Abstract

microbiota do cólon fermentar a fibra não absorvida dietética para produzir quantidades prodigiosas de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA) que beneficiam o hospedeiro através de uma miríade de metabólica, trófico, e os efeitos quimiopreventivos. Os efeitos quimiopreventivos de o butirato de SCFA são, em parte, mediada através da indução da expressão do gene p21. Neste estudo, avaliou-se o papel de microRNA (miRNA) na indução de butirato de expressão p21. Os perfis de expressão dos miRNAs no HCT-116 células e em cancros do cólon esporádicos humanos foram avaliadas por microarray e PCR quantitativa. Regulação da expressão do gene p21 de miR-106 foi avaliada através da UTR 3 ‘de ensaios de repórter de luciferase e de transfecção imita específicos de miARN. Butirato alterou a expressão de 44 miARNs em células HCT-116, muitos dos quais foram aberrantemente expressadas em tecidos de cancro do cólon. Os membros da família de miR-106 foram reduzidos na antiga e aumentou neste último. a expressão da proteína p21 induzida pelo butirato foi atenuado por tratamento com um miR-106b mímica. construções 3’UTR-repórter mutantes p21 expressos em HCT-116 células confirmados miR-106b objectivo directo. Butirato de diminuição da proliferação HCT-116, um efeito revertido com a adição do miR-106b mímica. Concluímos que SCFA derivados do micróbio regular a expressão génica do hospedeiro envolvidos na homeostase intestinal, assim como carcinogênese através da modulação dos miRNAs

Citation:. Hu S, Dong TS, Dalal SR, Wu F, Bissonnette M, Kwon JH, et ai. (2011) A cadeia curta Microbe-Derivado de ácido gordo butirato alvos miRNA-Dependent Expression Gene p21 no cancro do cólon humano. PLoS ONE 6 (1): e16221. doi: 10.1371 /journal.pone.0016221

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 23 Agosto, 2010; Aceite: 16 de dezembro de 2010; Publicação: 20 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Human Project Microbiome (DK083993, HG004858), R37 DK47722 (EBC), K08 DK078046 (JHK), a Digestive Disease Research núcleo central DK-42086, da Universidade de Chicago, e os gastro-intestinais investigação da Fundação Associates ‘Board (SRD). Os formandos foram apoiados por uma concessão de Bolsa de Investigação da Doença de Crohn e Colite Fundação da América (SH), T35 DK62719 (TSD) e T32 DK07074 (SRD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a maioria dos cancros do cólon esporádicos humanos desenvolvem gradualmente à medida que acumular alterações na expressão de gene transformar epitélio do cólon normal adenocarcinoma. Este processo envolve uma interação entre fatores genéticos e ambientais, este último apoiado pela associação epidemiológica entre o aumento da incidência de cancros e fatores como o aumento da longevidade, exposição a agentes cancerígenos colorretal e dietas em países altamente industrializados [1]. Entre os factores de risco dietéticos propostas é baixo teor de fibra, o que pode diminuir a biodisponibilidade de ácidos gordos de cadeia curta (SCFA), que são formados por fermentação anaeróbia microbiana de fibra dietética [2]. SCFA, tais como acetato, propionato, butirato e são produzidos em quantidades enormes e são os aniões mais abundantes no fluido luminal do cólon e fezes [3]. Estes produtos microbianos não só proporcionam uma importante fonte de energia para o epitélio do cólon, mas também têm efeitos tróficos generalizados que incluem a regulação de genes do hospedeiro envolvidos na manutenção da homeostase intestinal [4].

Em indiferenciado, altamente proliferativa maligna células, butirato inibe a proliferação e induz a diferenciação através de uma variedade de mecanismos, incluindo alterações na metilação do ADN, a inibição selectiva de fosforilação de histona e desacetilação da histona (HDAC), e modulação de quinase intracelular de sinalização [5] – [7]. Em uma linha de células humana do cólon epitelial (HT29), foram identificados genes responsivos 221 butirato envolvidos na proliferação, diferenciação e a apoptose [6]. Entre os genes alterados por tratamento com butirato foram muitos envolvidos na regulação do ciclo celular, tais como o p21 a ciclina dependente inibidor de quinase, GADD45A, PTEN e [6].

Sob condições normais, a proliferação é fortemente regulada através da acção de ciclinas, quinases dependentes de ciclina (CDKs), e inibidores de CDK que regulam as transições de G1 para a fase S e G2 para a mitose e actuam como pontos de controlo para impedir a replicação de ADN, se estiver danificado [8]. Em resposta a sinais que indicam danos no DNA, p21 e p27 se ligam a complexos ciclina-CDK e induzir a paragem do ciclo celular [8], [9]. No entanto, no cancro, este processo regulado de divisão celular e crescimento é perdida. Por exemplo, a perda da função de p21 inibidor de quinase dependente da ciclina G1 ponto de verificação tem sido associada a carcinogénese e p21 perda é observada em 79% dos tumores do cancro do cólon por imuno-histoquímica [10], [11].

butirato induz p21 transcrição do gene através de uma via independente de p53 envolvendo a inibição não-competitiva de HDAC [12] – [14]. No entanto, a possibilidade de que algumas das ações de butirato na expressão do gene p21 pode ser mediada através de mecanismos de translação dependente de miRNA não tenha sido previamente exploradas. Os inibidores de HDAC foram estudados recentemente como um novo grupo de anti-cancro epigenética ferramentas de tratamento, e um inibidor de HDAC, suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA), é aprovado pela FDA para o tratamento do linfoma cutâneo da célula T [15]. Além disso, os inibidores de HDAC foram implicados na regulação de miARN em vários tipos de malignidades. Tratamento da linha de células do cancro da mama SKBR3 com o LAQ824 inibidor HDAC ácido hidroxâmico levou a mudanças significativas em ~ 40% dos miRNAs expressos da célula [16]. tratamento SAHA do carcinoma pulmonar de linha de células A549 humana levou a alterações significativas na expressão de 64 miRNAs [17]. A influência do inibidor de HDAC e butirato produto microbiano na expressão de miARN em tecidos de cancro do cólon não tem sido investigada.

miARNs são ± 22 nucleótidos, RNAs que desempenham um papel importante na regulação da proliferação celular, apoptose não codificante, e diferenciação [18]. Mais do que 1000 miARNs humanos foram identificados, e a maioria são acreditados para atingir centenas de genes [19]. A desregulação da expressão de miARN pode contribuir para a carcinogénese pelo aumento da expressão do proto-oncogene ou a regulação negativa supressores de tumor [20]. Por exemplo, miARNs regular muitas proteínas chave nas vias de sinalização de cancro colo-rectal, v.g. a família miR-106b reduz a expressão de p21 e afecta a progressão do ciclo celular [21] – [23]. Entre o miR-106b previu metas, silenciamento de p21 com siRNA fenocópias mais estreitamente ganho de miR-106b da função [22].

Neste estudo, a hipótese de que os efeitos anti-câncer do micróbio derivado AGCC butirato pode ser mediada, em parte, através de mudanças na expressão de miRNA. Realizamos estudos miRNA microarray no HCT-116 células humanas de câncer de cólon tratadas com butirato e encontraram alterações significativas nos perfis de miRNA, incluindo diminuição da expressão da família miR-106b. miRNA microarrays análise de tipo esporádica cancros do cólon humano encontrado aumento da expressão da família miR-106b. Butirato foi encontrada para induzir a expressão de p21, o que foi associado com uma diminuição significativa na proliferação celular. A adição de um mímico de miR-106b inverteu o aumento da expressão de p21 e diminuição da proliferação de células induzida pelo butirato. Estas descobertas descobriram um mecanismo único de interação microbiana com a expressão do gene de acolhimento que envolve alterações de perfis de miRNA para conter o ciclo celular e inibem a proliferação de células de câncer de cólon.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

biópsias de cólon humanos cirúrgicas foram obtidas de pacientes com câncer de cólon na Universidade de Chicago Medical Center sob um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board. consentimento informado por escrito foi obtido antes da recolha de amostras de tecido. Todas as investigações clínicos utilizando seres humanos foram conduzidos de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Cultura celular

Humanos HCT-116 células cancerígenas do cólon foram adquiridas de ATCC. As células foram cultivadas a 37 ° C em meio DMEM rico em glicose (Invitrogen) contendo 10% (vol /vol) de soro fetal bovino, 50 ug /ml de L-glutamato, 50 ug /ml de estreptomicina e 50 U /ml de penicilina. As células foram tratadas com butirato de 1-2 mM durante 24 a 48 horas antes da colheita, para cada ensaio individual. As células foram lavadas duas vezes e raspadas para gelada de tampão fosfato salino (PBS), sedimentadas (14000 g x 20 seg), em seguida, lisadas por extracção de ARN e proteína.

biópsias do cólon humano

cirúrgico biópsias do cólon humano a partir de tecido tumoral e normal circundante aparecendo mucosa do cólon (pelo menos, 5 cm de distância da fronteira de tumor) foram obtidos por um cirurgião colorrectal. Após remoção, as biópsias foram imediatamente colocadas em gelo e lavadas em PBS arrefecido em gelo antes do rompimento das células para extracção de ARN.

miARN microarray

O ARN total foi extraído a partir de células HCT-116 e do cólon humano amostras de tecido utilizando o kit de isolamento Mirvana ™ miRNA (Ambion) de acordo com o protocolo do fabricante. células HCT-116 miRNA foi analisada usando o microarray v.11.0 miRCURY LNA ™ (Exiqon) que contém sondas de captura dirigidos a todos os miRNAs para o homem, rato, ou rato registrado no miRBase versão 13 no Instituto Sanger. Todas as amostras foram agrupadas para criar uma referência comum. Um ug de ARN total de cada amostra e a referência comum reunida foi marcado utilizando o kit de marcação poder matriz miRCURY ™ LNA (Exiqon, Dinamarca). O Hy3 ™ marcado com amostras e uma hY5 ™ marcado com amostra de RNA de referência foram misturados por pares e hibridado com as matrizes LNA miRCURY ™. As lâminas de microarray foram digitalizadas utilizando o Sistema G2565BA Microarray Scanner da Agilent (Agilent Technologies, Inc., EUA) e a análise de imagem foi realizada utilizando o software Imagene 8,0 (BioDiscovery, Inc., EUA). Os sinais quantificados foram fundo corrigida (Normexp com valor de deslocamento 10) e normalizados utilizando o Lowess global (localmente ponderadas Smoothing Scatterplot) algoritmo de regressão [24]. Os dados são expressos como o log2 normalizado transformado relação Hy3 /hY5.

De uma maneira semelhante, miARNs de tecido do cólon humanos foram analisados ​​utilizando miRvana miARN Bioarrays V.2 (Ambion), o qual utiliza a versão 8.0 da sequência miRBase banco de dados. As amostras foram marcados com o kit de marcação de miRvana miARN e hibridado com a bioarrays miARN acordo com as instruções do fabricante. As matrizes foram escaneados usando o GenePix4000B na Universidade de Chicago Functional Genomics Facility Core. Um total de 12 perfis de miARN foram gerados a partir de 6 amostras de tecido do cólon emparelhados.

-PCR em tempo real para miARNs

O ARN total foi extraído a partir de células HCT-116 sedimentadas por Trizol (Invitrogen, Grand Island , NY) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA complementar foi sintetizado a partir de amostras de ARN total extraído de células HCT-116 ou tecidos do cólon humano utilizando o Kit ™ NCode miARN First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizado com um iCycler (Bio-Rad), utilizando o Supermix iQSYBR verde PCR (Bio-Rad) com os iniciadores específicos e um iniciador de miARN qPCR universal de acordo com o protocolo do fabricante para o kit NCode (Tabela S1). Foi utilizado o protocolo de duas etapas quantificação de bicicleta (45 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e, em seguida, 60 ° C durante 15 segundos). O valor de Ct é definido como o número do ciclo em que a fluorescência atravessa um limiar fixo acima da linha de base. Um pequeno RNA nucleolar, RNU48, foi medida como controle endógeno [25]. Para uma quantificação relativa, mudanças de dobragem foram medidos utilizando o método ΔΔCt. Para cada amostra, o valor de Ct de cada miARN foi medida e comparada com RNU48 como ΔCt, (ΔCt = Ct

miARN – Ct

RNU48). A mudança dobra de miRNA em amostras experimentais relativamente ao controlo de amostras foi determinada por 2

