Abstract

Fundo

O nosso objectivo foi desenvolver e validar um escore nuclear multi-função com base em análise de imagem de coloração directa de ADN, e testar sua associação com efeitos de campo e subsequente detecção do câncer de próstata (PCA) em biópsias benignas.

Métodos

As secções de tecido de 39 prostatectomies foram Feulgen coradas e digital digitalizada (400 ×), fornecendo mapas de conteúdo de DNA por pixel. APC e núcleos epiteliais benignas foram selecionados aleatoriamente para a medição de 52 características básicas morfométricas. Modelos de regressão logística que discriminam benigna dos núcleos APC, e benigna de populações nucleares malignos, foram construídas e validadas por análise AUC. populações nucleares foram coletadas aleatoriamente 1 mm ou 5 mm a partir de focos câncer, e de próstatas sem câncer, HGPIN, e PCA Gleason grau 3-5. Nuclei também foram coletadas de pacientes de biópsias negativas que tiveram um diagnóstico posterior de APC e controles sem câncer pareados por idade (20 pares).

Resultados

A pontuação nuclear multi-funcionalidade de discriminados câncer de populações de células benignas com AUC de 0,91 e 0,79, respectivamente, no treinamento e validação conjuntos de pacientes. Em amostras de prostatectomia, ambos os modelos Nucleares e populacionais revelou características câncer como em núcleos benignas adjacentes a APC, em comparação com núcleos que eram mais distante ou das glândulas PCA-livres. Em biópsias negativas, um modelo validado com 5 variância características rendeu pontuações significativamente maiores nos casos do que nos controles (

P

= 0,026).

Conclusões

A multifeature pontuação morfometria nuclear, obtido por análise digital automatizada, foi validado para a discriminação de lesões benignas de núcleos de câncer. Esta pontuação demonstrado efeitos de campo em núcleos epiteliais benignas em diferentes distância de lesões APC, e foi associada com a detecção de CaP subsequente em biópsias negativas.

Impacto

Esta pontuação nuclear mostra promessa como um preditor de risco entre homens com biópsias negativas e como um biomarcador intermediário na Fase II dos ensaios de quimioprevenção. Os resultados também sugerem que os distúrbios subvisual na estrutura nuclear preceder o desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas

Citation:. Gann PH, Deaton R, Amatya A, Mohnani M, Rueter EE, Yang Y, et al. (2013) Desenvolvimento de uma assinatura Morphometric Nuclear para o cancro da próstata de Risco em biópsias negativas. PLoS ONE 8 (7): e69457. doi: 10.1371 /journal.pone.0069457

editor: Konradin Metze, Universidade de Camp’nas, Brasil

Recebido: 12 de dezembro de 2012; Aceito: 09 de junho de 2013; Publicação: 26 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer SR1 CA155301 e SR1 CA90759. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

mudanças sutis na forma nuclear, tamanho e textura preceder o reconhecimento histológico de câncer de próstata (PCA) e, portanto, pode fornecer um útil biomarcador que indica um campo com tecido benigno de alto risco. Na verdade, o alargamento nuclear, irregularidade, hipercromasia e proeminência dos nucléolos estão entre as marcas utilizadas pelos patologistas para distinguir de alto grau neoplasia intraepitelial prostática (HGPIN), a lesão pré-maligna mais amplamente reconhecido para CaP. Mais de 25 anos atrás, os investigadores com experiência em ciência óptica e computação começaram a usar técnicas de imagem digital em um esforço para transcender as limitações do olho humano e do cérebro para reconhecer e quantificar padrões visuais em núcleos sob o microscópio [1]. Estes esforços alcançou um marco quando imagem digital foi incorporada ao padrão de cuidado para avaliação citológica no rastreio do cancro do colo do útero. No entanto, apesar dos numerosos relatos de sucesso usando uma variedade de abordagens e melhorias marcantes em hardware e software, morfometria nuclear assistida por computador ainda tem abundante potencial não desenvolvido para a descoberta de biomarcadores úteis na investigação CaP [2], [3]. Veltri, et ai. publicou recentemente uma excelente revisão abrangente da história e evolução deste campo [4].

