Abstract

Fundo

No cancro colorectal um subgrupo distinto de tumores demonstram o fenótipo ilha methylator CpG (CIMP). No entanto, um consenso de como marcar CIMP não for atingido, ea variação na definição pode influenciar a prevalência CIMP relatado em tumores. Assim, buscou-se comparar definições actualmente sugeridas e os pontos de corte para os marcadores de metilação e como elas influenciam a classificação CIMP no câncer de cólon.

Métodos

multiplex dependente da ligação amplificação sonda específica para metilação (MS -MLPA), com análise de fragmentos subsequente, foi utilizado para investigar a metilação de amostras tumorais. No total, 31 locais de CpG, localizadas em 8 genes diferentes (RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 e CACNA1G) foram investigados em 64 cancros do cólon distintos e linhas celulares de cancro do cólon 2. O painel gene Ogino inclui todos os 8 genes, em adição ao painel de Weisenberger de que apenas 5 dos 8 genes incluídos foram investigados. No total, 18 combinações alternativas de pontuação do CIMP positividade no nível do painel probe-, gene-, e foram analisados ​​e comparados.

Resultados

Para 47 amostras (71%), o CIMP estatuto foi constante e independente de critérios utilizados para marcar; 34 amostras foram constantemente teve como CIMP negativo, e 13 (20%) teve como consistentemente CIMP positivo. Apenas quatro das 31 sondas (13%) investigaram mostrou nenhuma diferença no número de amostras positivas usando os diferentes pontos de corte. Dentro dos painéis uma tendência foi observado que aumentando o rigor no nível do gene resultou num maior diferença nas amostras positivas CIMP de aumentar o rigor no nível do sonda. Uma diferença significativa entre as amostras positivas usando ‘as mais rigorosas “em comparação com” o mínimo de rigorosos critérios’ (20% vs 46%, respectivamente; p 0,005). Foi demonstrado

Conclusões

a variação estatística significativa na freqüência de CIMP dependendo dos pontos de corte e genes incluídos em um painel foi encontrado, com o dobro de pontos positivos amostras por menos em comparação com a definição mais rigorosa usado

Citation:. Berg M, Hagland HR, Søreide K (2014) Comparação de CpG Ilha Methylator Fenótipo (CIMP) Frequência no cancro do cólon utilizando diferentes Probe- e Gene-Specific Scoring Alternativas na recomendados Painéis multi-Gene. PLoS ONE 9 (1): e86657. doi: 10.1371 /journal.pone.0086657

editor: Hassan Brim, Howard University, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Setembro, 2013; Aceito: 16 de dezembro de 2013; Publicação: 21 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Berg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi em parte financiada por doações da Fundação do Câncer Hermansen Folke (concessão # 424508 para KS para MB como um pós-doutorado) (https://www.folke-fondet.org), Cancer Fund Mjaaland (concessão # 424506 para KS ), o Hospital Research Council Universitário de Stavanger e por subvenções do Instituto de Ciências cirúrgicas da Universidade de Bergen. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro é uma doença genética causada pelo acúmulo de alterações moleculares e modificações no DNA que dirige tumorigênese [1]. Caracterização molecular adequado do cancro genótipo e fenótipos é importante para revelar marcadores para a detecção precoce, o prognóstico ou predição, bem como aumentar a compreensão dos processos de doença que pode fornecer informação para a intervenção terapêutica. O cancro do cólon é um modelo de cancro bem investigada, para os quais os tumores são agora separados em três subgrupos fenotípicas, de acordo com o tipo predominante de aberrações genéticas: a instabilidade cromossómica (CIN) refere-se a alterações no nível do cromossoma (por exemplo, número de cópia alterações); microssatélite instabilidade (MSI) refere-se a alterações em pares de bases-unidades de repetição (por exemplo mudança de base no dinucleótido repetir CA

6), e; CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) denota um espectro de metilação aberrante (por exemplo, hipo ou hiper metilado citosinas na região promotora), em comparação com as células normais [2], [3].

testes CpG-island metilação tem sido proposto como uma ferramenta para a detecção do cancro, prognóstico, e a detecção de doença residual, tanto de sangue ou outros fluidos corporais, [4], e indica que o estado de metilação é de relevância clínica [5] – [9]. Além disso, ensaios específicos de metilação estão comercialmente disponíveis hoje em dia para detectar cancro colo-rectal, quer como teste para a metilação da vimentina em amostras de fezes ou de teste para a metilação de

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no sangue [6], [10].

nos últimos anos, a atenção tem-se centrado sobre a biologia e potencial importância clínica do CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) no CRC [11], [12]. Embora seja geralmente bem aceito que existem etiologicamente e clinicamente subgrupos distintos [13], [14], uma definição precisa de CIMP continua a ser estabelecida, tanto em termos metodológicos e em um nível molecular [15]. O uso crescente de tecnologias de alta capacidade também para estudos de metilação demonstraram grande impacto e sugeriu vários painéis,

por exemplo

para auxiliar na discriminação de tumor colorretal a partir de células epiteliais, diferenciar entre os estágios da doença, grupos de prognósticos, e subgrupos associados a outras características moleculares [16] – [18]. A falta de consenso para determinar o fenótipo CIMP é em parte devido ao fato de que a causa do padrão de metilação alterada permanece em grande parte desconhecidas [13], [19].

Como consequência, vários painéis de genes, técnicas de laboratório, e limiares marcador estão atualmente em uso, todos os quais podem resultar em diferenças na prevalência de CIMP [20]. Uma vez que não existe um padrão universal ou consenso sobre a quantificação do fenótipo, estabelecendo sua verdadeira prevalência é um desafio e dificulta a comparação entre os estudos. Assim, os objetivos deste estudo foi testar sistematicamente vários critérios para definir CIMP em amostras de cancro colo-rectal, e investigar a diferença de frequência CIMP ao alterar os níveis de pontuação.

Métodos

material humano e Estudo tecido de câncer de ética

foi obtida de pacientes com câncer de cólon submetidos a cirurgia no Departamento de cirurgia Gastrointestinal, Hospital Universitário de Stavanger, Noruega. Os pacientes foram recrutados para um estudo prospectivo de linfonodo sentinela, e todos consentiram para estudar a participação antes da inclusão e recuperação de tecidos. A Autoridade Regional de Saúde Noruega Ocidental aprovou o uso de participantes humanos depois de ter escrito o consentimento informado, a aprovação # 197,04. Todos os dados foram tratados de acordo com a declaração de Helsinki.

O tecido foi obtido como descrito anteriormente [21], e biópsias fresco congelado armazenado a -80 graus Celsius. Um conjunto de amostras de 64 estágios II e III, os doentes, e 2 linhas celulares de cancro do cólon (Caco2 e HT29), foram arbitrariamente selecionados para avaliação no estudo atual.

Isolamento DNA

Fresh câncer congelada amostras de tecido, a partir de um número igual de pacientes foram incluídos. Também, uma amostra de referência do epitélio do cólon normal foi obtido garantindo uma distância considerável do lado de fora da margem de ressecção do tumor do cólon. As amostras de DNA foram extraídos utilizando DNeasy Mini kit ou AllPrep DNA . RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha)