Sumário

Os exossomas são pequenas vesículas de membrana extracelulares de origem endocítica liberados por muitas células que poderiam ser encontrados na maioria dos fluidos corporais. As principais funções do exossomos são comunicação celular e resíduos celulares clean-up. Este estudo foi realizado para determinar o envolvimento de exossomos na regulação da sensibilidade da linha celular A549 cancro do pulmão de cisplatina (DDP). Quando DDP foi adicionada às células A549, exossomos secreção foi reforçada. A adição dos exossomas segregados para outras células A549 aumentou a resistência dessas células A549 a DDP. Após a exposição da A549 para DDP, os níveis de ARNm e vários miARNs alegadamente associados com sensibilidade expressão DDP mudou significativamente nos exossomas; essas mudanças podem mediar a resistência de células A549 para DDP. Os exossomas libertadas por células A549 durante a exposição DDP diminuiu a sensibilidade de outras células A549 a DDP, que podem ser mediados por miARNs e troca de mRNAs por exossomas através da comunicação célula-a-célula. Embora o mecanismo detalhado da resistência permanece incerto, nós acreditamos que a inibição da formação de exossomos e liberação pode apresentar uma nova estratégia para o tratamento do câncer de pulmão no futuro

Citation:. Xiao X, Yu S, Li S, Wu J , Ma R, H Cao, et al. (2014) exossomas: Diminuição da sensibilidade das células do câncer pulmonar A549 à cisplatina. PLoS ONE 9 (2): e89534. doi: 10.1371 /journal.pone.0089534

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de outubro de 2013; Aceito: 22 de janeiro de 2014; Publicação: 21 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xiao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.372.396) e os seis Talent Pico dos assuntos humanos Salão na província de Jiangsu (No. 40). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no Caner palavra e não-pequenas células do pulmão (NSCLC) é a forma mais comum de câncer de pulmão. Os pacientes com um tumor agressivo, tais têm uma taxa baixa de sobrevivência de cinco anos menos do que 20%, o que é mais provável atribuída à doença metastática no momento do diagnóstico. Embora muitos fármacos alvo, tais como erlotinib e cetuximab poderia aumentar a sobrevivência global dos doentes com NSCLC, platina-dupleto quimioterapia continua a ser o tratamento mais importante para os pacientes com NSCLC avançado.

platina (DDP) é um agente danificador de ADN que poderia entrar nas células tumorais e causar aquation e hidrólise para formar espécies reactivas de platina [1]. Aquated DDP geralmente reconhece o DNA como alvo principal e interage com o ADN, levando à formação de intercadeias e /ou reticulações intracadeia [2]. O sistema (DDR) de resposta de ADN-danos e diversas vias de sinalização são activados [3], e os níveis de expressão de RNAs pode ser influenciada de acordo com [4]. Muitos pacientes exibir qualquer insensibilidade inata para a droga ou DDP-insensibilidade recorrente da doença após um período inicial de tratamento. Vários mecanismos estão envolvidos na regulação da sensibilidade de células tumorais para DDP; estes mecanismos incluem a acumulação intracelular e efluxo de DDP [5], a capacidade de reparo do DNA, a tolerância a lesões de DNA não reparados [6], e regulação de vários genes [7].

Os exossomas são vesículas de membrana extracelular pequenas, o que poderia ser segregada por muitos tipos de células tumorais e existem em mais fluido corporal [8], [9]. Independentemente da sua origem, exosomes têm composições semelhantes de proteína, que podem ser classificados em três grandes grupos: proteínas jangada genuínos, citoesqueleto como proteínas e proteínas de choque térmico [10]. vesículas internas são formadas pela brotamento para dentro de células conhecidas como endossomas multivesiculares (MVE). Fusão do copolímero MVE com a membrana de plasma conduz à libertação das vesículas internas conhecidas como exossomas [11]. Os exossomas poder viajar para as células circundantes ou tecidos distantes para exibir funções tais como a estimulação imunitária, supressão imune [12], a indução da proliferação e da tolerância [13] – [15], transferência de material genético [10] e a remoção de lixo [16]. Os exossomas contêm uma quantidade substancial de ARN e pode ser transferido a partir de uma célula para outra [10], contribuindo, assim, para a proliferação e metástases de cancro e desenvolvimento de cancro [13], [14], [17], [18]. No entanto, com o melhor de nosso conhecimento, o envolvimento de exossomos na regulação da sensibilidade das células de câncer de pulmão para DDP permanece desconhecida.