-ΔΔCT, onde ΔΔCt = ΔCt

Desconhecido -ΔCt

Controle [26]

.

real -tempo de PCR para p21 ARNm

O ARN total foi extraído a partir de células peletizadas HCT-116 com Trizol. O DNA complementar foi sintetizada utilizando SuperScript III (Invitrogen) e um iniciador aleatório hexonucleotide. Os iniciadores de sentido e anti-sentido para p21 (CDKN1A, NM_000389.3) são: 5′-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGCTT-3 ‘e 5′-AGAAATCTGTCATGCTGGTCTGCC-3′; para GAPDH: 5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3 ‘e 5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3’. PCR em tempo real foi realizado com um iCycler usando Supermix iQSYBR verde PCR (Bio-Rad). Para cada amostra, o valor de Ct de ARNm de p21 foi medida e comparada com o controlo endógeno GAPDH como ΔCt, (ΔCt = Ct

p21 – Ct

GAPDH). A mudança de dobragem de miARN em amostras experimentais relativamente a amostras de controlo foi determinada por 2

-ΔΔCT.

Western Blot

sedimentadas células HCT-116 foram homogeneizados em Tris 10 mM, pH 7,4 , MgCl 5 mM de

2, cocktail inibidor de protease completo (Roche Molecular Biochemicals), 50 U /ml de DNase (Amersham), e 50 U /ml de RNAse (Ambion). A proteína foi quantificada utilizando o método de ácido bicinconínico. A proteína foi solubolized em solução de paragem Laemmli 3x por aquecimento a 65 ° C durante 10 minutos.

Vinte microgramas de amostras de proteína foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas em tampão Tris 25 mM, pH 8,8 ; glicina 192 mM; Metanol a 15% vol /vol. As membranas foram bloqueadas com 5% p /v de leite em pó não gordo em Tween-solução salina tamponada com Tris (TTBS). Os anticorpos primários, específicos para p21 (BD Bioscience), Hsc70 (SPA815; Stressgen) e β-actina (Cell Signaling), foram adicionados e incubados durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas com TTBS, incubadas com anticorpos secundários espécie apropriada de rábano silvestre conjugado com peroxidase (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante 1 hora à temperatura ambiente, e desenvolvido usando um sistema de quimioluminescência aumentada (Supersignal; Pierce, Rockford, IL).

Quantificação de imagens foi feita por densitometria utilizando NIH imagem J 1,54 software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

proliferação celular Ensaio

A proliferação celular foi medida utilizando o reagente WST-1 (Roche Applied Science), de acordo com o protocolo do fabricante. As células HCT-116 foram cultivadas numa placa de fundo plano de 96 poços. Depois de atingir 50% de confluência, as cavidades foram tratadas com a concentração indicada de butirato durante 24 horas. As placas foram lidas num leitor de microplacas a 450 nm antes e 45 minutos após a adição do reagente WST-1. O comprimento de onda de referência foi de 650 nm. as taxas de proliferação de células foram calculadas de acordo com o protocolo do fabricante.

transfecção celular com miARN

Transit-LT1 (Mirus, WI) de reagente de transfecção foi usado para transfectar células HCT-116 com um miR- engenharia 106b (Pré-mir da Ambion miRNA Precursor Moléculas) de acordo com o protocolo do fabricante. Um controle de miARN (miR-C), com teor de GC idêntico, mas nenhuma homologia de sequência com o miR-106, foi utilizado como um controlo. As células foram transfectadas durante 48 horas antes da colheita.

luciferase repórter Ensaios

Modificado pGL3 constrói com o 3’UTR p21 a jusante da sequência de codificação da luciferase do pirilampo foram uma generosa oferta do Dr. V. Narry Kim do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Nacional de Seul [27]. Seis horas após o tratamento com butirato, células HCT-116 foram transf ectadas transitoriamente com construções de plasmídeos pGL3 modificados e pRL-TK (Renilla luciferase dirigido pelo promotor da timidina-quinase, E2241, Promega) utilizando o reagente de transfeco TransIT LT-1. As células foram colhidas por agitação em 500 ul de tampão de lise (Promega). Firefly e

Renilla

actividades da luciferase no lisado foram determinados em triplicado com uma luciferase Dual-sistema de ensaio de repórter, de acordo com as instruções do fabricante (Promega). atividade luciferase Firefly foi normalizado para

Renilla

atividade luciferase.

