Abstract

A aplicação de doxorrubicina (Dox) para o tratamento de câncer é restrito devido aos seus efeitos colaterais graves. Usamos estratégia de combinação através da combinação de doxorrubicina (Dox) com withaferin A (WFA) para minimizar os efeitos nocivos do Dox. O tratamento de várias linhas celulares de cancro epitelial do ovário (A2780, A2780 /CP70 e CaOV3) com a combinação de FPA e Dox (PI /DOX) mostrou um efeito sinérgico tempo e dependente da dose de inibição da proliferação celular e a indução de morte celular, assim a redução da necessidade de dosagem de Dox. O tratamento de combinação resultou em um aumento significativo da produção de ROS, resultando em danos ao DNA imensa, a indução de autofagia analisadas por microscopia eletrônica de transmissão e aumento da expressão de autofagia marcador LC3B, e culminou na morte de células analisadas por caspase clivada 3. Nós validado terapia de combinação no tumor crescimento usando um 3Dimension modelo de tumor in vitro (3D) e a

in vivo

modelo mais clássico de xenotransplante de cancro do ovário. Ambos os modelos de tumor mostrou uma redução de 70 a 80% no crescimento do tumor comparada com o controlo ou com animais tratados FMA ou Dox sozinho. Análise imuno-histoquímica dos tecidos de tumor de animais tratados com a combinação de FMA /Dox mostrou uma redução significativa da proliferação celular e formação de microvasos acompanhados pelo aumento no nível LC3B, caspase 3 clivada, e danos no ADN. Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem que a combinação de FMA com Dox diminui o requisito de dosagem de Dox, por conseguinte, minimizar /eliminar os efeitos secundários graves associados com doses elevadas de DOX, sugerindo a aplicação desta estratégia de combinação para o tratamento de cancros do ovário e outros com nenhum ou efeitos colaterais mínimos

Citation:. Fong MY, Jin S, Rane M, Singh RK, Gupta R, Kakar SS (2012) Withaferin a synergizes o efeito terapêutico de doxorrubicina através ROS-Mediated Autophagy no câncer de ovário . PLoS ONE 7 (7): e42265. doi: 10.1371 /journal.pone.0042265

editor: Yunli Zhou, Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de maio de 2012; Aceito: 02 de julho de 2012; Publicado: 30 Julho 2012 |

Direitos de autor: © Fong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento veio do National Institutes of Health /National Cancer Institute CA124630. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Raj K Singh é empregado pela Vivo Biosciences Inc. Não há patentes, produtos desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de ovário é a neoplasia maligna mais letal do trato reprodutivo feminino [1]. Devido à falta de sintomas na fase inicial da doença, a taxa de sobrevivência de cinco anos é de apenas 27,2% [1]. O tratamento da linha principal de câncer de ovário é a cirurgia cytoreductive seguida por quimioterapia à base de platina [2]. Inicialmente, o cancro do ovário responde positivamente em 70 a 80% dos casos [3]. [3] Esta taxa de sobrevivência No entanto, dentro de 18 a 24 meses após o tratamento inicial, recidiva tumoral ocorre, o que (por aproximadamente 70% dos pacientes) é atribuído aos carcinomas tendo-se tornado resistente à platina pobres para as mulheres com pontos de carcinomas de ovário resistente à platina para uma necessidade urgente de uma estratégia de tratamento alternativo.

doxorubicina (Dox) é um anthracylin largo espectro isolado a partir de

Streptomyces peucetius

que tem sido utilizado para o tratamento de vários cancros, incluindo ovário, da mama, da próstata e [4]. Na verdade, a FDA anthracylins são mais amplamente utilizados aprovada fármaco anticancerígeno [5]. eficácia da Dox tem sido atribuído à sua capacidade para se intercalam entre cadeias de ADN para actuar como um inibidor da topoisomerase II e /ou ligar-se covalentemente a proteínas envolvidas na replicação do ADN e a transcrição [5]. O uso de Dox é limitada por efeitos colaterais graves, dependentes da dose, incluindo náuseas e vómitos agudos, estomatite, distúrbios neurológicos, toxicidade do miocárdio, a alopecia, e aplasia da medula óssea [5]. Alternativamente, doxorubicina lipossomal peguilada (PLD) (DOXIL) é considerada como uma das opções de tratamento padrão em cancros do ovário recorrentes (ROC) [6]. Apesar dos efeitos colaterais comparativamente mais baixos, DOXIL tem taxa muito baixa de resposta ( 20%) [6]

