Abstract

Fundo

O microRNA miR-101 é regulada negativamente em vários tipos de câncer, incluindo câncer de bexiga. No entanto, o papel de miR-101 na invasão, metástase, e a quimio-sensibilidade de células cancerosas da bexiga permanece obscura. Este estudo foi realizado para determinar o papel de miR-101 no linfática molécula de crescimento endotelial vascular fator C (VEGF-C) e seus efeitos sobre a migração de células de câncer de bexiga, invasão e quimio-sensibilidade a cisplatina.

Métodos

Duas linhas celulares de cancro da bexiga (T24 e 5637) e a linha celular ferramenta 293T foram empregadas aqui. células cancerosas da bexiga foram transfectadas quer com um vector de sobre-expressão de miR-101 ou um lentivírus-sequência mexidos, ambos os quais exibiram uma alta eficiência de transfecção. Não-transfecção foi utilizado como um controlo negativo simulada. cicatrização de feridas e ensaios Transwell foram realizados para medir a migração celular e invasão. Um ensaio de repórter de luciferase foi realizado para validar interacção de miR-101 com a região não traduzida 3 ‘do VEGF-C, seguido de RT-PCR e confirmação de Western blot. Um ensaio MTS foi utilizado para avaliar a sensibilidade cisplatina das linhas celulares.

Resultados

miR-101 inibiu significativamente a sobre-expressão da migração e invasão enquanto melhora significativamente a sensibilidade cisplatina. miR-101 regulado negativamente a expressão da proteína VEGF-C e VEGF-C superexpressão resgatado os efeitos da sobre-expressão de miR-101, indicando que o miR-101 regula negativamente a expressão da proteína VEGF-C de pós-transcricionalmente. miR-101 e VEGF-C de interferência aumentada independentemente cisplatina citotoxicidade em células cancerosas da bexiga.

Conclusões

miR-101 suprime a expressão de VEGF-C, inibe a migração celular e invasão, e aumenta a sensibilidade em cisplatina células de câncer de bexiga. Este estudo fornece uma nova visão sobre o papel do miR-101 no cancro da bexiga e mostra a promessa de miR-101 como um alvo molecular potencial para o câncer de bexiga

Citation:. Lei Y, Li B, Tong S, Qi L, Hu X , Cui Y, et al. (2015) miR-101 Suprime crescimento endotelial vascular Fator C que a migração inibe e Invasion e aumenta a Cisplatina Chemosensitivity de células de câncer de bexiga. PLoS ONE 10 (2): e0117809. doi: 10.1371 /journal.pone.0117809

Editor do Academic: Ming Tan, University of South Alabama, United States |

Recebido: 21 de agosto de 2014; Aceito: 30 de dezembro de 2014; Publicação: 06 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Natureza National Science Foundation para a Juventude da China (No. 81202005), o Fundo Plano de Tecnologia de Hunan Science (No. 2013FJ4109 ), e do Fundo de Inovação da Universidade Central do Sul por Independent Graduate Exploration (No. 72150050587). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o tumor maligno mais comum do trato urinário, produzindo aproximadamente 150.000 mortes anuais em todo o mundo [1] e é caracterizada clinicamente por sua progressão, a recorrência, metástase e resistência aos medicamentos [2, 3]. Apesar de quimioterapia agressiva, 10-20% dos cancros da bexiga não-músculo invasivo, em última análise evoluir para musculares invasiva cancros da bexiga [4]. Enriquecimento dos vasos sanguíneos e linfáticos na propria urotelial lamina, invasão de vasos sanguíneos, profundidade de invasão e status dos linfonodos regionais foram identificados como fatores prognósticos independentes de livre de tumor sobrevivência pós-cistectomia, com a maioria dos casos de fase II e acima distally recorrentes com cada linfonodo positivo adicional aumentando o risco de mortalidade em 20% [5,6]. Embora cisplatina é a quimioterapia de primeira linha para câncer de bexiga avançado, a /gemcitabina (GC) regime de cisplatina tem um time-to-progressão mediana de apenas seis meses e não tem efeito sobre a sobrevida global após cistectomia radical em pacientes de alto risco [7 ]. Apesar cistectomia radical ou quimioterapia pré-operatória, invasão linfática descontrolada de cancro da bexiga continua a produzir um prognóstico clínico pobre [8-10]. Portanto, são necessárias mais pesquisas sobre o câncer de bexiga progressão, a recorrência, metástase e eficácia quimioterápico.

Os microRNAs (miRNAs) são filogeneticamente conservada pequena não-codificante RNAs que regulam negativamente alvo mRNA 3 ‘regiões não traduzidas (3’ UTR) em vários tipos de câncer e têm sido cada vez mais identificados como supressores de tumor ou agentes cancerígenos [11-13]. Além disso, vários miRNAs foram previamente associados com sensibilidade quimioterápico em várias linhas celulares de cancro, incluindo o cancro da bexiga [14]. Em particular, o miR-101 foi bem estabelecido como um supressor de tumor, com efeitos inibitórios sobre a proliferação celular, migração e invasão. Especificamente, níveis mais baixos de miR-101 foram previamente associados com cancro da bexiga [15], bem como da próstata [16], do ovário [17], colorrectal [18], fígado [19], gástrica [20], do pulmão [21], mama [22], tireóide [23], e melanoma [24] cânceres. No que diz respeito ao cancro da bexiga, miARN perfis de carcinoma de células de transição da bexiga (CTP) das amostras revelou que o miR-101 é regulada negativamente no TCC, e que o miR-101 inibe a proliferação celular e a formação de colónias em linhas celulares de CTP através reprimindo directamente o EZH2 histona metiltransferase [15]. No entanto, o papel de miR-101 (se algum) na invasão, metástase, e a quimio-sensibilidade de células cancerosas da bexiga permanece obscura.

VEGF-C, um membro da família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), é considerado uma importante molécula linfática e é conhecido para aumentar a permeabilidade de vasos linfáticos [25-27]. No cancro, o VEGF-C é positivamente correlacionada com a disseminação linfática no cancro da bexiga, aumenta a migração de células de adenocarcinoma de pulmão de vasos linfáticos, e modula a resistência à cisplatina em células cancerosas gástricas [28,29,38]. Embora o câncer de bexiga é conhecido por espalhar principalmente através dos vasos linfáticos (com metástase encontrados mais comumente nos gânglios pélvicos regionais) [30], nenhum estudo ainda identificada uma relação (se houver) entre miR-101 com VEGF-C em células de cancro da bexiga . No estudo atual, miR-101 foi mostrado para ter um efeito sobre a migração cancro da bexiga celular, invasão, e sensibilidade a cisplatina, regulando directamente a sua funcional alvo VEGF-C. Estes dados sugerem que miR-101 pode ser um alvo molecular potencial para a terapia do cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

Cultura celular

As linhas celulares de cancro da bexiga T24 e 5637 como bem como a 293T linha de células humanas embrionárias ferramenta rim utilizados neste estudo foram adquiridos a partir da Colecção de Culturas Tipo da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e foram mantidas em RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, EUA) e de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, EUA), respectivamente, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina. Todas as linhas celulares foram incubadas a 37- humidificada em 5% de CO

2

Construção de plasmídeo e Lentivirus Preparação

Um fragmento de miR-101 foi gerado usando os seguintes iniciadores:. Sentido , 5′-CGGGTACCGGTAGTCCTTCACTTCATGGGGAG-3 ‘e anti- sentido, 5′-CGGAATTCAAA- AAACCCAGCCACCTGTTTCAC-3′ e inserido no vector GV209 com um gene repórter verde proteína fluorescente (GFP) dentro dos locais AgeⅠand EcoRⅠrestriction. O acima referido plasmídeo de miR-101, pHelper1.0, e pHelper2.0 foram co-transfectados em culas 293T, e o sobrenadante de lentivírus partícula enriquecido foi obtido 48 h mais tarde. Uma sequência mexidos (5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘), que não tinha homologia com o gene humano, foi utilizado como um controlo negativo mexidos. O ADNc de VEGF-C foi amplificada usando os seguintes iniciadores: sentido, 5’-TCCGCTCGAGATGCACTTGCTGG- GCTTCTTC-3 ‘e anti- sentido, 5′-ATGGGGTACCGTGCTCATTTGTGGTCTTTTCC-3′ e clonadas no vector GV147 com uma proteína fluorescente vermelha (RFP) contendo gene repórter os locais de enzimas de restrição Kpn I. XhoⅠand não-transfecção foi utilizado como um controlo negativo simulada (S1 dados). Todas as sequências nas experiências foram confirmadas por sequenciação da seguinte forma: VEGF-C de siRNA, sentido, 5’-AGAUCUGGAGGAGCAGUUAUU-3 ‘e anti- sentido, 5′-UAACUGCUCCUCCAGAUCUUU-3′; siRNA controlo negativo, sentido, 5’-UACUCACUACUCGAGAUGCUU-3 ‘e anti- sentido, 5′-GCAUCUCGAGUAGUGAGUAUU-3’. Em seguida, o par complementar sintetizada de VEGF-C de shRNA foram colocados num vector pGenesil-1 (Genesil, Wuhan). células activadas por fluorescência (FACS) (Epics Altra Fluxo Cytosorter, Beckman, EUA) foi utilizado para Select GFP + ou + RFP células de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante. A eficiência de transfecção de miR-101 (GFP) e VEGF-C (RFP) foi calculada como se segue: o miR-101 eficiência de transfecção = contagem de células GFP + /contagem total de células x 100%, e o VEGF-C eficiência de transfecção = + /total de células RFP contagem x 100%. Nesta base, as eficiências de transfecção para miR-101 (GFP) e VEGF-C (RFP) foram encontrados para ser 99% e 40%, respectivamente.