No presente trabalho nos concentramos em quantificação de padrões de DNA nuclear como um biomarcador para a fase inicial de mudança de pré-neoplásicas em benigna da próstata epitélio, uma fase associada com os efeitos do campo ou campos de cancerização [5], [6]. Validação de tal biomarcador pode levar a aplicações clínicas e de pesquisa. Clinicamente, um perfil morfométrica poderia ser utilizada para prever a presença de cancro noutras partes da glândula em biópsias negativas e, assim, contribuir para as decisões relativas ao acompanhamento e a necessidade de repetir a biópsia. PCA é o único cancro comum que é tipicamente diagnosticado por biópsia com agulha aleatório, devido à utilização de um teste de soro (PSA) como o principal indicador de biópsia e a ausência de qualquer método de imagem para visualização de lesões. Como resultado, 70-75% das biópsias iniciais são negativos e os médicos não têm nenhuma base estabelecido para adaptar cuidados de acompanhamento, o que poderia incluir o acompanhamento de PSA e repetir a biópsia. Em termos de aplicação de pesquisa, um perfil de morfometria nuclear validado poderia servir como um biomarcador endpoint intermediário para ensaios de prevenção de Fase II, ajudando a identificar as melhores intervenções candidatos para testes em demorados e dispendiosos estudos de Fase III.

Nós montamos uma grupo multidisciplinar que incluía patologistas, epidemiologistas, bioengenheiros, especialistas em computação e estatísticos para desenvolver uma abordagem que iria atender a dois requisitos básicos: 1) utilização de plataformas amplamente disponíveis para aquisição de imagem e desenvolvimento de algoritmos, e 2) a validação sistemática. Neste relatório nós descrevemos o desenvolvimento de uma pontuação nuclear contínua, multi-função com base em mapeamento de pixel por pixel da coloração DNA Feulgen que discrimina com precisão o câncer e populações de células normais no tecido da próstata e define um efeito de campo em áreas benignas de alto risco.

Métodos

declaração Ética

o projeto foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Illinois em Chicago. As amostras de tecido foram obtidos sob uma renúncia IRB-aprovado de consentimento aplicável a amostras de tecido residual não é necessário para fins clínicos de-identificados. Esses procedimentos estavam em conformidade com as disposições de privacidade da Health Insurance Portability e Accountability Act (HIPAA) de 1996. Os autores estão abertos à colaboração envolvendo a partilha dos dados identificou-de, desde que todos os requerimentos do IRB locais foram atendidos.

seleção da amostra

tecidos para a construção de modelos e validação

Montamos duas coleções, de hospitais separados, de blocos de tecido de pacientes de prostatectomia radical com PCA. O primeiro conjunto, que foi o aprendizado definido para o desenvolvimento de modelos de discriminar o cancro dos núcleos benignos, incluiu 20 pacientes e o segundo set, utilizado para validação externa, incluiu 11 pacientes. Entre os 31 pacientes de prostatectomia, 11 tinham cancros com Gleason soma grau 6, 10 com Gleason 7 e 10 com Gleason graus 8-9. Todos os blocos de tecido a partir de 8 pacientes submetidos cistoprostatectomia para câncer de bexiga também foram acessados. Estes próstatas totalmente incorporados eram desprovidas de APC sobre cortes seriados em intervalos de 3 mm e foram usados ​​para fornecer “supernormal” benigna da próstata.