Mais recentemente terapia de combinação com Dox tem atraído mais atenção.. Combinando Dox com sildenafil resultou em uma morte celular aumentada através da regulação negativa da Bcl-2 acoplada a um aumento da caspase 3, através da valorização da geração induzida por Dox de espécies reativas de oxigênio (ROS), enquanto atenuar disfunção cardíaca induzida por Dox [7]. Dox também foi combinado com HO-3867, um análogo sintético da curcumina, para atingir a morte celular aumentada e toxicidade reduzida do miocárdio através do uso de doses mais baixas de [8] Dox. Por conseguinte, a terapia de combinação provou ser um método útil para reduzir os efeitos colaterais associados com Dox, mantendo a sua função terapêutica.

Um Withaferin (PI) é bioactivo, célula lactona permeável esteróide possuindo o esqueleto básico como a sua withanolide estrutura. WFA é isolado a partir da planta

Withania somniferia

, que tem sido uma parte da medicina ayurvédica indiana há séculos e agora está disponível como um suplemento over-the-counter dietético em os EUA Ela tem sido usada para tratar uma variedade de condições devido às suas propriedades anti-inflamatórias e anti-bacterianas. Mais recentemente, tem sido sugerido como um potencial composto anti-cancro, uma vez que foi mostrado para inibir o crescimento tumoral, angiogénese, metástase e [9], [10]. Várias funções biológicas têm sido influenciados por WFA incluindo a indução de apoptose através de inativação de Akt e NF-kB [11], bem como diminuição da proteína pró-sobrevivência Bcl-2 [12], [13], a indução de Par-4 [14 ], a inibição da Hsp90 e Notch-1 [15], G2 /M do ciclo celular de detenção [16], FOXO3a e Bim regulação [9], geração de ROS [17], [18] e a regulação por diminuição da expressão de E6 de HPV e oncoproteínas E7 [19].

um estudo anterior demonstrou que FPA aumenta o efeito citotóxico de Dox em um sarcoma osteogénico (U2OS) e linha celular de cancro da mama (MCF-7) utilizando um ensaio de proliferação de células [20] . No entanto, o efeito combinado de Dox e WFA não foi estudado no câncer de ovário, um mecanismo de acção determinada, ou tratamento combinação testada

in vivo

para a supressão do crescimento do tumor. Propusemos que FPA quando combinado com Dox vai provocar um efeito de sinergia na supressão do crescimento do tumor do ovário. Para testar a hipótese de, estudou-se o efeito combinado de Dox e em FPA ovário sensíveis a cisplatina A2780 epitelial de células de cancro A linha, linha epitelial de ovário resistente a cisplatina de células A2780 /CP70, e p53 mutante de ovário epitelial CAOV3 linha celular. Pela primeira vez, mostrámos que a morte celular foi induzida através da produção de ROS e danos no DNA, conduzindo à indução de autofagia e culminando na morte celular em caspase 3 modo dependente. Também mostrou que o efeito de Dox e FMA

In vitro utilizando

tumores 3D gerados a partir de células A2780 em uma matriz extracelular humana. Além disso, examinou-se o efeito do tratamento de combinação

In vivo

no crescimento do tumor, proliferação, angiogénese, autofagia, a morte celular, e danos no ADN utilizando tumores de xenoenxerto produzidos através da injecção de células A2780 em ratinhos nus.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

Animals trabalho relatado no manuscrito foi realizada após aprovação do protocolo pela Universidade do Comitê de Uso animal Care Louisville (IACUC).

celular cultura

linha de células (A2780) tumor da cisplatina e minúsculas epitelial de ovário humano foi obtido como um presente do Dr. Denise Connolly (Fox Chase Cancer Center, Filadélfia, PA). A linha celular foi originalmente produzida a partir de pacientes de cancro do ovário humano, antes do tratamento [21]. A linha de células resistentes à cisplatina (A2780 /CP70) foi obtido como um presente do Dr. Christopher Unidos (Universidade de Louisville, Louisville, KY). Esta linha celular foi derivada da linha celular A2780 após o tratamento com cisplatina [22]. CAOV3 linha celular foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC). células A2780 e A2780 /CP70 foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, e 0,05% (v /v) de insulina (Sigma). CAOV3 células foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% FBS e 1% de Penicilina /Estreptomicina. Os anticorpos para fosfo-Ser BAD

136, Bcl-xL, caspase 3 clivada, e GAPDH foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. anticorpo Ki67 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology, CD31 e LC3B de Abcam. A doxorrubicina, withaferin A, N-acetil-L-cisteína, superóxido dismutase, catalase, e DMSO foram adquiridos da Sigma.

proliferação celular (MTT) Ensaios

A2780, A2780 /CP70, e CAOV3 células que crescem em fase de crescimento foram tripsinizadas e foram semeadas em placas de 96 poços. Após 24 h de cultivo, as células foram tratadas em triplicado com diferentes doses de Dox e FMA tanto sozinhos ou a combinação de FMA /Dox durante 24, 48 e 72 h. Após o tempo especificado, 20 ul de reagente MTT a partir do estojo de ensaio de proliferação celular (Promega) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante aproximadamente 1 h. O desenvolvimento da cor foi avaliado por um leitor de ELISA a 492 nm como descrito anteriormente [23]. Dox foi solubilizado em água e FMA foi solubilizado em DMSO. DMSO (0,1% v /v) foi utilizado como um controlo do veículo.

Análise isobolograma

células A2780 e A2780 /CP70 foram tratadas em triplicado durante 48 h utilizando 7 concentrações de Dox e FMA tanto sozinhos ou a combinação de FMA /Dox a uma razão constante, como descrito acima. As células viáveis ​​foram quantificadas por ensaios MTT como descrito acima e a fracção afectada foi calculada a percentagem de inibição a partir de. Fracção afectada foi então utilizada no software CalcuSyn para gerar uma curva de dose-resposta e isobolograma.

Apoptose celular Os ensaios utilizando citometria de fluxo para a Anexina V

A2780 foram tratados com Dox e FMA tanto sozinhos ou a combinação de FMA /Dox, tal como descrito acima durante 24 h. As células foram dissociadas com verseno (Invitrogen), lavadas com PBS e ressuspensas em tamp de ligao de anexina V a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml. Anexina V-FITC (2 jil, BD Biosciences) foi incubada durante 15 min no escuro com 100 ul de suspensão de células. Quatrocentos ul de tampão de ligação de anexina V foi adicionado à suspensão. Dois ul de iodeto de propedium (PI) foi misturado numa solução de e imediatamente usada em um FACSCaliber (BD Biosciences) como descrito por Betts et al [24]. Anexina V e as células PI manchado foram analisados ​​utilizando software FlowJo.

Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) Ensaios

células A2780 foram semeadas no vidro de fundo 35 mm

2 pratos durante a noite, seguido por tratamento com Dox e FMA tal como descrito acima durante 24 h. As células foram então incubadas com 2 | iM H

2DCFDA (Invitrogen) em meio de crescimento durante 30 min a 37 ° C como descrito por Das et al [7]. As células foram lavadas com PBS, visto sob microscópio confocal, e fotografados.

Análise de ADN de danos usando TUNEL Assays

Células A2780 foram semeadas em lâminas de câmara e tratados com Dox e FMA tal como descrito acima. As células foram então ensaiadas para danos no ADN utilizando o kit de ensaio de TUNEL deadend fluorométrico (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram examinadas ao microscópio confocal e fotografada.

ensaios de TUNEL para secções de tecido foram realizadas utilizando uma peroxidase Apoptosis Kit ApopTag Além disso Detection (Millipore, Billerica, MA) de acordo com as instruções do fabricante.

isolamento de proteínas e análise de Western Blot

células A2780 foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com Dox e FMA tanto sozinhos ou a combinação de FMA /Dox, tal como descrito acima durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram preparados como descrito previamente [25]. As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare). Os anticorpos primários foram diluídos tal como indicado pelo fabricante e incubou-se durante a noite a 4 ° C. A ligação do anticorpo foi revelada por anticorpos secundários marcado com peroxidase visualizadas usando chemioluminescence reforçada (GE Healthcare), como descrito anteriormente [26]. As membranas foram em seguida re-sondado com GAPDH para normalizar as diferenças no carregamento.

Tridimensional ensaios (3D) Crescimento do Tumor

células A2780 (15000 /grânulo) foram misturados com Hubiogel® numa proporção de 01:04 e dispensada em 10 ul grânulos e deixada a polimerizar, antes de ser suspenso no meio de crescimento quente para formar tumores esféricas. Cada tumor esférica (1 mm

3) foram transferidas para a placa de 96 poços (um tumor /poço) e tratou-se com Dox (0,2, 2 uM), FMA (0,5, 2 uM), ou a combinação de FMA /Dox (0,5 ^ M /0,2 uM ou 2,0 uM /0,2? M). O meio foi substituído (duas vezes /semana) com meio contendo o agente fresco. O crescimento do tumor foi realizada nos dias 1, 3 e 7 usando ensaios MTT como descrito acima. Os tumores após tratamento foram incubadas com calceina AM (Invitrogen) durante 30 min e examinado usando Nikon B-2EIC microscópio de fluorescência utilizando bloco de filtro FITC no Ex

465-495 nm e Em

515-555 nm) e fotografada.

Formação xenoenxerto de tumor e tratamento com Dox, WFA ou WFA /DOX

células A2780 foram misturadas com Matrigel (BD Biosciences) na proporção 01:01. As células (2 x 10

6) foram injetados bilateralmente por via subcutânea no flanco ventral de 5-6 semanas de idade nu /nu (Charles River) e os tumores foram deixados crescer durante 20 dias até atingirem a 100 mm

3 em tamanho, tal como descrito anteriormente [27]. Os ratos foram então divididos aleatoriamente em 6 grupos e injectados com: 1) PBS, 2) 10% de DMSO + 90% trioctanoato de glicerilo (veículo), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) FMA 2 mg /kg, ou 6) Dox 1 mg /kg + FMA 2 mg /kg. Os ratinhos foram tratados cada outro dia i.p. usando volume de 100 ul e os tumores foram medidos com paquímetro digital antes de cada tratamento. Dox foi solubilizada em solução salina enquanto que FPA foi solubilizado em DMSO e trioctanoato de glicerilo (10:90 v /v). Os ratinhos foram sacrificados após 12 dias do início do tratamento. Todos os tratamentos foram aprovados pelo IACUC, da Universidade de Louisville.

Análise imuno-histoquímica de tecidos tumorais

tumores de xenoenxerto foram fixados em formol a 10% e embebidos em parafina para seccionamento. As lâminas foram desparafinadas em xileno e re-hidratadas numa série gradual de etanol. Antigénio de recuperação foi realizado por incubação das lâminas em citrato de sódio 10 mM, pH 6,0 durante 20 min a 95 ° C, seguido por tratamento com 0,3% H

2O

2 em metanol durante 20 min [28]. As lâminas foram processadas utilizando o kit Vectastain ABC Elite Anti-coelho (Vector Labs). As secções foram incubadas com anticorpos primários para Ki67 (diluído 1:50, Santa Cruz Biotechnology), CD31 (1:50, Abcam), LC3B (1:500, Abcam) e caspase clivada 3 (1:200, Cell Signaling) a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo secundário de acordo com as instruções dos fornecedores. A cor foi desenvolvida utilizando DAB (Vector Labs) e contrastadas com hematoxilina QS (Vector Labs) para manchar núcleos como descrito anteriormente [28].

Análise Estatística

Os valores foram expressos em média ± SD. Os valores de P foram determinados por análise de variância, seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls para comparações múltiplas.

Resultados

WFA synergizes o efeito antitumoral da doxorrubicina

Dox é normalmente usado em 5 uM para imitar a concentração encontrada no plasma de pacientes submetidos a tratamento Dox [29]. No entanto, com esta dose, os pacientes apresentam efeitos colaterais graves, na medida uma concentração de 1 uM é necessária para manter vários mecanismos de acções de Dox [29]. Para minimizar ou eliminar estes efeitos secundários, exploramos a possibilidade de utilizar um tratamento de combinação Dox /FMA. linhas celulares de cancro do ovário A2780 e CAOV3 e uma linha de células resistentes à cisplatina A2780 /CP70 foram tratados com várias concentrações de Dox e FMA tanto isoladamente como em combinação. combinação Dox /FMA inibiu a proliferação de células de todas as três linhas de células de uma forma dose e dependente do tempo. Quando Dox e FMA foram utilizados isoladamente, o IC valores

50 em células A2780 após 48 h de tratamento foram de 0,8 uM e 4,1 uM, respectivamente (Fig. 1A-B). Quando as células foram co-tratados com uma combinação de Dox com 1,5 uM de FPA, do IC