Isolamento RNA e PCR quantitativa

o ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. ARN isolado foi medido utilizando um espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, DE, EUA) com uma DO

260 /OD

280 rácio superior a 1.8 usado para a síntese de cDNA. A transcrição reversa de miR-101 e a sua amplificação específica foram realizadas utilizando um Kit de qRT-PCR miARN Detecção (GeneCopoeia, MD, EUA). U6 foi usado como um controle endógeno. a síntese de ADNc de VEGF-C foi realizada utilizando um kit de primeiros-Strand cDNA Synthesis (GeneCopoeia, MD, EUA), e a PCR quantitativa (RT-qPCR) reacção em tempo real de VEGF-C foi realizada utilizando qPCR mistura (GeneCopoeia, MD , EUA). GAPDH foi utilizada para normalização modelo de VEGF-C. Todos os primers foram adquiridos a GeneCopeia. miR-101 e a amplificação do VEGF-C foram determinados com uma plataforma 3000 de rotor-GENE. Os valores alvo ciclo limiar PCR (TC) foram normalizados pela subtração do U6 ou o valor GADPH Ct, que desde que o valor ΔCt. A expressão relativa foi calculada usando a seguinte equação: Nível de expressão do gene relativo = 2

– (ΔCt grupo de controlo grupo ΔCt experimental)

Análise Western Blot

tampão de lise RIPA contendo 1 mM. PMSF foi adicionado às células em placas de seis poços e, em seguida, centrifugada durante 10 min a 4. O conteúdo de proteína total do sobrenadante foi determinada pelo método de Lowry. A amostra de proteína foi diluído, aquecida para a desnaturação, e, em seguida, submetido a electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Depois de as proteínas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, MA, EUA), 5% de leite desnatado em pó foi aplicada durante 2 h a 37-. Em seguida, 1: 1000 diluições de coelho policlonal anticorpo primário anti-VEGF-C (Cell Signaling Technology, MA, EUA) ou anti-β-actina (que serviu como um controlo de carga; Bioworld Technology, Inc., EUA) foi incubada com o dia para o outro da membrana. No dia seguinte, a membrana foi lavada três vezes em TBST e, em seguida, incubadas com um anticorpo anti-coelho secundário fluorescente durante 2 h. A membrana foi digitalizado por um sistema de imageamento infravermelho (Odyssey), ea intensidade da banda foi detectada pela Odyssey software de análise 3.0.