Análise Estatística

Os resultados são apresentados como média ± SEM para o número indicado de experimentos. Os resultados de várias experiências foram analisadas pelo teste t de estudante ou ANOVA utilizando a correcção de Bonferroni para comparações múltiplas.

Para as matrizes de miARN, um t-teste bilateral calculada entre os grupos de amostra e de referência identificado com P miARNs -Valores menor do que 0,05. Estes miRNAs foram então escolhidas para um estudo mais aprofundado com RT-PCR.

Resultados

butirato altera a expressão miRNA no HCT-116 células humanas de câncer de cólon, incluindo os membros do miR-106b

família

Para estudar os efeitos de butirato na expressão miRNA em células de cancro do cólon, perfis de miRNAs em células HCT-116 tratadas com butirato de expressão foram medidos utilizando um microarray. As células HCT-116 tratados com o veículo foram analisada como controlo. Quarenta e quatro miARNs demonstraram alterações significativas na expressão em resposta ao tratamento com butirato. As alterações na expressão de 13 dos 26 miARNs que diminuiu e 5 dos 18 miARNs que aumentaram foram confirmadas utilizando em tempo real, PCR quantitativo (figura S1). Trinta e um dos 44 miARNs com alterações na expressão são mostrados no mapa de calor no painel da esquerda da Figura 1A. Vários membros do miR-17-92a, miR-18b-106a, e clusters miR-25-106b diminuíram significativamente em resposta a butirato.

) perfis de microarray miRNA A foram realizados em RNA extraído de HCT- 116 células tratadas com veículo ou butirato 1 mM e tecidos de cólon humano a partir de pacientes com cancro do cólon e esporádica tecido com aparência normal adjacente. Os dados foram normalizados utilizando o algoritmo de regressão Lowess global e é expressa como log de base 2 rácios transformadas da amostra de sinal para o sinal de referência de controlo de piscina. mapas de calor são representados. A cor vermelha no mapa de calor representa o aumento da expressão em comparação com o controlo de referência em pool, e verde representa a diminuição da expressão em comparação com o controlo em pool. As alterações na expressão do miR-17 – 106b família foram confirmadas por PCR em tempo real em B) células HCT-116 e C) os tecidos do cólon humano. Os resultados são médias ± EP, n = 4. * indica P . 0,05 para a amostra em relação ao controle

os níveis de expressão destes miARNs também foram avaliadas em cancros do cólon humanos e esporádicos em torno do cólon com aparência normal pela microarray e estão apresentados no painel da direita da Figura 1A. Os miARNs diminuiu nas células tratadas com butirato de HCT-116 foram aumentados dramaticamente em tecidos de tumor, em comparação com controlos normais. miRs-17, -20, -20b, -93, -106a e -106b foram todos diminuída em resposta ao tratamento com butirato. Estes miRNAs compartilham a mesma sequência da região de sementes e, assim, atingir os mesmos sítios de ligação nas 3’UTRs de mRNAs alvo. Usando PCR em tempo real, que confirmou que o butirato regulada estes miRNAs no HCT-116 células (Figura 1B). Nós também confirmou que estes miRNAs foram altamente sobre-expressos em amostras de câncer de cólon humano (Figura 1C), sugerindo que alguns efeitos anti-câncer de butirato são mediadas por suprimir os miRNAs que são regulados positivamente no cancro do cólon.

miR -106b inibe a expressão da proteína p21 induzida pelo butirato

estudos anteriores mostraram que a UTR 3 ‘de p21, que regula a proliferação de células de cancro, contém dois sítios de ligação para o miR-17 – 106b sequência de sementes (Figura 2A) e é inibida por estes miARNs em vários tipos de cancro [revisto em 13-15, 22]. Nós, portanto, analisou os efeitos de butirato e um miR-106b imitar em mRNA p21 e os níveis de proteína em células HCT-116. Tal como mostrado na Figura 2B e 2C, butirato de aumento da expressão da proteína p21 quatro vezes após 24 horas de tratamento. Um imitador de miR-106b exógeno humedecido a expressão da proteína p21 induzida pelo butirato, em comparação com as células tratadas com butirato sozinho enquanto o controlo moléculas de miARN não teve nenhum efeito sobre a expressão de p21.

A) Representação esquemática das regiões de sementes comuns na miR-17 – família 106b que visam a 3’UTR p21 em dois locais. As células HCT-116 foram tratadas com butirato de (2 mM) ou veículo e foram transfectadas com miR-106b ou imitador controlo miARN (miR-C) durante 24 horas antes da colheita. B) Western blots para p21, β-actina e Hsc70 são mostrados, e são representativos de 4 experiências individuais, todos com resultados semelhantes. C) a densitometria de Western blot de p21 normalizada para p-actina. D) a abundância de ARNm de p21 foi analisada por PCR em tempo real. Os resultados são médias ± EP, n = 4. * indica P 0,05 em relação ao basal. # Indica p 0,05 comparado com o controlo

Para determinar o efeito de butirato e miARNs na expressão do gene p21, p21 níveis de mRNA celular foram medidos por PCR em tempo real (Figura 2D).. Butirato induziu um aumento de 3,6 vezes na abundância destas ARNm de p21. Em contraste, o mímico miR-106b não teve efeito sobre a expressão do mRNA p21.

O 3’UTR de p21 medeia regulação de translação por butirato e miR-106b

Para investigar o efeito de miR- 106b na regulação traducional de expressão de p21, células HCT-116 foram transientemente transfectadas com vectores repórter de luciferase modificados que contêm tanto o tipo selvagem 3’UTR p21 ou p21 3’UTRs que contêm mutações em qualquer um ou ambos do miR-106b locais de ligação (figura 3A). expressão de luciferase de pirilampo foi utilizada para avaliar a regulação cis através do p21 UTR 3 ‘. O vector pRL-TK que expressa luciferase de Renilla foi co-transfectado para controlar a eficiência da transfecção. Em condições basais, as mutações individuais em regiões alvo miR-106 na 3’UTR de p21 nos nucleótidos 468-474 e nucleótidos 1148-1154 resultou em um aumento de 28% e 26% na actividade de luciferase, respectivamente (Figura 3B). Além disso, as mutações em ambas as regiões alvo miR-106 resultou em um aumento de 57% na actividade de luciferase, o que sugere que ambos os locais de ligação de mediar a inibição da expressão de p21 miARN basal em células cancerosas.

A) Representação esquemática das construções repórter de luciferase contendo o ARNm de p21 da 3’UTR, que inclui dois sítios de ligação para a família de miR-17-106b. As mutações foram geradas nestes locais alvo de miR-106. As células HCT-116 foram transientemente co-transfectadas com vectores de luciferase pGL3 firefly contendo o tipo selvagem ou mutada de p21 3’UTR e pRL-TK luciferase de Renilla vector de controlo. As células também foram tratadas com butirato de (2 mM) ou veículo e moléculas de miARN miR-106b ou imitador de controlo (miR-C). As células foram colhidas para medições de luminescência de 48 horas após a transfecção. B) expressão de luciferase basal de repórter constrói com o tipo selvagem ou mutado 3’UTR p21. * Indica P 0,05 comparado com p21 3’UTR C) a expressão de luciferase nas células após o tratamento e butirato de miARN. * Indica P 0,05 comparado com o controlo. Os resultados são médias ± EP, n = 4.

butirato estimulou a actividade de luciferase de 85% em relação ao controlo em células HCT-116 transfectadas com luciferase contendo p21 3 ‘UTR do vetor (Figura 3C). efeitos do butirato sobre a expressão da luciferase foram revertidos pela adição de imita o miR-106 exógenos, mas não controla moléculas de miARN (miR-C). Além disso, a actividade de luciferase de células HCT-116 transfectadas com o vector quimérico contendo ambos os locais alvo de miR-106 mutantes não foi alterado com o tratamento com butirato ou com butirato na presença de exógena de miR-106.

efeito do Butirato sobre proliferação celular é inibida pela miR-106b

Desde p21 inibe a progressão do ciclo celular, que examinaram o papel do miR-106 sobre os efeitos anti-proliferativos de butirato. As células HCT-116 foram tratadas com várias diluições de butirato durante 24 horas e um ensaio de proliferação de WST-1 foi realizada. Como mostrado na Figura 4A, dependentemente da dose inibiu a proliferação de células butirato. As concentrações de butirato anti-proliferativas eram na gama fisiológica de 0,5 a 20 mm [28], [29]. As células transfectadas com exógeno miR-106b ou controlo durante 24 horas antes da exposição butirato de 2 mM foram também analisadas (Figura 4B). A inibição induzida pelo butirato de proliferação celular foi revertido pela adição de moléculas de imitar o miR-106 de uma forma dependente da dose (Figura 4B). Em contraste, controlar moléculas de miARN (MIR-C) não mostrou qualquer efeito sobre a inibição induzida pelo butirato de proliferação celular.

HCT-116 a taxa de proliferação de células foi medida com o kit de proliferação de WST-1. A) As células HCT-116 foram tratadas com a concentração indicada de butirato ou veículo durante 24 h antes da medição de WST-1. * Indica P 0,05, comparado com basal B) As células HCT-116 foram transfectadas com o miR-106b ou imitador controlar miARN (miR-C) com as concentrações indicadas imediatamente antes do tratamento com butirato de 2 mM. As células tratadas apenas com butirato foram analisadas como controle. * Indica P 0,05 comparado com butirato sozinho. Os resultados são médias ± SE, n = 5.

Discussão

Neste estudo, identificamos, pela primeira vez, um importante papel regulador de crescimento para miRNAs epiteliais do cólon na mediação do efeitos de cadeia curta butirato de ácido gordo derivado de micróbios em expressão génica do hospedeiro. Interessantemente, em células HCT-116, butirato suprimida muitas das mesmas miARNs aumento em cancros do cólon humanos. Um destes miARNs, miR-106, verificou-se como alvo p21. Butirato de tratamento e miR-106 de uma construção repórter de luciferase 3’UTR p21 em células HCT116 indica que a expressão da p21 estimulada-butirato é inibida em translação em parte por miR-106b. Esta inibição parcial por miR-106b confirma os relatos anteriores que o butirato também regula a expressão de p21 através de um mecanismo independente de miARN, através da sua inibição de HDAC [7], [13], [14]. Propomos que o butirato produto microbiano regula o ciclo celular através de ambos regulação epigenética e de translação através da sua dupla função como um inibidor de HDAC e inibidor da expressão de miR-106 (Figura 5).

butirato inibe deactylases de histonas (HDAC) , permitindo um aumento do acetilação da histona, diminuição maior ordem de dobragem da cromatina, e aumento da transcrição de p21. Butirato também diminui a expressão de miR-106b, e vários outros miARNs com a mesma sequência de região de sementes. A família de miR-106 inibe a tradução de p21, e, por conseguinte, a diminuição da expressão da família de miR-106b conduz a um aumento da tradução de p21.

Estes resultados têm implicações importantes para a homeostase intestinal e carcinogénese. Estes dados sugerem que estes miARNs desempenhar um papel na carcinogénese do cólon e que sua redução por butirato é um mecanismo importante dos seus efeitos anti-cancro. Seis destes miARNs são da mesma família miARN (miR-17, o miR-20a, miR-20b, o miR-93, o miR-106a, e miR-106b), partilham uma sequência de semente idênticos, e, assim, atingir os mesmos locais de ligação nas 3’UTRs de mRNAs alvo. Portanto, a supressão dos seus genes-alvo durante o processo carcinogénico pode representar uma resposta de células modelado para promover a proliferação e /ou a manutenção do estado indiferenciado de células.