Uma vez exposto a DDP, as células tumorais geralmente se adaptar ao microambiente e ajustar à estimulação. Desde exossomos são relatados para estar envolvida na comunicação celular, temos a hipótese de o possível envolvimento de exossomos na regulação de respostas de células A549 para DDP. Especificamente, exosomes liberadas pelas células A549 durante a exposição DDP pode alterar a sensibilidade das células circundantes para DDP. Além disso, os ARN exosomal pode ser transferido a partir de uma célula para outra [10]. Como tal, é suposto que alguns miARNs e mRNAs alegadamente associados com resistência DDP pode ser transferido a partir de uma célula para outra pelo exossomas. MiR-21, miR-98, miR-133b, miR-138, miR-181.º e miR-200c [19] – [24] teriam sido associada com a regulação da sensibilidade DDP, enquanto ERCC1, BRCA1 e RRM1 [25] – [27 ] foram relacionados à resistência DDP. Para testar nossas hipóteses, estes miRNAs e mRNAs foram selecionados para estudar preliminarmente o seu envolvimento no processo de resistência DDP.

Resultados

Caracterização de exossomas liberada pelas células A549

Para assegurar o isolamento bem sucedido de exossomas, os exossomas recolhidos foram observadas por TEM (transmissão de microscópio electrónico) e analisados ​​por Western blot (Figura 1A). aglomerados microvesículas exibiu vesículas redondos de medição de 30-100 nm de diâmetro (Figuras 1B, 1C). A Figura 1D mostra a expressão de CD63, um membro da família tetraspanina que se localiza em vesículas internas exosomal, como uma banda dupla em exossomas e como uma banda de luz nas células.

(A) exossomo método de isolamento utilizado neste estudo. (B, C) Transmissão elétron microscópico imagem dos exossomos. Os exossomas são pequenas vesículas de medição de 30 nm a 100 nm de diâmetro. (D) Western blot de CD63 e β-actina em exossomos e células.

Cellular Efeito das células A549 à cisplatina

avaliação dose-resposta foi realizada neste estudo. Uma concentração de 3 ug /mL DDP foi seleccionado para o nosso protocolo desde esta dose causou a morte de cerca de 50% de células A549 (Figuras 2A, 2B). Para testar o efeito da DDP sobre a libertação de exossomos, exosomes foram quantificados com BCA; a curva padrão de proteína, foi mostrado na Figura 2C. Como se mostra na Figura 2D, a quantidade de exossomas libertado por cada célula durante a exposição DDP foi maior do que em condições normais, o que indica um aumento significativo em exossomas libertadas por células A549 após exposição a DDP.

(A) dose resposta entre a viabilidade de células A549 (%) e a concentração de cisplatina (1-10 ug /mL) durante 48 h. (B) Imagem microscópica das células A549 tratadas com 0 e 3 ug /mL de cisplatina. As imagens foram obtidas com uma ampliação de 100 x. (C, D) Quantidade de exossomas determinado através da curva padrão e aumentada BCA secreção de exossomas normalizados para o número de células após a exposição de células A549 à cisplatina. (E) os níveis de expressão diferencial dos seis miARNs em células após exposição de células A549 à cisplatina. (F) Diferencial níveis dos dois miARNs expressão em exossomas após a exposição de células A549 à cisplatina. (G) dobrável mudanças na expressão de miR-21 e miR-133b em exossomos são mais elevados do que aqueles em células. As barras indicam média ± SD de três réplicas. * Indica p . 0,05 contra grupos de controlo

Para determinar se exosomes podia informações de transporte, as expressões dos seis miRNAs proposto neste trabalho foram detectados em células e exossomos. Todos os seis miARN pode ser detectado nas células, ao passo que apenas o miR-21 e 133b pode ser detectada em exossomas (o valor de Ct dos outros quatro miARNs excedeu 40). Para testar a influência de DDP sobre os níveis de miARNs em células e expressão exossomas, os níveis destes seis miARNs expressão foram detectados em células e exossomas após exposição de células A549 para DDP. Como mostrado nas Figuras 2E e 2F, os níveis de expressão de miR-21, o miR-133b, miR-98, o miR-181º aumentada nas células, enquanto a expressão de miR-21 e 133b aumentou em exossomas. Dobrável mudanças na expressão de miR-21 e miR-133b em exossomos também foram maiores do que aqueles em células (Figura 2G).

