioria das linhas celulares, e em alguns casos, ambos os locais de splicing alternativos convencionais e foram detectados por provírus particulares (K102, K (I), e K117). Não é claro a partir desta análise se a natureza das células contribuíram para os padrões de splicing observados. Em resumo, os locais de splicing alternativo detectou representaram as diferentes bandas de tamanho detectado nas reacções de RT-PCR através da junção de splicing de env-1X (Figs. 2 e 3). No entanto, a detecção frequente deles ea variação entre os diferentes pr�v�us HERV-K foram inesperados, ea possível base biológica molecular para eles era desconhecida.

O sequenciamento dos diferentes produtos feitos sob medida também foi realizada para PCRs realizados com os iniciadores para detectar os RNAs duplamente splicing (dados não mostrados). A, cerca de 800 bp produto menos proeminentes (Fig. 2B) correspondeu a convencionalmente emendados

rec

mRNA. PCR aninhadas confirmou a presença de ARNm de rec em 9 de 13 linhas de células (Fig. 3). Além disso, a sequenciação mostrou que a banda de menor proeminente na Figura 2B corresponde ao RNA splicing do 5’SS a montante de

gag

ao 3’SS a jusante do segundo intrão

rec

ARNm . Este ARN foi descrito anteriormente [57], mas não é conhecido para codificar qualquer proteína.

radiação ionizante (IR) Aumenta HERV-K transcrição em linhas celulares de cancro da próstata

Tendo estabelecido que HERV -K foi transcrito numa variedade de linhas de células de cancro humanas, foi perguntado se a radiação ionizante pode alterar os níveis de transcritos virais. Quantitativa, RT-PCR (qRT-PCR) foi realizada em ARN isolado a partir das 12 linhas de células que apresentaram HERV-K transcrição. Células a 50% de confluência foram irradiadas em uma única exposição a um

fonte de 137Cs. As doses de irradiação foram γ-variou com 0, 2,5, 5, 10 ou 20 Gy, e as células em cada dose foram recolhidos 1, 3, 8, 24, e 72 horas após a irradiação. O par de iniciadores utilizado foi concebido em

env

, a jusante da deleção de nucleótido 292, de modo que detectado RNA não excisado e ARNm env-spliced ​​isoladamente (Fig. 1). Cada experiência foi repetida três vezes separadas, e três repetições de RT-PCR foram realizadas em cada uma das réplicas biológicas.

A maioria das linhas celulares, incluindo as três linhas de cancro do colo do útero testados, os três tumores da cabeça e pescoço, e três das linhas de cancro da mama não mostraram diferenças notáveis ​​no nível de transcritos de HERV-K, em qualquer dose de radiação ionizante e, em qualquer ponto de tempo (Fig. 6). No entanto, todas as linhas celulares de carcinoma prostático com três níveis significativamente aumentados de transcritos de HERV-K (Fig. 6). Os aumentos nas três linhas de células de cancro da próstata eram mais evidentes às 24 horas após irradiação. Os níveis de

env

ARN viral às 24 horas foram aumentadas duas a oito vezes superior comparativamente com as células não irradiadas. Não-paramétrico, testes de classificações de Wilcoxon-assinados foram realizadas para comparar as medições em cada dose de radiação gama com aqueles a 0 Gy, e os valores de p estão apresentados na Tabela 3. Todos os aumentos em linhas celulares de cancro da próstata em 24 horas foram significativas, com valores de P 0,01. Assim, eles foram uniformemente significativa nestas linhas e foram observadas em todas as doses de radiação utilizadas. Alguns aumentos nestas linhas foram evidentes em algumas das amostras em 8 horas pós-irradiação, mas não às 3 horas. Todos os aumentos foram de natureza transitória, uma vez que por pós-irradiação 72 horas, os níveis de HERV-K tinha regressado à linha de base com todas as doses de γ-irradiação. Em geral, observou-se o nível mais elevado de indução a 20 Gy, a dose mais elevada utilizada, apesar de aumentos significativos foram observados em todas as doses e não houve nenhuma correlação óbvia entre a dose específica e as vezes de aumento entre as linhas de células de cancro da próstata.

genómicos posições dos iniciadores utilizados são mostradas na Fig. 1. Cinco doses de radiação ionizante diferentes foram usadas (0, 2,5, 5, 10, e 20 Gy), cada uma aplicada numa dose única, são mostrados em cores diferentes em cinco momentos diferentes após a γ-irradiação (1, 3, 8 , 24, e 72 horas). mudança vezes em relação aos 0 Gy para cada ponto de tempo foi obtido por normalização de 3 genes housekeeping. As barras representam os meios de três independentes de RT-PCR de repetições realizado para cada uma das três experiências. As barras de erro mostram os desvios-padrão.

Uma das quatro linhas celulares de carcinoma da mama (MCF-7) também mostrou um aumento nos níveis de HERV-K ARN seguindo-γ irradiação (Fig. 6) . A cinética do aumento foi semelhante ao que foi observado nas três linhas de cancro da próstata com um aumento máximo de seis vezes observado 24 horas após a irradiação nas células tratadas com 10 Gy. Ambos os 5 e 10 doses Gy produziram aumentos estatisticamente significativos (tabela 3), e os aumentos de mais do que duas vezes foram observados 8 e 24 horas após várias doses diferentes de γ-irradiação, o que indica que houve um efeito modesto de γ-irradiação nesta linha.

em resumo, os níveis de HERV-K RNAs foram substancialmente aumentados por radiação ionizante em uma fracção de uma das linhas celulares tumorais testadas. Os aumentos foram transitórios e atingiu um pico de cerca de 24 horas após a irradiação. Este efeito foi observado em todas as linhas celulares de cancro da próstata de três testadas, sugerindo que HERV-K nestas células podem ser particularmente sensíveis à radiação ionizante.

Discussão

As principais conclusões deste estudo foram que radiação ionizante aumentou os níveis de transcritos de HERV-K em algumas células cancerígenas, e que os efeitos variou entre as linhas testadas. Em particular, todas as três linhas de cancro da próstata que foram testados, exibiram níveis significativamente aumentados de HERV-K RNAs, ocorreu em cerca de 24 horas pós-exposição a uma dose única de γ-irradiação e, em seguida, diminuiu.