50 valor para Dox diminuiu para 0,16 uM (Fig. 1a). Da mesma forma, quando 200 nM de Dox foi combinado com WFA, o IC

50 valor para WFA diminuiu para 1,5 mM (Fig. 1B). As células quando co-tratadas com 200 nM de Dox e 2,0 uM de FMA resultou em 90 a 95% de morte celular (Fig. 1B), enquanto que o tratamento de células com Dox sozinho (200 nM) e FPA sozinho (2.0 uM) resultou em nove % e 20% de inibição, respectivamente. Para as células A2780 /CP70, o IC

50 valores para Dox e WFA foram 0,65 mM e 6 mM, respectivamente. Combinando Dox com 1,5 uM de FMA reduziu o IC

50 valor de Dox e 0,18 uM, e combinando FMA com 200 nM de Dox reduziu o IC

50 valor de 1,2 uM (Fig. 1C-D). CAOV3 células eram mais sensíveis ao tratamento com Dox e FMA sozinhos ou a combinação de Dox /FMA (resultados não mostrados). IC

50 valores estão resumidos na Tabela 1. Estes resultados sugerem que a combinação Dox /FMA funciona de uma forma sinérgica para mediar a actividade anti-tumoral. dados de proliferação de células após 24 h e 72 h de tratamento são mostrados na Fig. S1 e S2.

A2780 e A2780 /células CP foram semeadas em placas de 96 poços. Após 24 h de cultivo, as células foram tratadas com várias concentrações de Dox e FPA, tanto sozinhos ou em combinação. Após 48 h de tratamento, a viabilidade celular foi ensaiada utilizando ensaios MTT. Os valores mostrados são ± SD média de quatro experiências independentes. * P 0,05 comparado com o controlo, # p 0,05 comparado com Dox sozinho ou FPA. (E) isobolograma análise de células A2780 (n = 4) e (F) A2780 /CP70 (n = 4) utilizando 7 doses de Dox e FMA mantida a uma relação constante e a morte celular foi analisada por ensaios MTT. Os resultados foram analisados ​​com o software CalcuSyn.

análise isobolograma Para confirmar que o efeito da combinação de WFA com Dox foi sinérgica, foi realizada. Ambos A2780 e células /CP70 A2780 foram tratados com 7 concentrações de Dox e FMA numa proporção constante, durante 48 h e a proliferação celular foi analisada por ensaios MTT. software CalcuSyn foi usada para gerar os isobologramas, demonstrando que Dox e FMA actuam sinergicamente (Fig. 1E-F) para ambas as linhas celulares.

Para determinar se a apoptose estava a causa de morte celular, foi realizada Anexina V -FITC citometria de fluxo em células A2780 tratados com Dox e FMA tanto sozinhos ou em combinação. Análise de Dox, WFA e Dox com amostras tratadas WFA mostrou um aumento não significativo sobre o controle de anexina V (Fig. S3). A fim de confirmar a nossa técnica, amostras de controlo positivas foram produzidos utilizando exposição à radiação UV durante 30 segundos e analisando as células 4 h, 6 h e 24 h após a exposição para assegurar a eficiência de coloração (fig. S4). Além disso, investigamos as proteínas apoptóticos intrínsecas fosfo-BAD

136 (pBAD

136) e Bcl-xL. Não foram encontradas alterações significativas em pBAD

136 ou Bcl-XL (Fig. S5), indicando que uma via alternativa à apoptose intrínseca está sendo usado para induzir a morte celular.

Dox e WFA Produzir ROS para induzir Cell Death

Dox é conhecida a produção de ROS, como parte dos seus mecanismos [4], [5]. Também houve numerosos relatos sobre WFA de produção de geração de ROS como uma parte de seus mecanismos apoptóticos em vários tipos de câncer [12], [17], [18], [30]. Por isso, perguntou se WFA poderia aumentar o efeito da baixa concentração de Dox após 24 h de tratamento, usamos H

2DCFDA para determinar geração de ROS. H

2DCFDA é um composto não polar que é estável prontamente difundida para dentro das células. Este composto é em seguida hidrolisado por esterases intracelulares para formar DCFH, que por sua vez é oxidado pelo peróxido de hidrogénio para se obter o composto altamente fluorescente 2’7′-diclorofluoresceína (DCF). Após 6 h de tratamento com FMA 1,5 uM aumentaram significativamente células ROS positivos de 2% a 17% em comparação com células de controlo (resultados não apresentados). Após 24 h de tratamento, Dox 200 nM mostraram um baixo número de células positivas ROS, 18% (Fig. 2A-B). Enquanto FPA 0,5 uM (23%) não era significativamente diferente do Dox, combinação de Dox 200 nm com FMA 0,5 uM resultou num aumento significativo de 37%. Este efeito foi muito reforçada com uma combinação de 200 nm com Dox FPA 1,5 uM, aumentando para 90% de células positivas de ROS (Fig. 2A-B). O tratamento com WFA 2? M danificado as células muito severamente para produzir ROS, indicando que o efeito da WFA sobre a produção de ROS é dose-dependente e sobre combinação com Dox provoca um efeito sinérgico.

Para confirmar que ROS são responsáveis ​​por a morte celular observada, que co-tratados células A2780 com o sequestrante de ROS N-acetil-L-cisteína (NAC, 5 mM) ou com anti-oxidantes enzimáticos superóxido dismutase (SOD) e catalase, juntamente com tratamentos de Dox e WFA para 24 e 48 horas como descrito acima. Enquanto NAC foi ineficaz para bloquear a morte celular induzida por Dox às 24 h, forneceu proteção moderada após 48 h de tratamento (Fig. 3A) determinados por ensaios de MTT. NAC foi altamente eficaz para bloquear a morte celular induzida por FPA após 24 horas e continuou a proporcionar uma protecção após 48 h de incubação (Fig. 3C). NAC também era eficaz no bloqueio de Dox /FMA tratamento de combinação (Fig. 3B-D). Para diferenciar entre a principal forma de ROS produzido por Dox e tratamento WFA, nós tratamos as células com antioxidantes enzimáticas catalase 500 U /ml ou SOD 100 U /ml. Tem sido relatado que a catalase é frequentemente usado pelas células para degradar o peróxido de hidrogénio [31] enquanto que a SOD catalisa especificamente aniões superóxido [32]. Após 48 h de tratamento, a SOD bloqueou significativamente a morte celular induzida por Dox e FMA sozinho e em combinação (Fig. 4). Semelhante a SOD, catalase mostrou protecção da morte celular por Dox e FMA tanto sozinhos ou a combinação de FMA /Dox (resultados não apresentados), indicando que os aniões superóxido são os principais espécies de ROS produzidas por Dox e FMA.

A2780 As células foram plaqueadas em placas com fundo de vidro. Após 24 h de cultivo, as células foram tratadas com Dox e FPA, tanto por si só ou a combinação de FMA /DOX como descrito na Figura 1. Depois de 24 h de tratamento, o meio foi substituído com meio fresco contendo H

2DCFDA e incubou-se durante 30 min. As células foram lavadas com PBS e examinadas ao microscópio confocal. células positivas (A) ROS (cor verde) foram contadas com base em 3 campos de baixa potência. A média ± SD. Os valores de P foram determinados por análise de variância, seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls para comparações múltiplas. * P 0,05 do controlo, $ P 0,05 comparado com Dox, P 0,05 comparado com FMA. (B) Análise de microscopia confocal de células que indicam geração de ROS (cor verde).

células A2780 foram co-tratados com NAC e Dox, WFA ou a combinação dos WFA /WFA para 48 h. A proliferação celular foi determinada utilizando ensaios de MTT. Os valores mostrados são ± SD média de três experiências independentes. P 0,05 comparado com o controlo, # P 0,05 comparado com nenhuma NAC NAC e

A proliferação celular foi determinada utilizando ensaios de MTT.. Os valores mostrados são ± SD média de três experiências independentes. * P 0,05 comparado com o controlo, # P . 0,05 em comparação com nenhuma SOD e SOD

Como ROS provoca danos no ADN, foi realizado ensaio de TUNEL para visualizar a extensão dos danos no ADN quando tratados com Dox e FMA isoladamente ou em combinação. Após 24 h de tratamento, Dox 200 nM resultou em danos no ADN em algumas células, enquanto FPA 1,5 uM por si só aumentou ligeiramente o número de células danificadas (Fig. 5). No entanto, o tratamento com 200 nM de Dox e FMA 1,5 uM combinação resultou num efeito aumentado para induzir danos no ADN. Quase todas as células mostraram danos no DNA (Fig. 5).

células A2780 foram tratados com Dox, WFA tanto sozinhos ou a combinação dos WFA /Dox. Após 24 h de tratamento, danos no ADN foi analisada utilizando ensaios de túnel. As imagens foram obtidas por microscopia confocal com ampliação de 20x.

Combinação de Dox e WFA morte celular induzida por autofagia

Vários quimioterapias anticancerígenas incluindo Dox foram mostrados para induzir autofagia, que coopera com apoptose para induzir a morte de células [33] – [38] como um meio para eliminar organelas danificadas que pode produzir um elevado nível de ROS e por isso, limitam a instabilidade cromossómica [39]. Portanto investigar o papel de agente de quimioterapia Dox combinado com WFA em autofagia é uma avenida de interesse. A análise por microscopia de electrões de células de controlo tratadas com DMSO mostraram a presença de mitocôndrias e um envelope nuclear intacto (Fig. 6). Enquanto WFA 0,5 uM sozinho teve pouco ou nenhum efeito, FMA 1,5 e 2 pM mostrou alguns autofagossomas como um indicador de autofagia, mas deixou as mitocôndrias intactas, possivelmente, como um mecanismo de adaptação. As células quando tratadas com Dox 200 nm sozinhos mostraram formação de autofagossomas contendo citoplasma e destruição das mitocôndrias. O tratamento de células com combinação Dox /FMA resultou num efeito aumentado de uma forma dependente da dose. Dox 200 Nm mais WFA 2 pM mostrou intensas vacúolos autofágicos juntamente com o colapso do envelope nuclear, desintegração da membrana, e na ausência de mitocôndrias (Fig. 6), indicando os danos celulares intensa após o tratamento com a combinação Dox /WFA.

células A2780 foram tratados com Dox e WFA, tanto sozinho ou a combinação dos WFA /Dox. Após 24 h de tratamento, as células foram lavadas com PBS, fixadas e processadas para análise de TEM. Elétrons imagens microscópicas em 5,600X ampliação são mostradas.

Para confirmar a indução de autofagia após tratamento de células com combinação Dox /WFA, determinou-se a expressão do marcador canônica de formação autophagosome, microtubule-associada proteína-1 de cadeia leve 3B (LC3B) [38]. A análise de transferência de Western das células mostrou duas bandas específicas: uma banda superior (18 kDa) que representa LC3B-I e uma banda mais baixa (16 kDa) correspondente ao LC3B-II (Fig. 7). Citosólica LC3B-I é convertido LC3B-II através de lipidação e permite LC3B-II a associar-se com as vesículas autofágicos. O tratamento com Dox produção induzida de LC3B-II (Fig. 7), enquanto FPA sozinho estimulou a produção do pré-cursor LC3B-I, bem como LC3B-II (Fig. 7). O tratamento de combinação melhorada LC3B-II de um modo dependente da dose com Dox 200 nm com WFA 2 uM mostrando a expressão mais elevada (Fig. 7). Para determinar se era autofagia uma resposta de adaptação ou de um mecanismo de morte celular, foi investigada a caspase 3 clivada como um marcador para a morte celular. A análise Western blot mostrou um aumento modesto de células tratadas com 200 nM Dox. Em contraste, FMA a 0,5 pM mostrou nenhuma indicação de morte celular, enquanto FPA 1,5 e 2 pM mostrou um aumento do nível de caspase clivada 3. O tratamento das células com combinação Dox /FMA mostrou um aumento adicional de morte celular de uma dose forma dependente (Fig. 7), indicando que a autofagia é promover a morte celular, em vez de induzir um mecanismo de adaptação para promover a sobrevivência celular com o tratamento combinado Dox /FMA.

Depois de 24 h de tratamento, as células foram lavadas com PBS e lisadas. análise de Western blot foi realizada para LC3B, Caspase 3 e proteínas GAPDH.