VEGF-C 3’UTR Selvagem Tipo e Tipo Mutant Construção e luciferase Reporter Assay

TargetScan análise foi usado para descobrir uma sequência complementar de sete nucleótidos entre o miR-101 e VEGF-C 3 ‘UTR. Um tipo selvagem (wt) de VEGF-C sequência 3’UTR, incluindo locais de restrição Xba1 (5’-TCTAGAACGAACCGCCAGAAGGCTTGTGAGCCAGGATTTTCATATAGTGAAG- AAGTGTGTCGTTGTGTCCCTTCATATTGGAAAAGACCACAAATGAGCTAAGATTGTACTGTTTTCCAGTTCATCGATTTTCTATTATGGAAAACTGTGTTGCCACAGTAGAACTGTCTGTGAACAGAGAGACCCTTGTGGGTCCATGCTAACAAAGACAAATCTAGA-3′) Além de um tipo mutante (Mut) sequência de VEGF-C com uma sequência de 3 ‘UTR de miR-101 de ligação completamente diferente, foram sintetizados e cada um, independentemente, clonado em vectores de GV272 repórter de luciferase distintas (Genechem, Xangai, China). O anteriormente descrito miR-101 que sobre-expressam ou plasmídeo-sequência mexidos, juntamente com qualquer um plasmídeo de VEGF-C 3 ‘UTR em peso ou mut foram co-transfectados para células 293T utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen, CA, EUA), criando quatro grupos experimentais. em seguida, os ensaios de luciferase de células 293T foram realizados para determinar a interacção entre as actividades de luciferase de pirilampo miR-101 e o peso e Mut VEGF-C de 3’-UTR. Renilla e foi medido às 48 h pós-transfecção usando o dual-Glo luciferase Reporter Assay System ( Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. o rácio de foi gravado Renilla-se de pirilampo valor de luciferase (S1 Tabela). as experiências foram realizadas em poços em triplicado, e os dados representam a média de cinco experiências independentes.

cicatrização de feridas Ensaio

As células alvo, incluindo T24 e 5637 células, foram transfectadas com lentivírus recombinante (1 × 10

8 unidades de transdução /ml) e de polibreno (5 ug /ml) . Após 48 h, uma suspensão de célula única foi preparado tripsinizadas e semeadas em placas de seis poços (5 × 10

5 /poço) até que as células atingiram 80% de confluência. Em seguida, 1 ml ponta de pipeta estéril foi utilizado para raspar uma cruz no centro (semelhante a uma ferida), lavadas com PBS três vezes, e o meio isento de soro foi substituído imediatamente. As células foram deixadas migrar durante 24 h, e os riscos foram cuidadosamente observadas e fotografadas. imagens microscópicas e fluorescentes foram capturados com um microscópio Olympus IX71. Os comprimentos de hiato também foram calculadas a partir das fotomicrografias. Cada linha celular foi medida em triplicado.

Transwell Ensaio

Uma câmara de Transwell (Corning Corporation, MA, EUA) com 8 mícrons poros da membrana de filtro de poliéster, foi utilizada tanto para o ensaio de invasão e ensaio de migração. A diferença entre o ensaio de invasão e o ensaio de migração foi que o ensaio de invasão de Matrigel utilizado revestido (BD Bioscience, MD, EUA) na câmara superior, que simulava as características da matriz extracelular, enquanto que o ensaio de migração não o fez. Um total de 2 x 10

5 células infectadas com lentivírus foram semeadas para dentro da câmara superior, com meio isento de soro de 200 ul. Um total de 500 ul de meio contendo 20% de FBS foi adicionado à câmara inferior. Após incubação durante 24 h, as células aderentes à superfície inferior da membrana na câmara superior foram fixadas em etanol a 90% durante 10 minutos, coradas com violeta de cristal a 0,1%, contadas em três tiros aleatórios por microscopia e fotografou. foram relatados o número médio de células das três tiros aleatórios. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

MTS Assay

A suspensão de células foi semeada em placas de cultura de 96 poços a uma densidade de 4 x 10

3 células /poço (0,2 mL /poço) durante 24 h antes da utilização. O meio de cultura foi substituído com meio fresco contendo cisplatina com diferentes concentrações durante 72 h. Em seguida, MTS (20 uL /​​poço) foi adicionada a cada poço, e a absorvância a 490 nm de cada poço foi registada com um leitor de microplacas universal (Bio-Rad Hercules, CA, EUA), depois de 3 h. curvas de taxas de dose de inibição foram plotados de acordo com os valores de absorção. O valor de IC50 (a concentração inibitória máxima de 50% da cisplatina) foi também calculado. O ensaio foi repetido em triplicado.