Feulgen coloração

As secções de tecido de espessura 4μ foram colocados no vidro silanizada lâminas e foram coradas utilizando o azul Feulgen coloração Kit (ScyTek Laboratories, Logan, UT). Esta mancha utiliza a reacção de Feulgen para se ligarem directamente aos grupos aldeído corante de ADN em que são expostos por tratamento com ácido clorídrico. A quantidade de cor desenvolvida é directamente proporcional à quantidade de DNA no núcleo corado; a mancha tenha sido validado para análise de ploidia. Cortes seriados foram corados com hematoxilina e eosina para que principais compartimentos histológicos poderia ser facilmente identificado nos slides Feulgen de uma só cor. As secções adjacentes de uma única amostra prostatectomia foram incluídos em cada lote e a intensidade média da coloração nuclear foi monitorizada para detectar uma variação excessiva inter-lote. Alguns estudos morfometria nucleares têm usado a hematoxilina mais rotineiro e eosina (H E) mancha em vez de mancha Feulgen. Embora a mancha de Feulgen é menos familiar e um pouco mais complexo para executar, acreditamos que isso tem a vantagem importante de ser aproximadamente estequiométrica de ADN enquanto que as estruturas coradas com H E não são específicos. Além disso, descobrimos que a mancha Feulgen é mais fácil de reproduzir em vários lotes de amostras.

A aquisição de imagens e processamento

As lâminas foram feitos a varredura em 400 × em um Aperio ScanScope® CS digital de todo-slide microscópio (Aperio Inc., Vista, CA). imagens de slide inteiras foram adquiridos utilizando compressão JPEG 2000 com o fator de qualidade fixado em Q80 (perda de 20% a partir da imagem RAW). Uma ferramenta de desenho digital foi utilizado na prostatectomia desliza para delimitar áreas de CaP de Gleason de grau, HGPIN e benignos áreas dentro de 1 mm ou 5 mm foco do cancro. áreas digitalizadas grandes foram divididos em arquivos de sub-imagem menores (compressão JPEG, fator de qualidade 80), utilizando a função de instantâneo Generator no software de gerenciamento de imagem Aperio Spectrum®; esses arquivos sub-imagem foram exportados para Matlab® (MathWorks, Inc., Natick, MA) para processamento em lote. O lote processado arquivos de sub-imagem foram 752 × 752 pixels de tamanho (pixel size = 0.25μ

2, cerca de 400-600 pixels por núcleo), que era um tamanho gerenciável para processamento. arquivos de imagem não comprimida tiff produziu aproximadamente 900-1000 pixels por núcleo; no entanto, os requisitos de espaço de memória e taxa de transferência foram substancialmente aumentados.

rotinas personalizadas em Matlab foram utilizados para identificar pixels contendo DNA e segmento núcleos individuais usando base-color K-means clustering e de bacias hidrográficas algoritmos. Para os estudos aqui relatados, núcleos segmentados foram seleccionados manualmente para a coleta de recurso morfométricas utilizando uma interface gráfica. Segmentação e selecção nuclear foi realizada em vários passos. Primeiro, cada 752 × 752 pixels sub-imagem foi carregada em Matlab. Em seguida, cada imagem foi convertida de RGB para CIELAB (L * a * b *) de cores (Comissão Internacional de Iluminação, https://cie.co.at), cujos três eixos representam um valor de luminosidade (L *), posição sobre a espectro vermelho-verde (a *), e posição no espectro amarelo-azul (b *). Isto reduz o número de dimensões de cor de três em RGB para dois, o mínimo necessário para as imagens de Feulgen de duas cores brancas e azuis. Em seguida, um K-means clustering algoritmo baseado na distância euclidiana foi usada para classificar cada pixel como azul (DNA) positivo ou branco. As entradas iniciais para K-means clustering pode afetar a saída; assim, inicial L * a * b coordenadas foram estabelecidas com base em núcleos de boa qualidade de imagem como selecionados por um patologista. segmentação divisor de águas controladas pelo marcador com base em imagens em escala de cinza foi implementado em Matlab para definir limites nucleares individuais (https://www.mathworks.com/products/demos/image/watershed/ipexwatershed.html). Essa abordagem evita o excesso de segmentação, marcando agregados de intensas pixels dentro dos núcleos e fundo pixels fora de núcleos.

Um técnico treinado foi presenteado com uma série de subimages com núcleos segmentados em um monitor de PC e sobre clicou com o mouse cada núcleo bem-segmentado após verificar a sua localização epitelial, enviando assim os seus dados morfométricos para uma planilha do Excel. A maioria dos erros de segmentação foram devido a sobre ou sub-segmentação dos núcleos tocar ou sobrepostos; entre os núcleos selecionados encontramos nenhuma associação entre características nucleares e proximidade com outros núcleos e, portanto, acreditamos que este procedimento era relativamente imparcial. Um contador digital informado quando o técnico de um total de 200 núcleos epiteliais, a partir de uma vasta gama de subimages, tinha sido seleccionado a partir de cada região secção inteira de interesse ou biópsia. Um total de 52 variáveis ​​básicas (ver Tabela S1) foram coletadas para cada núcleo refletindo tamanho, forma e características de textura DNA; descrições mais detalhadas de muitos destes recursos estão disponíveis na literatura [7]. As características especiais que capturaram áreas nucleares com qualquer condensado ou DNA escasso ( “bolhas” e “buracos” na imagem Feulgen) foram desenvolvidos com base na identificação de pixels contíguos com desvios substanciais em relação a densidade óptica média (ver Tabela S2). Outros tipos de recursos, incluindo recursos fractal, são facilmente calculadas, mas não usá-los nessa análise. Muitos recursos estão altamente correlacionados uns com os outros e descobrimos que, em geral, ampliando a biblioteca de recursos aumentou o tempo de processamento, sem melhorar substancialmente nossos resultados. Para ajustar as possíveis diferenças de coloração através lotes e obter unidades de medida comuns em recursos, que z-transformada cada valor recurso subtraindo a média e dividindo pelo desvio-padrão dessa característica entre todos os núcleos do lote.

a análise estatística

a análise centrada no desenvolvimento de dois tipos de modelos: um para discriminar núcleos cancerosas individuais a partir de núcleos benignos, ea outra para discriminar populações de núcleos de câncer de populações benignas. Estes modelos rendeu dezenas multivariados nós rotulados como MFS

n (pontuação multifeature, nuclear) e MFS

p (pontuação multifeature, população) – correspondente a Nucleares e dezenas de nível de população, respectivamente. Usando dados sobre cerca de 8.000 núcleos obtidos a partir de CaP anotado e áreas benignas no conjunto de aprendizagem de 20 amostras de RP, construímos modelos de regressão logística para discriminar núcleos de câncer (todos os graus de Gleason) a partir de núcleos benignos, pelo menos, 5 mm a partir de um foco de câncer. Nós comparamos várias abordagens para a criação de modelos multivariados discriminatórias, incluindo a análise linear discriminante, regressão logística, Support Vector Machines e redes neurais e encontrado, de acordo com trabalhos anteriores publicados, que a regressão logística foi tão bom ou melhor do que outras abordagens [8]. Foram selecionadas variáveis ​​para inclusão nos modelos logísticos com base na eliminação para trás com um critério de inclusão de

P Art 0,05. Como esperado, algumas variáveis ​​foram altamente correlacionados, mas nenhum modelo falhou para convergência devido à multicolinearidade. A estatística C foi calculada como a área sob a curva (AUC) para discriminar o cancro dos núcleos benignas. Um modelo logístico com 27 recursos acumulados desde um alto AUC (0,93), em uma amostra de teste independente de núcleos benignos e câncer obtidos a partir dos 11 casos no conjunto de validação RP externo. Utilizou-se o de duas amostras de Kolmogorov-Smirnov estatística para comparar a distribuição de MFS

N pontuação entre populações nucleares amostradas em vários compartimentos histológicos no conjunto 20 de RP, além de áreas benignas dos 8 casos de prostatectomia sem CaP significativa (ou seja, núcleos “sobrenaturais”).