Porque muitos miARNs também estão localizados em regiões intrónicas de genes que codificam, a resposta miRNA é provável coordenada com genes ativados transciptionally que contribuem para o processo global de carcinogênese. Como um exemplo pertinente aos nossos achados, a polycistron miR-106b-25 está localizado dentro intron 13 do gene MCM7 no cromossoma 7q22.1 [23]. MCM7 (proteína manutenção minichromosome 7) regula a replicação do ADN durante a fase S. Em células quiescentes, os níveis de ARNm humanos MCM7 são quase indetectáveis, mas a sua expressão é induzida como as células entram no ciclo celular. O promotor MCM7 tem três locais de E2F, três caixas de GC, e uma caixa de E [30]. No carcinoma hepatocelular (HCC), a expressão do precursor de miR-106b se correlaciona fortemente com a expressão MCM7, indicando que o miR-106b-25 polycistron é coordenadamente transcrita sob a influência do promotor MCM7. Elevados níveis de expressão do factor de transcrição E2F1 em HCC também correlacionada com um aumento da expressão de miR-106 [31]. Em células de cancro gástrico, E2F1 também parece regular o miR-106b-25 expressão em paralelo com o aumento na expressão MCM7 [32]. Em fibroblastos de ratinho transformadas com oncogenes Ras e EIA, butirato diminui transcritos E2F1 e proteínas, bem como a activação do promotor [33]. Assim, o butirato pode exercer o seu efeito sobre a expressão de miR-106b via diminuição da expressão E2F1, embora mais estudos são necessários em HCT-116 células a analisar esta possibilidade.

Como foi referido anteriormente, a desregulação da expressão de miRNA pode influenciar a carcinogênese quando os alvos de miRNA são supressores tumorais ou oncogenes. Embora o tratamento com miR-106b conduz a uma diminuição da expressão da proteína p21, os níveis de ARNm de p21 não mudam, o que é consistente com relatórios prévios de que o miR-106 regula p21 através da inibição de translação em vez de a estabilidade do ARNm [32]. Embora regulação miR-106b de expressão de p21 tem sido descrito em muitos tipos de células, não há dados contraditórios sobre o mecanismo desta interacção. Nas células epiteliais mamárias humanas normais e fibroblastos de pulmão, miR-106 diminuiu o ARNm de p21 em cerca de 40% [22]. Em contraste, no carcinoma hepatocelular, a expressão da p21 não apresentou correlação com a expressão do cluster miR106b-25, e não parece ser um alvo destes miARNs neste tipo de células [31]. Em uma linha de carcinoma gástrico humano derivado de células, miR-106b reprimiu a expressão da proteína p21, mas não causou uma mudança significativa nos níveis de mRNA p21 [32].

Em resumo, descobrimos um novo mecanismo de acção para efeitos anti-câncer do butirato que envolvem a modulação de perfis de miRNA e expressão de genes-tradução dependente. Como um exemplo, butirato induz a expressão de p21, uma molécula reguladora fundamental da paragem do ciclo celular, através da supressão de membros da família de miR-106. butirato de inibição de miR-106 também está associada com uma diminuição significativa na taxa de proliferação de células de cancro. Este último é invertida pela adição de imita o miR-106. Esses achados têm descoberto um exemplo único de regulação microbiana da expressão do gene de acolhimento que retarda o ciclo celular e inibe a proliferação de células de câncer de cólon.

Informações de Apoio

Figura S1.

butirato altera significativamente a expressão de quarenta e quatro miRNAs em células HCT-116. As células HCT-116 foram tratadas com butirato 1 mM durante 24 horas. ARN total isolado foi submetido a miARN hibridação matriz. Quarenta e quatro miARNs demonstraram alterações significativas na expressão em resposta ao tratamento com butirato. dados de microarray foram normalizados utilizando o algoritmo de regressão Lowess global e é expressa como log de base 2 rácios transformadas da amostra de sinal para o sinal de referência de controlo de piscina. As alterações na expressão de miRNA foram confirmados usando em tempo real, PCR quantitativo para 13 dos 26 miRNAs que diminuíram e 5 dos 18 miRNA s que aumentaram

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016221.s001

( TIF)

Tabela S1.