Análise Estatística

Os resultados foram expressos em média ± SDs. Todos os dados foram analisados ​​usando o software SPSS versão 21.0. Os experimentos foram analisados ​​estatisticamente pelo estudante de

t

-teste ou one-way ANOVA.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

miR-101 inibe o cancro de bexiga migração e invasão celular

Devido às descobertas anteriores. de menor expressão de miR-101 no cancro da bexiga [15,31], construímos um plasmídeo superexpressão de miR-101 e embalado-lo em vetor de lentivírus. células cancerosas da bexiga foram transfectadas quer com um vector de sobre-expressão de miR-101 ou um lentivírus-sequência scrambled (controlo negativo mexidos), ambos os quais exibiram uma alta eficiência de transfecção (fig. 1A). Não-transfecção foi utilizado como um controlo negativo simulada. Em seguida, examinaram a capacidade de migração celular e invasão destas células cancerosas da bexiga. O ensaio de cicatrização da ferida e ensaio de migração Transwell mostrou que a migração celular foi significativamente inibida pelo lentivírus de miR-101 que sobre-expressam (Fig. 1B, 1C). O efeito inibidor de miR-101 na invasão de células foi confirmada pelo ensaio de invasão Transwell. Como resultado, ambos T24 e 5637 miR-101 que sobre-expressam as células na superfície inferior da câmara superior exibiram capacidade invasiva drasticamente inibida em comparação com os seus homólogos mexidos-transfectadas de sequência (Fig. 1D).

(A) níveis de miR-101 de ARNm normalizados detectados por RT-qPCR. (B) A ferida% aberta (campo ferida

última

/campo ferida

inicial

x 100%) a partir da cicatrização de feridas ensaio após a transfecção. (C) Imagens representativas de células que migraram com o número de células que migraram por campo. Nota: células T24 tem uma afinidade mais forte para crystal corante violento. Assim, embora a imagem parece mostrar a coloração mais abundante em células T24, as contagens de células T24 foram realmente menor em comparação com as de 5637 células. (D) Imagens representativas de células invasivas penetrantes o Matrigel revestido e o número de células por campo de invadir. Dados apresentados como média ± SDs. *

p Art 0,05, **

p

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miR-101 Diretamente Alvos VEGF-C em células 293T

para avaliar o mecanismo molecular (s) de miR-101, a análise TargetScan encontrado que o VEGF-C é um gene alvo potencial para miR-101, como há uma sequência complementar de sete nucleótidos entre o miR-101 e VEGF-C três ‘UTR (Fig. 2A). Assim, um ensaio de repórter de luciferase mostrou que o miR-101 sobre-regulação diminuíram de forma significativa a actividade de luciferase de tipo selvagem de VEGF-C mas não o mutante de VEGF-C (Fig. 2B). Em seguida, a RT-qPCR e Western blot foi usado para avaliar o ARNm de VEGF-C e níveis de proteína, respectivamente (Fig. 2c, 2d). miR-101 sobre-expressão da proteína inibiu significativamente a expressão de VEGF-C mas não inibiu significativamente a expressão de ARNm de VEGF-C em ambos T24 e 5637 células, sugerindo regulação pós-transcricional de VEGF-C de miR-101.

(A ) os potenciais locais de ligação para o miR-101 sobre as sete sequências BP-semente de região 3 ‘UTR do VEGF-C. O tipo mutante foi construído na região da semente como sublinhado (peso: tipo selvagem, mut: tipo mutante). (B) actividade de luciferase Firely /Renilla após transfecção com wt Mut e VEGF-C e 3 ‘UTR, quer vector de miR-101 que sobre-expressam ou um vector de sequência mexidos. expressão (C) ARNm de VEGF-C medido por RT-qPCR em linhas celulares transfectadas que mostram não haver diferenças significativas na expressão de ARNm de VEGF-C entre os três estados de transfecção. (D) Análise Western blot da expressão de VEGF-C em linhas celulares transfectadas que mostram a sobre-expressão de miR-101 suprimir significativamente a expressão da proteína VEGF-C. Dados apresentados como média ± SDs. **

p

. 0,01

Efeitos Invasão VEGF-C superexpressão salvamentos de miR-101

Para verificar o papel do VEGF-C no cancro da bexiga linhas de células, foram realizadas experiências de recuperação (S1 Fig.). Depois de células T24 foram transfectadas com o lentivírus miR-101 durante 48 h, foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo que a sobre-expressão de VEGF-C (Fig. 3A) para investigar a recuperação da mobilidade celular. O ensaio de invasão Transwell mostrou que a transfecção subsequente do VEGF-C recuperado parcialmente a capacidade de invasão das células em comparação com o controlo negativo de VEGF-C e os grupos não-transfectadas (Fig. 3B). Como esperado, o nível de proteína VEGF-C foi resgatado (Fig. 3C). Assim, a inibição da invasão de células de cancro da bexiga por miR-101 é provavelmente uma consequência da diminuição da expressão de VEGF-C.

(A) Imagens representativas de células cancerosas da bexiga simultaneamente transfectadas com o miR-101 /proteína fluorescente verde (MIR -101 /GFP) e VEGF-C da proteína fluorescente /vermelho (VEGF-C /RFP). (B) Imagens representativas de células invasivas penetrantes o Matrigel revestido transfectadas com miR-101, o miR-101 e VEGF-C (o miR-101 /VEGF-C (+)), o miR-101 e um controlo negativo de VEGF-C (miR-101 /VEGF-C (-)), ou não-transfecção (simulada). (C) análise de transferência de Western validar expressão da proteína VEGF-C em linhas celulares transfectadas.

A sobre-expressão de miR-101 e VEGF-C Queda Independentemente aumentar a sensibilidade celular à cisplatina bexiga

miR -101 superexpressão aumentou a sensibilidade de ambos T24 e 5637 células à cisplatina, com o valor de IC50 aumentando de 4,06 ± 0,69 mg /L para 9,17 ± 1,24 mg /l e de 2,96 ± 0,46 mg /L para 5,56 ± 0,36 mg /L, respectivamente (Fig. 4A, 4B). A fim de determinar o papel do VEGF-C na sensibilidade cisplatina, um plasmídeo interferência de VEGF-C foi construído e transfectado nas linhas celulares de cancro da bexiga (fig. 5A). A sensibilidade de T24 e 5637 células à cisplatina aumentou após a interferência de VEGF-C, com o valor de IC50 aumentou de 2,56 ± 0,31 mg /L para 8,23 ± 0,83 mg /l e de 3,01 ± 0,5 5 mg /L para 5,42 x 0,52 mg /l , respectivamente (Fig. 5B, 5C). Estes resultados sugerem que o VEGF-C regulação negativa, como o alvo a jusante de miR-101, aumenta a sensibilidade de células de cancro da bexiga de cisplatina.

(A) A parcela de curvas de taxa de inibição de dose de cisplatina medindo a contagem de células após a transfecção com qualquer miR-101 que sobre-expressam ou lentivírus-sequência mexidos. valores (B) IC50 significativamente reduzida quando o miR-101 sobre-expressão. Dados apresentados como média ± SDs. **

p

. 0,01

(A) Análise de Western blot de expressão VEGF-C em linhas celulares transfectadas com VEGF-C shRNA ou shRNA controle. (B) A parcela de curvas de taxas de inibição de dose para contagem de células de medição cisplatina após transfecção com VEGF-C shRNA ou shRNA controle. (C) IC50 valor significativamente reduzido após VEGF-C knockdown. Dados apresentados como média ± SDs. **

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VEGF-C superexpressão salvamentos miR-101 Induzida Cisplatina Sensibilidade

Depois de células T24 foram transfectadas com o miR-101 lentivírus durante 48 h, em seguida, eles foram transientemente transfectadas com um plasmídeo de sobre-expressão de VEGF-C, um plasmídeo de controlo de VEGF-C, ou um plasmídeo de VEGF-C de shRNA. Verificou-se que a sobre-expressão de VEGF-C recuperado parcialmente a sensibilidade de células de cancro da bexiga em comparação com cisplatina o controlo de VEGF-C, com valores de IC50 of10.05 ± 1,05 mg /l e de 3,14 ± 1,02 mg /L para 0,63 ± 0,16 mg /L, respectivamente (Fig . 6A, 6B). sensibilidade de células de cancro Além disso, shVEGF-C mais significativamente melhorada bexiga à cisplatina em comparação com o controlo de VEGF-C (Fig. 6A, 6B).

(A) A parcela de curvas de taxa de inibição de dose de cisplatina para medir a contagem de células após transfecção quer com miR-101 e VEGF-C (o miR-101 /VEGF-C (+)), o miR-101 e um controlo negativo de VEGF-C (o miR-101 /VEGF-C (-)), ou miR- 101 e VEGF-C shRNA (miR-101 /shVEGF-C). (B) O valor IC50 foi significativamente aumentada após transfecção com o miR-101 /VEGF-C (+).

Discussão

Novas evidências mostram que miR-101 expressão é perdido em tecidos de câncer de bexiga e linhas celulares de cancro da bexiga [15,31]. O eixo NDY1 /KDM2B-miR-101-EZH2 tem sido identificada como activa em células de cancro da bexiga [32], em que o miR-101 suprime a motilidade de células cancerosas da bexiga T24 por segmentação de c-Met 3′-UTR [33]. No entanto, o mecanismo molecular detalhada (s) do papel de miR-101 em células cancerosas da bexiga permanece por esclarecer. Por conseguinte, através da utilização de uma abordagem baseada em bioinformática TargetScan de pesquisa para potenciais alvos de miR-101, identificou-se VEGF-C como um potencial alvo de miR-101. Nós então construído um lentivírus miR-101-superexpressão para transfecção para o T24 e 5637 linhas celulares de cancro da bexiga e demonstrou que miR-101 superexpressão inibe a migração de células de câncer de bexiga e invasão. Além disso, foi demonstrado que o miR-101 regula negativamente a expressão da proteína VEGF-C e VEGF-C superexpressão resgata os efeitos da sobre-expressão de miR-101, sugerindo que o miR-101 regula negativamente a expressão de VEGF-C de pós-transcricionalmente. Finalmente, que mostrou que tanto o miR-101 e VEGF-C de interferência aumentada independentemente cisplatina citotoxicidade em células de cancro da bexiga, e VEGF-C também resgatado efeito de miR-101 sobre a sensibilidade de células de cancro da bexiga de cisplatina.

A produção e secreção de estimuladores VEGF-potentes da angiogénese que afectam a proliferação de células endoteliais e a motilidade, bem como permeabilidade-se vascular sido vulgarmente observado em vários tipos de tumores agressivos e que influencia significativamente o prognóstico dos doentes com cancro [28], embora VEGF-C tem demonstrado têm efeitos angiogénicos em células endoteliais [34], o VEGF-C actua principalmente lymphatically através do Flt4 /VEGFR-3 e KDR /VEGFR-2 tirosina-cinases do receptor [35], que são expressos exclusivamente no endotélio linfático e alta endotélio venular de linfa nodos em tecidos adultos normais. Por exemplo, a sobre-expressão de VEGF-C foi mostrado para produzir a proliferação endotelial linfático e hiperplasia selectivo da vasculatura linfática [36].

Em relação ao papel de VEGF-C em malignidades, a expressão de VEGF-C foi inicialmente detectado ARNm num conjunto misto de tumores humanos sólidos com papel de VEGF-C em linfangiogénese proporcionando um mecanismo possível para a metástase através dos vasos linfáticos recém-formados [37]. Estudos posteriores descobriu que o receptor principal de VEGF-C de Flt4 /VEGFR-3 é expresso numa variedade de malignidades humanas, incluindo o pulmão, colo-rectal, da próstata, e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, bem como o sarcoma de Kaposi [28]. Além disso, as correlações positivas foram encontradas entre a expressão de VEGF-C e disseminação linfática na bexiga TCC [38], bem como em gástricas [41], da tiróide [42], e de neuroblastoma de cancros da próstata [39], colorrectal [40], [43 ]. VEGF-C downregulation reduz metástases pulmonares e câncer de cólon murino, e Flt4 /VEGFR-3 inibição tem sido associada com redução /atividades linfangiogênicas angiogênese, bem como redução do crescimento e metástase na mama, pâncreas, e cancro do ovário, abrindo o caminho para o desenvolvimento e ensaio de FCEVR3 como inibidores quimioterapêuticos segmentados [44]. Aqui, miR-101 superexpressão reprimida expressão da proteína VEGF-C, prejudicando a migração de células de câncer de bexiga e invasão

in vitro

na ausência de linfangiogênese. Estes achados sugerem que VEGF-C atua através do mecanismo (s) não-linfática na promoção da progressão do tumor da bexiga. Mais pesquisas são necessárias para determinar a affector jusante (s) da /VEGFR-3 eixos VEGF-C-Flt4 em células de câncer de bexiga que promovam a mobilidade de células de câncer de bexiga.