Foram utilizadas duas abordagens para a construção de modelos para MFS

p. Na primeira abordagem, o que nós chamamos uma de duas etapas MFS

p, calculamos a MFS

n para cada núcleo e, em seguida, calculado até o momento de quarta ordem (média, desvio padrão, assimetria e curtose) do MFS

N distribuição para a população de núcleos obtidos a partir de cada amostra de tecido (benigna ou maligna). Estas quatro variáveis ​​sumárias foram então usados ​​como preditores em modelos de regressão logística para discriminar o benigna vs. populações malignas e a probabilidade equipada do modelo logístico com um determinado conjunto de co-variáveis ​​foi designado como o MFS

p. Nós derivados de um passo MFS

p através do cálculo da média, desvio padrão, assimetria e curtose para cada função nuclear a partir de cada amostra de tecido, produzindo um total de 208 potenciais preditores (quatro vezes 52 características básicas). Nós, então, usado tanto para trás eliminação ou regressão logística best-subconjunto da população de treinamento de 28 pacientes para selecionar um conjunto reduzido de preditores para discriminar o cancro a partir de populações nucleares benignas. Na abordagem best-subconjunto, os 50 melhores combinações de conjuntos de previsão com até cinco variáveis ​​foram classificados com base no critério chi quadrado da razão de verossimilhança. Para cada uma dessas combinações foi calculado o leave-one-out AUC validação cruzada no conjunto de treinamento de amostras, eo modelo com a maior AUC foi escolhido como o modelo final. Os pesos de regressão final para cada indicador, foram calculados como o coeficiente médio de todos os 28 ensaios no conjunto de treinamento. Os modelos finais escolhidas no processo de desenvolvimento foram então testadas no conjunto de validação independente que incluiu 11 amostras de prostatectomia radical. Os limites de confiança para a AUC (nível de 95%) foram calculados usando uma abordagem não paramétrico que explora as propriedades da estatística de Mann-Whitney [9]. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SAS-PC, versão 9.1 (SAS, Inc., Cary, NC):

estudo piloto de validação externa:. Comparação de caso-controle biópsias benignas

Como um link externo teste de validação, comparamos populações de núcleos benignos retiradas de biópsias de próstata negativas em que o paciente foi encontrado para ter CaP, pelo menos, dois anos mais tarde (casos, n = 20) e núcleos benignos de biópsias negativas de pacientes que permaneceram livre do câncer (controles , n = 20). Casos e controles foram pareados por idade e data da biópsia índice; todos os assuntos eram pacientes do Jesse Brown Veterans Administration Medical Center, em Chicago. controlos elegíveis tinham, pelo menos, duas biópsias negativas após a biópsia índice, sem PSA 10 ng /ml, e sem terapia anti-hormonal, incluindo inibidores da 5α-redutase. Nós Feulgen-manchada do tecido índice de biópsia negativa e obteve características morfométricas nucleares como descrito acima. em seguida, calculamos equipado MFS

pontuações p para cada indivíduo usando tanto a eliminação para trás e modelos mais subconjuntos anteriormente derivado de discriminação das populações benignos e células de câncer nas amostras de prostatectomia. Para ambos os modelos, foram calculados os limites de confiança AUC e de 95% para discriminar casos de controles, e realizou um teste t pareado para os dados correspondentes.

Resultados

A figura 1 ilustra o processo para a obtenção de mapas de pixel-a-pixel para cada núcleo com base na densidade óptica derivado do conteúdo em ADN. deslizantes imagens digitalizadas inteiras de núcleos Feulgen coradas são divididos em subimages (Figura 1a), cada uma contendo aproximadamente 5,6K pixels. A imagem binária associado, criado por K-means, é mostrado na Figura 1b. A Figura 1C mostra o mesmo após a segmentação subimagem bacia e indica como núcleos epiteliais bem segmentado pode ser seleccionado para a medição, quer manualmente ou automaticamente. Figura 1d mostra gráficos em 3 dimensões de mapas de pixel para núcleos de áreas benignas e câncer, respectivamente.