exossomas diminuir a sensibilidade das células A549 para DDP

Para determinar exossomas absorção pelas células A549, os exossomas foram marcadas por DiD e co-incubadas com células A549 durante 3 h, após o que a microscopia de fluorescência foi realizada. Tal como mostrado na Figura 3B, os exossomas poderia ser absorvida pelas células vizinhas. Para determinar se exossomos podem influenciar a sensibilidade do A549 para DDP, exosomes liberadas pelas células A549 em condições normais e sob a condição DDP foram colhidos e adicionados a células. Como mostrado nas Figuras 3A e 3C, exossomas libertadas por células A549 sob exposição DDP poderia diminuir a sensibilidade de outras células A549 a DDP, enquanto os exossomas libertadas por células A549 em condições normais teve pouca influência sobre a sensibilidade de células A549 para DDP. Porque exosomes liberadas pelas células A549 em condições normais não influenciou a sensibilidade em torno células para DDP, nós eleitos para estudar a função de exossomos liberadas pelas células A549 sob exposição DDP somente.

(A) pré-tratamento de células A549 com exossomas libertados durante a cisplatina (3 ug /ml) a exposição diminui a sensibilidade das células à cisplatina em cerca de 20% em comparação com aqueles sem o pré-tratamento durante 48 h. (B) A absorção de exossomas (vermelhas) por células A549 depois de incubação durante 3 h foi visualizado por microscopia. Barra de escala: 50 ^ m. (C) Imagem microscópica de células A549 cultivadas sob condições quatro [controlo, exossomas, DDP (3 ug /ml), exossomas + DDP] durante 48 h. As imagens foram obtidas com uma ampliação de 100 x. * Em (A) indica p 0,05 contra grupos de controlo

exossomas influenciar os níveis de expressão de celular miRNAs e mRNAs

Para testar possíveis alternâncias nas expressões de miRNAs e mRNAs em células. como resultado de exossomas libertadas por células A549 durante a exposição DDP, os níveis destes ARNms miARNs e de expressão foram detectados após as células foram expostas a exossomas. Como mostrado na Figura 4A, o nível de miR-21 expressão aumentada enquanto os níveis de miR-98, 133b, 138, 181º, e 200c expressão diminuída. A Figura 4B mostra um aumento nos níveis de ERCC1, BRCA1, e RRM1 expressão. Além disso, como se mostra nas Figuras 4C e 4D, após as células A549 foram tratadas com DDP, a dobra-mudanças relativas destes miARNs e ARNm em células pré-tratadas com exossomas variaram a partir da dobra-mudanças relativas observadas em células cultivadas sob condições normais.

Os níveis de expressão de miRNAs (A) e mRNAs (B) em condições normais com e sem pré-tratamento exosome. Dobre-as alterações na expressão de (C) miRNAs e mRNAs (D) sob a cisplatina com e sem pré-tratamento exosome. As barras indicam média ± SD de três réplicas. * Indica p . 0,05 contra grupos de controlo

Discussão

Para o melhor de nosso conhecimento, nosso estudo é o primeiro a demonstrar exosomes envolvimento na regulação da sensibilidade do A549 câncer de pulmão células para DDP. Verificou-se que a exposição de células A549 para DDP poderia causar células para libertar mais exossomas do que em condições normais e que a interacção destes exossomas com outras células A549 pode aumentar a resistência dessas células A549 a DDP. Nosso estudo demonstra pela primeira vez que quando as células A549 são expostos a DDP, os níveis de vários miRNAs e mRNAs alegadamente associados à mudança sensibilidade DDP significativamente em exossomos de expressão e que essas mudanças provavelmente mediar a resistência DDP de células A549.

Uma vez exposto a DDP, as células cancerosas se adaptar a alterações no ambiente de sobreviver. sistema de resposta de danos (DDR) e de sinalização diversos caminhos de ADN são então induzido. Algumas células pode reparar este dano e passar por postos de controle do ciclo celular, enquanto que outras células não são capazes de reparar as lesões e, portanto, sofrem morte celular por apoptose ou senescência celular. Como mostrado na Figura 2A, a cerca de metade das células morreram após exposição de células A549 para 3 ug /ml DDP, enquanto o conteúdo e processos celulares de células sobreviventes foram alterados ao nível da transcrição. Tal como mostrado na Figura 2E, os níveis de expressão de miR-21, o miR-133b, miR-98 e miR-181º detectado neste trabalho variou. conteúdo de ARN em exossomas supostamente diferem a partir do ARN de células dadoras [10], e as expressões diferenciais de miARNs exosomal dependem tanto da origem das células e do meio ambiente. A Figura 2G mostra que sob tratamento DDP, os níveis de expressão diferencial de miARNs em exossomas diferiam daqueles em células. E, como mostrado na Figura 2E e 2F, miARNs expressões celulares eram diferentes das expressões miARNs exosomal. Além disso, os níveis de expressão variaram miARNs nas células cultivadas sob condições diferentes, o que indica que miARNs conteúdo em exossomas pode ser regulada de acordo com o estado biológico das células.