Efeito da Dox e WFA em tumores 3D in vitro

Além de ensaiar a inibição do crescimento de células tumorais, nós avaliaram os efeitos da Dox e WFA tanto sozinhos ou a combinação WFA /Dox quanto à sua eficácia anti-tumoral utilizando um modelo de mini-tumor 3D que emula

in vivo

crescimento -como tumor multicelular e biologia. mini-tumores viáveis ​​(1 mm

3 tamanho) das células de cancro do ovário A2780 foram gerados utilizando um sistema de cultura Biogel 3D humano (HuBiogel®, Vivo Biosciences Inc.). Hubiogel® foi mostrado para representar a matriz humana com mais precisão do que Matrigel, a fim de prever terminais pré-clínicos [40]. Mini-tumores foram tratados com 1) Dox 0,2 pM, 2) Dox 2,0 uM, 3) FMA 0,5 uM, 4) FMA 2,0 uM, 5) Dox 0,2 uM com FMA 0,5 uM, e 6) Dox 0,2 uM com FMA 2 uM . As medições de crescimento de tumor foram realizados nos dias 1, 3 e 7 usando ensaios MTT e microscopia de fluorescência. Médio e tumores tratados DMSO continuou a crescer durante todo o tratamento, ao passo que Dox 0,2 mM tinham seu crescimento interrompido no dia 7 (Fig. 8A). Dox 2,0 mM sozinho e WFA mM 2,0 tumores sozinho tratados apresentaram redução do crescimento e este efeito inibitório foi reforçada após tratamento com Dox 0,2 m mais? M WFA 2.0 (Fig. 8a). Combinação de Dox 0,2 uM com FMA 0,5 pM atingido um efeito drasticamente aumentada em comparação com qualquer dos compostos isoladamente (Fig. 8A). A análise por microscopia de tumores após o dia 3 e 7 é mostrado na Fig. 8B e 8C respectivamente, indicando efeito sinérgico de Dox e WFA combinação na supressão do crescimento do tumor

.

(A) Células A2780 foram combinados com Hubiogel® em uma proporção 01:04 e cresceu de 10 contas de microlitro. Os tumores foram tratados com Dox e WFA, tanto sozinho ou a combinação dos WFA /Dox. Os tumores foram tratados duas vezes /semana através da substituição do meio com meio contendo agente de fresco. O crescimento do tumor foi medido utilizando ensaios MTT após 3 dias ou 7 do tratamento. (B-C) tumores após tratamento foram incubadas com calceina AM durante 30 minutos, e as imagens foram tiradas com microscópio de fluorescência depois de 3 dias de tratamento (B), ou 7 dias de tratamento (C).

efeito da Dox e WFA em xenoenxerto de tumor crescimento

Para estudar o efeito da Dox e WFA sozinho ou em combinação sobre o crescimento tumoral

in vivo

, xenotransplantes tumorais de rato foram desenvolvidos através da injeção de células A2780 (2 × 10

6) por via subcutânea bilateral no flanco ventral de ratos nu velhos 5-6 semana /nu. Os tumores foram deixados crescer até que chegou a 100 mm

3 em tamanho. No dia 20 de pós-injecção de células, os murganhos foram divididos aleatoriamente em 6 grupos de 5 ratinhos cada e tratados com diferentes agentes: 1) controlo negativo (PBS), 2) controlo de veículo (DMSO a 10% e 90% trioctanoato de glicerilo), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) FMA 2 mg /kg, e 6) Dox 1 mg /kg com FMA 2 mg /kg, tal como descrito em materiais e métodos. Os tumores foram medidos a cada dois dias e os ratinhos foram administrados com 100 ul i.p. o volume para 12 dias por um período total de 32 dias. Os ratinhos que receberam Dox 9 mg /kg pareceram ser muito doente com uma perda de apetite, resultando na perda de peso após o primeiro tratamento e subsequentemente morreu após 4 tratamentos. Os ratinhos nos outros grupos pareciam ser saudáveis ​​sem perda de apetite ou peso durante todo o período de tratamento. O volume do tumor não foi significativamente diferente entre o veículo, Dox 1 mg /kg e WFA 2 mg /kg grupos. No entanto, os ratinhos que receberam Dox 1 mg /kg com FMA 2 mg /kg (grupo 6) mostrou uma redução altamente significativa (70 a 80%) no crescimento do tumor (Fig. 9A). Da mesma forma, o peso do tumor medido no dia 32 recolhidas na altura do sacrifício dos animais, mostrou uma diminuição drástica no Dox 1 mg /kg com FMA 2 mg /kg de grupo (Fig. 9B) em comparação com outros grupos, indicando que a combinação de FMA com Dox induz um efeito sinérgico na supressão do tumor de crescimento do tumor

in vivo

.

(a) tumores de crescimento foi medida a partir do dia 20-32 (injeção de pós-célula) e tratado a cada dois dias * P 0,05.