A Figura 2 mostra os histogramas de frequências relativas para uma pontuação multifeature de nível nuclear (MFS

n) obtido a partir de núcleos em vários compartimentos histológicos de 20 RP e 8 amostras cistoprostatectomia; cada um dos compartimentos é representada por, pelo menos, várias centenas de núcleos. O modelo logístico utilizado para gerar MFS

N pontuações incluídos 27 características nucleares e foi baseado em discriminação entre os núcleos CaP aleatórios e núcleos benignos distantes de câncer (Far Normal) nos casos de RP 20. O MFS

n, que é o anti-logit registado a partir do modelo logístico, é equivalente à probabilidade de que um núcleo com um dado conjunto de valores de características é um núcleo de cancro, e, portanto, varia de 0 a 1,0. A distribuição de freqüência de MFS

n turnos para a esquerda como um progride de Gleason 5 a Gleason 3 a HGPIN e continua a se deslocar para a esquerda para núcleos que estão localizados perto ou longe de um foco de câncer, ou são obtidos de próstatas sem câncer (supernormal). As distribuições de freqüência para núcleos normal agora ( 5 mm a partir de um foco PCA) são significativamente diferentes de ambos os outros tipos benignos de núcleos (Kolmogorov-Smirnov D estatística

P Art 0,0001)

.

pontuações multifeature embutidos foram gerados para cada núcleo de um modelo de regressão logística comparando todos os núcleos cancerosas para núcleos normais-far ( 5 mm a partir de um foco de câncer) a partir de 20 espécimes de prostatectomia, com 27 características de variáveis ​​independentes selecionadas por eliminação para trás. Pontuações foram calculadas para as populações dos núcleos obtidos a partir de compartimentos histológicos específicos em amostras de 20 RP e 8 cistoprostatectomia. As distribuições de freqüência para núcleos normal agora são significativamente diferentes um do outro tipo benigna (Kolmogorov-Smirnov D estatística 0,0001).

distribuição de frequências típicas de MFS

n para as populações de benigno e CaP núcleos do mesmo paciente são mostrados em justaposição na Figura 3. os valores para os núcleos de cancro são geralmente deslocada para a direita, mas também é claro que a variância na pontuação é maior para o cancro em comparação com núcleos benignos. modelos logísticos de nível população nos permitem explorar essa característica variância em discriminar canceroso de grupos benignos de núcleos. A Figura 4 mostra boxplots para MFS

p a partir de modelos de duas etapas com apenas dois co-variáveis: a média e desvio padrão de MFS

n para qualquer população de núcleos. Dados nos boxplots vêm dos assuntos 20 RP mais a 8 com cistoprostatectomia; os médios MFS

pontuações p para os 11 indivíduos RP no conjunto de validação são representados por asteriscos. Os resultados indicam que as populações nucleares quase normais são intermediárias entre Normal Far e câncer, que as populações Supernormais têm pontuações mais baixas do que o normal Far, e que as populações nucleares HGPIN são semelhantes às populações cancerosas. Os médios MFS

pontuações p para núcleos obtidos a partir de um conjunto de validação externa dos assuntos prostatectomia com PCA confirmar a mesma diferença entre Perto vs. núcleos Extremo e a semelhança entre HGPIN e núcleos APC.

MFS

n pontuações são deslocados para cima para núcleos de câncer como esperado; no entanto, variância para MFS

n também é maior entre os núcleos de câncer, refletindo pleomorfismo.

A média MFS

pontuações p para as populações nucleares dos 11 RPs validação são mostrados por asteriscos. O

pontuações p MFS foram obtidos a partir de um modelo de regressão logística com apenas dois co-variáveis: média de MFS

n e S.D. MFS

n. MFS

n pontuações foram gerados a partir de um modelo logístico de 27 covariável com recursos selecionados por eliminação para trás.

A tabela 1 mostra as AUC para a formação e validação definir a discriminação de células de câncer de populações de células benignas espécimes de prostatectomia usando dois modelos diferentes para calcular MFS

p. Modelo A, que usou um procedimento de eliminação para trás convencional para seleccionar os cinco melhores co-variáveis, teve uma validação cruzada AUC = 0,87 no conjunto de treinamento e AUC = 0,83 no conjunto de validação independente. Modelo B, derivado comparando todos os subconjuntos possíveis com cinco ou menos co-variáveis ​​com base em leave-one-out validação cruzada, tinha AUC = 0,91 e 0,79 nos conjuntos de treinamento e validação, respectivamente. Os recursos selecionados e seus coeficientes padronizados para a eliminação definitiva para trás e melhor subconjunto MFS

modelos P (modelos A e B, respectivamente) são apresentados na Tabela S3 suplementar.

populações, em seguida, em comparação de núcleos de pares combinados de biópsias negativas em que o caso sujeito, posteriormente, tiveram um diagnóstico de CaP eo controle permaneceram livre do câncer. populações nucleares de cada sujeito foram atribuídos equipado MFS

pontuações p baseado no modelo A e modelo B; Assim, estes modelos foram desenvolvidos usando conjuntos de amostras completamente independente do prostatectomies em vez de biópsias. Os resultados do teste AUC e emparelhado T são apresentados na Tabela 2. Ambos os modelos demonstraram diferenças significativas entre casos e controles, com casos de ter uma assinatura de morfometria nuclear mais cancer-like.

Discussão

neste estudo, desenvolvido e validado uma pontuação de morfometria nuclear, com base na coloração directa de ADN, que discriminou com precisão benigna dos núcleos de câncer no tecido da próstata. Esta pontuação caracteriza um efeito de campo em histologicamente núcleos epiteliais benignas em diferentes distâncias a partir de um foco de câncer, e está associada com subsequente detecção de CaP em um conjunto independente de biópsias negativas. É significativo notar que as imagens nucleares individuais foram obtidos com imagiologia corrediça toda a 400 ×. Assim, nós fomos capazes de capturar eficazmente um grande número de núcleos epiteliais a partir de cada amostra de tecido com uma ampliação que permite uma considerável detalhe com respeito ao tamanho nuclear, forma e textura de ADN. Dado mapas de nível de pixel, mostrando a distribuição espacial de ADN no interior de cada núcleo, é possível gerar uma biblioteca quase ilimitado de características morfométricas. Na abordagem aqui apresentada, esta biblioteca agnóstico é extraído para determinar conjuntos reduzidos de recursos para os modelos que distinguem benigna de células malignas. Com base na suposição de que há uma continuidade na evolução da forma e textura nuclear durante a carcinogénese, as pontuações multivariáveis ​​resultantes proporcionam um índice contínuo do “cancro ness” de cada um dos núcleos, e assim a “cancro ness” colectivo para qualquer população de núcleos. Em geral, as características relacionadas com o cancro observadas por análise digital são simplesmente extensões subvisual de alterações nucleares que são bem reconhecidos para o olho humano sob o microscópio: núcleos de cancro são um tanto maiores e têm uma distribuição mais agregada ou irregulares de cromatina. Além disso, todos os recursos incluídos no modelo mais altamente preciso que encontramos foram relacionados com o grau de variação entre os núcleos, apoiando assim vistas de longa data entre os patologistas sobre a importância de pleomorfismo nuclear no diagnóstico de câncer.

A nossa estudo baseia-se numerosos esforços anteriores que aplicaram morfometria nuclear digital para questões que envolvem risco e prognóstico no câncer de mama [10], colo do útero [2], orofaringe /pulmão [11], cólon [12], a pele [13] e de próstata . Na próstata, morfometria nuclear tem sido mostrado para detectar anomalias em tecido benigno adjacente ao cancro e HGPIN [14], [15]. Nossos dados mostraram mais evidências de um fenótipo de câncer em núcleos dentro de 1 mm da lesão neoplásica, em comparação com aqueles pelo menos 5 mm distante; no entanto, os dados anteriores sugerem que essas anormalidades podem se estender até 10 mm a partir da borda de uma lesão [16]. Mairinger e co-trabalhadores extraída fisicamente núcleos benignos de tecido embebido em parafina e, utilizando preparações de Cytospin de Feulgen coradas, relataram que a combinação de três características de textura da cromatina pode discriminar com precisão casos com CaP daqueles com apenas BPH [15]. Notavelmente, duas destas três principais características discriminatórios reflectida variação inter-núcleo, em vez de valores médios. morfometria nuclear para além da existência de um efeito de campo no tecido benigno, vários estudos têm usado de tumores e de tumores adjacentes núcleos de discriminar subgrupos de pacientes CaP acordo com a probabilidade de progressão, enquanto na vigilância activa, a recorrência PSA, metástase ou específicas-PCA morte [17], [18], [19], [20], [21]. Mais uma vez, a variação apresenta refletindo a instabilidade desempenhar um papel proeminente nestes modelos, como o fazem em nossos resultados.

Os mecanismos biológicos responsáveis ​​por mudanças na estrutura nuclear que surgem antes do aparecimento do histologicamente neoplasia reconhecíveis não são bem compreendidos . No entanto, vários processos poderia estar implicada. Em primeiro lugar, a transição de euchromatin solto para heterocromatina mais compacto é um mecanismo importante para modular a expressão do gene, que é controlado a um grau por modificação covalente de caudas das histonas. Padrões de modificação da histona global, por acetilação ou metilação, são identificáveis ​​no APC e têm sido associados com a agressividade do tumor [22], [23]. Mahmoud, et al observada diminuição acetilação global da histona 3 lisina 9 (H3K9ac) no PIN e PCA em comparação com o tecido de BPH e semelhanças ainda mais observadas na expressão H3K9ac entre PIN e células normais localizados perto uma lesão PIN [24]. Há também evidência de que o p300, um co-activador transcricional do receptor de androgénio, podem alterar a estrutura nuclear em células da próstata através da sua actividade como uma histona acetiltransferase ou através dos seus efeitos sobre a expressão de proteínas da matriz nuclear, tais como lamina A e C [25] . Isharwal, et ai. relatado uma associação entre características morfométricas nucleares específicos e expressão p300 [26]. Irregularidades no envelope nuclear, incluindo infolding e partidas de uma forma esférica, são uma característica de longa observada de células APC, ainda as razões para esta irregularidade e à sua importância funcional são pouco conhecidos [27]. Evidências recentes indicam que a expressão do oncogene MYC desempenha um papel importante na modulação nucleolar tamanho, forma e número nas fases iniciais da carcinogénese da próstata [28]. O papel do microambiente tumoral e a sinalização parácrina deve também ser considerado, uma vez que uma resposta ferida localizada pode causar a expressão do gene alterada em estroma benigno adjacente às lesões CaP [29]. Estes efeitos no campo do estroma poderia induzir alterações morfológicas sutis no epitélio benigno, incluindo mudanças associadas com epitelial-a-mesenquimal transformação [30].

Este estudo contribui para o campo identificando sistematicamente as alterações nucleares associados ao câncer de próstata no epitélio benigno usando uma plataforma de microscopia eletrônica digital amplamente disponível. Seus pontos fortes incluem a validação com conjuntos independentes de amostras de prostatectomia e cistoprostatectomia radicais, bem como uma análise de caso-controle comparando biópsias negativas de pacientes que tanto fez ou não posteriormente experimentam um diagnóstico CaP. Dado o grande número de potenciais preditores para a um passo MFS

p eo número relativamente pequeno de indivíduos (28) em nosso conjunto de treinamento, é inteiramente possível que outras combinações de características poderia ter um desempenho tão bom ou melhor do que aqueles em nosso modelo final. Portanto, é importante notar que nós usamos uma abordagem de validação cruzada eficiente leave-one-out (similar para o bootstrap resampling) para selecionar modelos e que o nosso objetivo não era necessariamente para encontrar o melhor modelo absoluto, mas para validar os modelos escolhidos em conjuntos independentes de imagens. Os modelos finais, que foram derivadas de amostras de prostatectomia, escores de risco não só produzidos que foram associados com o cancro em amostras de prostatectomia independentes, mas também demonstraram uma associação com o risco de câncer em amostras de biópsia. A nossa técnica deliberadamente excluídos núcleos basais epiteliais, e permitiu a selecção imparcial de um grande número de núcleos de células luminais de cada amostra.