Durante a exposição DDP, exossomas libertado por cada célula sobreviver aumentar e alguns dos DDP é exportado por esses exosomes [16]. Exosomal miARNs são então mediada na comunicação célula-a-célula [10]. Figura 3B, 4A e 4B mostram que exossomos levando mensagens poderia ser captado pelas células ao redor e conteúdo celular são alterados em conformidade. Essas mensagens podem conter informações de perigo iminente, e o conteúdo em exossomos sempre depende da condição em que os exossomos são liberados. Quando as células foram tratadas com um segundo ciclo de DDP, os níveis de transcrição foram influenciados. Tal como mostrado na Figura 4C, 4D e, as células pré-tratadas com exossomas demonstrou alguma preparação para o segundo ciclo de tratamento DDP e os níveis de transcrição induzida em células diferiam.

Quando exposto a DDP, células A549 foram estimulados e o nível de expressão de miR-21 aumentaram. Uma vez que o nível de expressão de miR-21 em exossomas também aumentou significativamente e exossomas poderia ser captado pelas células vizinhas, inferiu-se que exossomas podem mediar mais miR-21 de outras células. Na verdade, foi observado um aumento no nível de expressão de miR-21 em outras células, o que sugere que a expressão regulada positivamente de miR-21 [19] diminui a sensibilidade de células de cancro de pulmão de DDP. Quando exposto a DDP, mais uma vez, as células receberam um segundo estímulo e respondeu com menos força. Os níveis de miR-21 de expressão aumentada, mas não tão significativa como no primeiro mudança. O nível de expressão de miR-133b também aumentaram após as células A549 foram tratadas com DDP. Exossomos mediadoras miR-133b pode ser captado pelas células circundantes e influenciar os níveis de transcrição de outras células. Como a abundante de miR-externo 133b pode ser mediada dentro das células, a expressão de miR-133b em células pode ser alimentada de volta a diminuir. A expressão regulada negativamente de miR-133b [28] tem sido demonstrado para diminuir a sensibilidade das células de cancro do pulmão para DDP. Depois de um segundo ciclo de tratamento DDP, as células com baixa expressão de miR-133b respondeu eo nível de miR-133b expressão evidentemente aumentado.

Muitos pesquisadores expressaram vários pontos de vista sobre a função de exossomos em influenciar as respostas das células para estimulação, e estas funções de exossomas dependeram sempre o tipo de estimulação. Maria Eldh et ai. argumentado que exossomas influenciar a resposta das células receptoras a um estímulo de stress externo por ARN que medeiam a partir de uma célula para outra [29]. Claire Corcoran et ai. descobriram que exossomas contribuir em parte para a comunicação celular, resultando na mediação docetaxel-resistência a células secundárias [15]. Nosso estudo demonstrou maior envolvimento exosome na regulação da sensibilidade das células A549 para DDP durante a exposição DDP e que essa influência é provavelmente regulada por exossomos. No entanto, várias insuficiências e deficiências existem neste trabalho, eo mecanismo detalhado da resistência DDP vai ser mais pesquisado em nosso próximo estudo.

Neste estudo, demonstramos que exossomos liberadas pelas células A549 expostos a DDP poderia se comunicar com outras células e influenciam a resistência destas células para DDP. Embora mecanismo detalhado ainda não está claro, acreditamos que a inibição da formação de exosome e liberação pode apresentar uma nova estratégia para o futuro tratamento de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

as células do pulmão humano linha celular de cancro de adenocarcinoma A549 bem caracterizado (Instituto celular Research Xangai, China) foram mantidas em meio RPMI-1640 (Nanjing Kaiji Biologia, China) suplementado com 10% de FBS (soro fetal de bovino, Hyclone Laboratories, EUA ) a 37 ° C e sob 5% de CO

2. As células foram inoculadas numa placa de 96 poços a uma densidade de células de 6 × 10

3 células /cavidade, e a avaliação da dose-resposta de DDP de células A549 foi realizada utilizando uma contagem celular Kit-8 (CCK-8; Dojindo , Kumamoto, Japão).