Cisplatina quimioterapia continua a ser o tratamento de primeira linha para câncer de bexiga localmente avançado, por isso a resistência a cisplatina é um grande problema clínico para pacientes com câncer de bexiga [45]. Apesar de termos observado nenhum trabalho anterior a investigar o papel de miR-101 sobre a resistência à cisplatina em células cancerosas da bexiga, o miR-101 de expressão tem sido mostrado para ser regulada negativamente em linhas celulares de cisplatina induzida por docetaxel cabeça resistência cruzada e de carcinoma de células escamosas pescoço [46], enquanto miR-101 foi mostrada para sinergizar com cisplatina, doxorrubicina, e fluorouracilo na indução de apoptose em células de carcinoma hepatocelular [47,48]. Como antagonista de miR-101, VEGF-C promove a resistência à cisplatina em células gástricas cancerosas [29], e supra-regulação de VEGF-C resulta em resistência do tumor à terapêutica anti-VEGF num modelo de cancro de pulmão de murino [49]. De acordo com estes resultados anteriores, aqui tanto miR-101 e interferência de VEGF-C foram mostrados para melhorar de forma independente cisplatina citotoxicidade em células de câncer de bexiga, e VEGF-C também resgatou o efeito do miR-101 na sensibilidade de células de câncer de bexiga a cisplatina. No entanto, o mecanismo (s) subjacente papel do VEGF-C na resistência cisplatina de células de câncer de bexiga permanece desconhecido e requer um estudo mais aprofundado.

Há duas limitações para este estudo. Em primeiro lugar, o presente estudo mostra que o VEGF-C desempenha um papel fundamental na migração de células do cancro da bexiga, invasão e quimiossensibilidade cisplatina e é um alvo directo de miR-101. No entanto, este fato não exclui a possibilidade de que o miR-101 tem outros alvos que têm funções celulares semelhantes ao VEGF-C. Usando o banco de dados TargetScan, encontramos 803 transcrições que estão previstos para ser alvos de hsa-miR-101, incluindo EZH2, BTBD3, NLK e MITF. Mais estudos são necessários para determinar se esses 803 alvos putativos são alvos reais de miR-101 e se tais alvos de proteína estão associadas com a migração cancro da bexiga celular, invasão e quimio-sensibilidade a cisplatina. Em segundo lugar, o trabalho anterior tenha mostrado que o miR-101 é regulada negativamente em TCC e que o miR-101 inibe a proliferação celular e formação de colónias TCC através reprimindo directamente o metiltransferase histona EZH2 [15]. Portanto, neste estudo, nós não avaliar os efeitos do miR-101 sobre a proliferação de células de câncer de bexiga, mas sim especificamente voltado para a influência de miR-101 sobre a migração de células de câncer de bexiga e invasão através VEGF-C. Assim, se o eixo miR-101-VEGF-C afeta a proliferação de células de câncer de bexiga permanece uma questão em aberto. Em terceiro lugar, a eficiência de transfecção de miR-101 lentivírus foi de 99%, mas a eficiência de transfecção do plasmídeo de VEGF-C era de apenas 40%; devido a questões técnicas fotográficas, assumiu-se que todas as células eram células miR-101 + (GFP +) e, assim, seleccionadas por FACS somente na base do VEGF-C + (RFP +). Em suma, o VEGF-C + (+) RFP células foram consideradas células duplamente positivas. Devido a esta limitação técnica, era difícil de avaliar adequadamente a co-localização de miR-101 e VEGF-C ARNm.

Em resumo, demonstramos o miR-101 pós-transcricionalmente suprime a expressão de VEGF-C, inibe bexiga a migração e invasão de células de cancro, e aumenta a sensibilidade cisplatina. Embora seja necessária mais investigação para identificar outros alvos relevantes de miR-101, este estudo fornece uma nova visão sobre o papel do miR-101 no cancro da bexiga e mostra a promessa de miR-101 como um alvo molecular potencial de câncer de bexiga.

Apoiando informações

S1 Data. A construção de miR-101-a sobre-expressão de plasmídeo e VEGF-C-sobre-expressão do plasmídeo

doi: 10.1371 /journal.pone.0117809.s001

(DOC)

S1 fig. Imagem representativa de células do cancro de bexiga T24 Simultaneamente transfectadas com miR-101 /proteína fluorescente (miR-101 /GFP) e VEGF-C /proteína fluorescente verde vermelho (VEGF-C /RFP)

doi: 10.1371 /journal.pone. 0117809.s002

(TIF)

S1 Table. Firely /Renilla luciferase Análises da transfecção com wt e mut VEGF-C 3’UTR e Vector Ou miR-101-superexpressão ou uma sequência-Scrambled Vector

doi:. 10.1371 /journal.pone.0117809.s003

(XLSX)