Isolamento e Caracterização de exossomas liberada pelas células A549

Para reduzir a influência de exossomos em FBS, FBS foi esgotado de exossomos por ultracentrifugação a 200.000 × g a 4 ° C durante 16 h (Beckman 70 Ti rotor). Depois de permitir que as células a aderir durante a noite, o meio foi substituído com meio RPMI-1640 e FBS a 10% com depleção de exossoma. Após 48 h, o meio de cultura foi colhido para recolher exossomas. Os exossomas de isolamento (Figura 1A) foi realizada usando uma ultracentrífuga Beckman (rotor 70 Ti) e solução exossomo precipitação ExoQuick-TC (Sistema Biosciences, Mountain View, CA, EUA).

exossomas dissolvido em 200 ul de fosfato solução salina tamponada (PBS) foram quantificados utilizando um kit de ensaio de proteína BCA reforçada (Beyotime Biotecnologia, China). O tamanho e morfologia de partícula de exossomas dissolvidos em PBS foram caracterizados por meio de um microscópio electrónico de transmissão (TEM, JEM-2100, JEOL, Tóquio, Japão). Total de proteínas celulares e exosomal foram, respectivamente, a partir de células e extraiu-se exossomas usando tampão de lise de SDS (250 nM de Tris-HCl, pH 7,4, 2,5% de SDS). As proteínas (10 mg /ml) foram separadas em géis de 10% SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF. Os anticorpos utilizados para imunotransferência incluídos CD63 (Sistema Biosciences, Mountain View, CA, EUA) e β-actina (Sigma-Aldrich). Usando uma solução de quimioluminescência aumentada (ECL kit, Pierce), bandas de proteínas foram observadas utilizando XRS Molecular Imagem ChemiDoc + (Bio-Rad).

A absorção de exossomas e celular Análise de Viabilidade

As pelotas exossomo foram novamente suspensas em 1 ml de solução salina phosphatebuttered (PBS) contendo 5 ug /ml Fez (Biotium, EUA) durante 30 min. A solução ressuspensa foi centrifugado a 200.000 x g durante 2 h, e os sedimentos ressuspensos-PBS foram adicionados a células A549. imagens de fluorescência foi subsequentemente realizada por microscopia confocal.

Para avaliar o efeito de exossomas sobre a sensibilidade das células a DDP, 6 × 10

3 células /cavidade foram semeadas numa placa de 96 poços com RPMI- 1640 contendo 10% de FBS exossomo-empobrecido. Após 24 h, exossomas libertadas por células A549 em condições normais e DDP-tratadas foram adicionados às células correspondentes a uma razão de 5: 1 (exossomas colhidas a partir de 5 mL de sobrenadante foram adicionados a células em cultura em 1 mL de meio de cultura) para 3 h. O mesmo volume de PBS sem exossomas foi adicionado a células utilizadas como grupo de controlo. Para os ensaios de citotoxicidade, 3 ug /mL DDP foi aplicado aos poços durante 48 h e a viabilidade celular total foi avaliada utilizando um kit de contagem de células-8 (CCK-8).

Isolamento de ARN e Análise

Exosomal ARNs foram isolados usando um kit de isolamento de miRvana microARN (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e eluiu-se em 100 uL de solução de eluição aquecido de acordo com o protocolo do fabricante. RNAs celulares foram obtidos utilizando metodologia Trizol® extracção (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) e eluiu-se em 30 mL de DDH

2O.

miARN foi haste-laçada de transcrição reversa (RT) com o kit de transcrição reversa miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). RT-PCR foi realizado em triplicado utilizando TaqMan miARN ensaio (Applied Biosystems). Uma mistura específica de gene-sonda (miR-21, 000.397; miR-98, 000577; miR-133b, 002,247; miR-138, 002284; miR-181º, 000,480; miR-200c, 002300) foi utilizado neste estudo. U6 snRNA foi usado como controlo interno para o ensaio TaqMan miARN para detectar o nível de expressão de miARNs em células; não-humanos miRNA [

elegans Caenorbabditis sintéticos

miR-39 miRNA (cel-miR-39); Takara Bio Inc., Tóquio, Japão] foi cravado em normalizar o volume exossomo no início do isolamento do ARN.

personalizado TaqMan Baixa Densidade matriz de RT-PCR (Confinder Bio., China) foi aplicada para detectar ARNm expressão, e GAPDH foi seleccionado como o controlo interno. Análise da expressão de genes foi realizada utilizando ABI Prism 7900 Sequence D software do sistema de detecção interna (Applied Biosystems).

Análise estatística

Os resultados são expressos como média ± DP. A análise estatística foi realizada por meio de Student

t

-Testes quando se comparam dois grupos (PASW Statistics 18.0), e p . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo