Abstract

KRAS

é mutado em ~ 40% de câncer colorretal (CRC), e não são limitados tratamentos eficazes para avançada

KRAS mutante

CRC. Portanto, é essencial que os mediadores a jusante da KRAS oncogénicos continuar a ser estudado. Foram identificados como sendo p190RhoGAP fosforilada na linha de células DLD1 CRC, que expressa um heterozigótico

KRAS

alelo G13D, e não em DKO4 em que o alelo mutante foi eliminado por recombinação somática. Descobrimos que um parceiro de ligação onipresente de p190RhoGAP, p120RasGAP (RasGAP), é expressa em níveis muito mais baixos em células DKO4 comparação com DLD1, e esta expressão é regulada por KRAS. Resgate de expressão RasGAP em DKO4 resgatado a activação da via de Rho e tumorigenicidade parcialmente resgatados em células DKO4, indicando que a combinação de expressão KRAS mutantes e RasGAP é crucial para estes fenótipos. Concluímos que RasGAP é um efetor importante do KRAS mutante no CRC

Citation:. Organ SL, Hai J, Radulovich N, Marshall CB, Leung L, Sasazuki T, et al. (2014) p120RasGAP é um mediador de Rho via de activação e de tumorigenicidade na linha celular DLD1 cancro colorectal. PLoS ONE 9 (1): e86103. doi: 10.1371 /journal.pone.0086103

editor: Juliet Spencer, da Universidade de San Francisco, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de outubro de 2013; Aceito: 05 de dezembro de 2013; Publicação: 21 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Organ et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado em partes por doações dos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde MOP-64345 (MST), Cancer Research Society of Canada (MI) e do Ministério da Saúde de Ontário e Cuidados de longa Duração. SLO é suportado pelo CIHR Banting e Best Award pesquisa de doutorado. MI detém a cátedra Canada Research in Câncer Biologia Estrutural. MST é o Presidente M. Qasim Choksi em Lung Cancer Translational Research. A instalação UHN NMR é apoiado pela Fundação Canadense para a Inovação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

na América do Norte, o câncer colorretal (CCR) é a terceira forma mais comum de câncer em homens e mulheres. Em 2013, estima-se que mais de 100.000 novos casos serão diagnosticados nos Estados Unidos, o que resulta em mais de 50000 mortes [1]. Embora a taxa de morte por cancro colorectal diminuiu em 3% ao longo dos últimos dez anos [1], doença metastática, o mais proeminente para o fígado, irá desenvolver-se em 30% a 40% dos pacientes de CRC, e 50% vão morrer de CRC recorrência [2]. A ressecção cirúrgica é o padrão para o tratamento de CRC fase inicial, mas limitados terapias eficazes estão disponíveis para pacientes avançada [3]. O desenvolvimento de CRC envolve um processo de vários passos com a acumulação de alterações genéticas e dois epigenética, incluindo as alterações da via KRAS [4].

KRAS

mutações ativadoras ocorrem em aproximadamente 40-50% do CRC, com as mutações mais comuns, sendo encontrado no códon 12 (-80%) e códon 13 (~ 20%).

Actualmente , os mais novos tratamentos aprovados para CRC são com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR inibidores orientados), tal como cetuximab e panitumumab, em combinação com quimioterapia. No entanto, apenas os pacientes com o tipo selvagem

KRAS

derivar benefício clínico significativo com este tratamento, como aqueles com

KRAS

mutações não mostram um benefício significativo da sobrevida [5]. Por isso, os estudos actuais têm como objectivo encontrar novos efectores a jusante do mutante

KRAS

que pode ser usado em combinação para inibir a sinalização a partir desta via.

A actividade do RAS do tipo selvagem é estreitamente controlada pela famílias de proteínas ase-GTP de activação (GAPs), que inativam RAS, facilitando a hidrólise de GTP ligado e fatores de câmbio GTP (GEFs), que facilitam a liberação do PIB para que RAS pode, mais uma vez se ligam GTP [6]. Da grande família de RasGAPs que são agora conhecidos, um dos primeiros identificados e mais estudada é p120RasGAP, ou simplesmente RasGAP, o produto da

gene RASA1

[7], [8]. O rompimento da

gene RASA1

em ratos resulta em letalidade embrionária em E10.5, devido ao desenvolvimento do sistema cardiovascular aberrante [9]. embriões de ratos transgénicos criados a partir de ARNi mediado

RASA1

knockdown em células ES demonstrado que a gravidade dos defeitos vasculares correlacionadas com o nível de expressão RasGAP residual e embriões mosaico desenvolver defeitos [10] localizado. De acordo com estes estudos com ratos, mutações no

gene RASA1

têm sido relacionados com capilares familiar síndromes de malformações venosas que podem apresentar com uma vasta gama de fenótipos, mais comumente conhecido como que uma “mancha vinho do porto” [11] [12], [13], [14], [15]. proteomic análise recente das lesões da pele mostrou consistente diminuição da expressão de RasGAP em comparação com o tecido circundante normal, [16]. Este conjunto sugere que

RASA1

desempenha um papel crucial na angiogénese e desenvolvimento vascular. No entanto, embora a modulação da proteína de RasGAP foi encontrado em várias neoplasias incluindo leucemia mielóide crónica [17], astrocitoma [18], tumores trofoblásticas [19], o cancro da próstata [20], do cancro do fígado [21], e carcinoma de células basais [22 ], os níveis de proteína não foram ainda encontrados para ser correlacionada com a actividade do RAS ou gravidade do cancro [22], [23]. Portanto, o papel da RasGAP no cancro continua a ser esclarecida.

A configuração do domínio SH2-SH3-SH2 na região N-terminal de RasGAP há muito sugeriu aos pesquisadores que RasGAP poderia desempenhar um papel como um adaptador de sinalização proteína, ao contribuir para, assim como independente de, a sua actividade GAP [7], [24]. Mais importante, estes domínios foram encontrados para se ligar a tirosina fosforilada p190RhoGAP (aqui referido como RhoGAP) em resposta a montante e a actividade da quinase de adesão celular [25], [26], [27]. Esta descoberta forneceu a primeira evidência mecanicista para uma ligação entre a ativação RAS e sinalização da via Rho. O nosso grupo tem encontrado recentemente que RhoGAP se torna tirosina fosforilada jusante do c-MET sinalização no mutante DLD1

KRAS

linha de células CRC [28]. Por isso, procurou determinar o papel do KRAS ativos na interação RhoGAP-RasGAP, eo efeito dessa interação nas células tumorais CRC.

Procedimentos Experimentais

cultura celular

DLD1 (ATCC, Manassas, VA) é uma linha celular de cancro colo-rectal que é heterozigoto para o G13D

KRAS

mutação. DKO4 células foram derivadas de DLD1 por disrupção do mutante

KRAS

alelo por recombinação somática [29]. Ambas as linhas celulares foram rotineiramente cultivadas em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS).

A modulação da expressão do gene

O RASA1 superexpressando lentiviral vector foi construído utilizando o gateway sistema de recombinação (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). vector de entrada contendo ou promotor CMV ou RASA1 ORF (OpenBiosystems, ThermoScientific, Ottawa, ON) foram recombinadas com vector Plenti-CMV-GFP-DEST (Addgene plasmídeo 19732) criando pLentiCMV e pLentiRASA1. células HEK293T foram transfectadas com estes vectores e vectores plenti embalagem lentiviral, conforme descrito anteriormente [30]. Os sobrenadantes virais foram recolhidos, filtrados, e utilizados para infectar células alvo na presença de 4 ^ g /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 72 horas após a transdução, as células foram classificadas para expressão da GFP. Para KRAS mutante superexpressão, retrovírus foram gerados por transfecção de células de empacotamento ecotr�ica Phoenix com o pBabepuro vector retroviral contendo ou de tipo selvagem KRAS-4B, o mutante

KRAS

construções, ou vector vazio usando FuGENE 6 reagente de transfecção (Promega, Madison, WI). Os sobrenadantes retrovirais foram recolhidas como descrito acima, e as células foram seleccionadas com 0,5 ug /ml de puromicina (ICN Biomedicals, Irvine, CA) até que não as células de controlo não transfectadas foram deixadas vivo.

Imunoprecipitação e Western Blotting

As células foram lisadas em Triton X-tampão de 1% 100 (1% de Triton X-100, 10% de glicerol, Hepes 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, NaF 100 mM, na a 10 mM

4P

2O

4, EDTA 1 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, mais um mini-comprimido completa isento de EDTA inibidor da protease (Roche, Laval, QC), deixou-se repousar em gelo durante 10 minutos e, em seguida clarificados por centrifugação a 14.000 g a 4 ° C durante 30 minutos. a concentração de proteína normalização foi realizada utilizando reagente de ensaio de proteína de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). para imunoprecipitações, a concentração de proteína foi ajustada entre as amostras, e os lisados ​​foram combinadas com 2-5 ul do anticorpo e deixou-se agitar durante a noite a 4 ° C. 30 ul de proteína G PLUS-agarose (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), foram combinadas com os lisados ​​e agitados durante 1 h a 4 ° C. As proteínas imunoprecipitadas foram então lavadas 3x com tampão de lise, eluiu-se com tampão de amostra 20 uL de 2xSDS e fervido durante 5 minutos. lyates celulares totais foram normalizados para a concentração de proteína, juntamente com tampão de amostra e fervida durante 6xSDS 5 minutos, bem. Os lisados ​​foram então carregados para um gradiente de 4-20% de SDS em gel de poliacrilamida (Bio-Rad) e executar a 120 V. Os geles foram transferidos para membranas de PVDF, antes de serem bloqueadas com 5% de leite desnatado seco em TBST ou 5% de BSA em TBST durante 1 hora à temperatura ambiente e depois sondadas durante a noite com o anticorpo apropriado. Westerns foram sondadas com o anticorpo secundário adequado, feito reagir com ECL privilegiada (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e exposto a filme de raio X por a quantidade apropriada de tempo. Os anticorpos foram usados ​​como dirigido:. B4F8 clone RasGAP e clone anti-fosfotirosina 4G10 (EMD Millipore, Billerica, MA), p190A-RhoGAP (Cell Signaling, Danvers, MA), GAPDH e KRAS 4B clone F234 (Santa Cruz Biotechnology)

quantitativa PCR em Tempo real

O ARN total (1-2? g) foi isolado a partir de linhas celulares e tecidos utilizando um kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) e foi transcritos de modo inverso utilizando com SuperScript III transcriptase reversa (Invitrogen, Life Technologies, Burlington, ON). Um equivalente a 10 ng de cDNA foi usado para cada ensaio de PCR quantitativa (qPCR) realizada com o Sistema de Detecção de Sequência Mx3000p Stratagene utilizando SYBR Green 2 × mistura principal. Os iniciadores utilizados são:

GAPDH F – CCCCCACCACACTG,

GAPDH R – GCCCCTCCCCTCTTCAAG

RPS13 F – GTTCTGTTCGAAAGCATTG

RPS13 R – AATATCGAGCCAAACGGTGAA

RASA1 F – GGACGAAGGTGACTCTCTGGAT

RASA1 R – GGAGGAGCGGTCAACGGTAT

KRASF – CAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAG

KRASR-TGTTTTCGAATTTCTCGAACTAATGTA

Previsto sequências de produto de PCR foram verificados usando BLAST de reconhecimento de sequências alvo e não-alvo. Os resultados foram analisados ​​usando o método Ct delta-delta, normalizando contra a média de dois genes de limpeza.

Ensaios baseados em células

celular contagem.

5 × 10

3 células foram plaqueadas em meio de soro completos, em triplicado, durante 5 dias de contagem, numa placa de 24 poços. Começando às 72 horas após o plaqueamento, 3 poços de cada linha de células são tripsinizadas e depois contadas usando um contador de células Coulter Beckman Z2 (Beckman-Coulter, Brea, CA).

ensaio de adesão celular.

1 × 10

5 as células foram semeadas numa placa de 24 poços revestidos com colagénio de 0,01% PureCol (Sigma-Aldrich) durante 15 minutos. Os poços foram corados com violeta de cristal a 0,2% e lisadas com 0,1% de Triton X-100. O lisado foi lida a 590 nm num leitor de placas Tecan XFlour4 (Mannedorf, Suíça).

ensaio de motilidade celular.

7 × 10

4 células foram plaqueadas em 70 mL de completo meio de soro em cada lado de uma inserção de cultura de células μ-prato (Ibidi, Planegg, Alemanha) em uma placa de cultura celular de 24 poços e deixou-se crescer durante 72 horas ou até que uma monocamada confluente foi atingido. A inserção foi removido e meio foi mudado para DMEM isento de soro. imagens de contraste de fase foram adquiridos na Zeiss Axio Observer foi utilizado para tirar uma fotografia a 32 × ampliação neste momento (tempo 0) e a cada 24 horas depois. A análise de imagem foi realizada como descrito anteriormente [31]. Imagem-Pro Plus software (MediaCybernetics, Rockville, MD) foi utilizado para analisar os ensaios de cicatrização de feridas. O uso de filtros de borda e de segmentação, as áreas com grandes variações de intensidade de pixel (células) aparecem luz, enquanto que as áreas lisas da imagem (ferida) aparecem escuras. A imagem filtrada foi então convertida para uma imagem binária por aplicação de um limiar do pixel e a área da ferida foi determinada por contagem da soma de pixels atribuídos. A soma de pixel foi então expressa em fechamento por cento ferida, em que zero pixels na ferida representa o fechamento de 100%.

Imunofluorescência

Glass lâminas de câmara (BD Biosciences, San Jose, CA) foram revestidas durante a noite a 4 ° C com colagénio de 0,01% em PBS. Trypsanised células foram ressuspensas em DMEM + 5% de BSA, plaqueadas em lamelas e deixadas a aderir durante a noite. As lâminas foram então lavadas uma vez com PBS e fixadas com paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente. As células foram permeabilizadas com 0,01% de Tween-20 em PBS durante 20 minutos, bloqueou-se com BSA a 3% em PBS e coradas com rodamina faloidina 1:300 durante 1 h à temperatura ambiente. lamelas de vidro foram aplicados com Vectashield contendo DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para a coloração nuclear. Imagens aqui apresentadas foram tomadas em 43 × ampliação com uma lente de imersão em óleo em um microscópio confocal Zeiss LSM 700.

CRC coleta de amostras

amostras de tecido dos pacientes foram obtidas a partir da UHN snap-congelados banco de tecidos após a aprovação pelo Conselho de Ética em Pesquisa UHN. Todos os tecidos foram coletadas dentro de 30 min de ressecção e congeladas em nitrogênio líquido, além de ser fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), e sua qualidade foi verificada por meio de histologia. Tecidos incluídos 63 cânceres colorretais primárias e 30 cânceres colorretais metastáticos. Os tumores metastáticos foram a partir de fígado (22 casos) e pulmão (8 casos) espécimes metastasectomia.

análise de mutação RASA1

de ADNc foi isolado a partir de linhas de células de tecidos do paciente como descrito acima a partir de ARN total.

RASA1

ADNc foi primeiro amplificado com 6 conjuntos de iniciadores para cobrir o comprimento do gene, e a sequenciação foi realizada em ADN amplificado com os mesmos iniciadores correspondentes, os quais são como se segue:

F1 – CTCAGCCTGGGGAGCTGAAGG

R1 – TGGAGGAGCGGTCAACGGTATG (pb 2-649)

F2 – GGCCTCGGGACAGTGGACGA

R2 – GGGCCTCACAAGAAAACTGCAGAC (pb 563-1252)

F3-AGGTGGGCCGGGAAGAAGATCC

R3-TCCAATCCTCTGCTTGTTCTGGAGT (pb 1131-1823)

F4-TGGCAGGCCAAACTGTTTTCAGA

R4-TGCTGGCCAGTAGTGTTCGGT (pb 1723-2381)

F5-CCGAACACTACTGGCCAGCATCC

R5 – TGACACCTTCCATGTAGGGCTCC (pb 2362-2987)

F6-CGACTCATCTGTCCTGCCATCCT

R6 – CTGGGGCGAAGGCTGCTACC (pb 2825-3277)

Para a amplificação PCR, 0,3 ul cada do para a frente e reverso iniciadores (50 uM) foram adicionados a 6 ul de ADNc (20 ng /ul), 12,5 ul de 2x Taq polimerase seleccione ADN, 0,2 ul de dNTPs 25 mM e água ultra-pura (Sigma-Aldrich) a um volume de 25 ul total para cada reacção. As condições dos ciclos foram: 95 ° C durante 10 min, seguido de 39 ciclos, com desnaturação a 95 ° C durante 45 “, hibridação a 64 ° C durante 45”, e extensão a 72 ° C durante 1 min, 10 minutos de incubação a 72 ° C, seguido por um 4 ° C. 5 ul de produtos de PCR foi verificado num gel de agarose a 2%. O produto de PCR foi limpo com ExoSAP-IT (Affymatrix, Santa Clara, CA).

Para validar sequenciação no ADN genómico, os mesmos métodos utilizados foram como acima, utilizando os seguintes iniciadores para amplificar o exão 16 e a sequência :

F – CGCTGCCAGTTGAGCCGATTACA

R – CTCTGGCATCATTGTGCTACTAAGC

real-Time RMN atividade GAP ensaio

domínio GTPase rotulados de RAS 1-171 foram expressas a partir pET15b vetores em

E. meios coli

em M9 suplementado com

15N cloreto de amónio e purificado por cromatografia de afinidade de Ni-NTA. His foram retirados por clivagem da trombina e GTPases monoméricas foram ainda purificados por cromatografia de filtração em gel (Superdex 75), [33] [32]. As amostras foram concentradas, e se necessário trocado para tampão de RMN (por exemplo, HEPES 25 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, MgCl 5 mM de

2, DTT 1 mM, e 10% de D

2O).

Para ensaiar a hidrólise de GTP intrínseca, uma amostra carregada a GTP foi preparado por incubação da proteína ras (~ 10 min a 37 ° C ou mais, à temperatura ambiente), na presença de 10-vezes em excesso molar e GTP 10 mM de EDTA [34 ]. Após a troca, MgCl

2 é adicionado a uma concentração final de 20 mM para estabilizar as sequências de nucleótidos recentemente ligado, e a amostra foi passada através de uma coluna de filtração em gel ou de dessalinização (PD MidiTrap ™ G-25 (GE Healthcare), equilibrada com RMN tampão para remover o excesso do nucleótido e a amostra eluída foi concentrada, em seguida, rapidamente e congelados rapidamente.

as células foram colhidas por raspagem em um volume mínimo (150 ul de uma placa de 10 cm) de tampão de lise, tal como descrito por Western blotting, em seguida clarificados por centrifugação rápida (16000 g durante 30 s) e a proteína celular total no sobrenadante foi analisada utilizando o reagente de ensaio de Bradford (BioRad) para padronizar a quantidade de proteína utilizada em cada ensaio. a concentração de 10-20 mg /mL proteínas totais no lisado foi alcançado e 35 ug em 3,5 ul foi adicionado ao fragmento de RAS purificada ligada a GTP.

a recolha de dados foi subsequentemente iniciada o mais rapidamente possível. as meias vidas de reacções foram inicialmente estimada através de inspecção visual dos espectros, em seguida, a fracção de ligada a GDP GTPase presente em cada ponto de tempo foi avaliado a partir de vários pares de picos e os dados foram ajustados a uma função de fase única exponencial decaimento para se obter as taxas de câmbio /hidrólise [35].

atividade RAS ensaio

as células foram privadas de soro durante 24 horas e depois ensaiadas para RAS ativas usando o kit de ativação RAS (Millipore) como indicado. Resumidamente, as células foram lisadas em tampão de lise 1x MLB e quantidades iguais de proteína foram misturadas com as RAS-domínio de ligação de RAF1 fundida com glutationa

S

-transferase e acoplado a esferas de glutationa-Sepharose. Depois de balanço, a 4 ° C durante 1 hora, as esferas foram lavadas no mesmo tampão de lise e ressuspensas em tampão de amostra 2x SDS. Western Blotting procedeu como descrito acima.

ensaio de tumorigenicidade subcutânea

Ética Declaração.

Todas as manipulações foram feitas para minimizar o sofrimento animal, de acordo com protocolos aprovados pelo Instituto de Câncer de Ontário (OCI) Comitê animal Care sob o uso de animais número de protocolo AUP 736,9.

Severe combinar imunodeficientes ratos (SCID) foram criados no local e obteve do Instituto Ontario Cancer (OCI, Toronto, oN). Um milhão de células foram injectados subcutaneamente na região do ombro direito de 4- a ratinhos SCID machos de 6 semanas de idade (n = 5-8 por linha celular). Uma vez que os tumores eram palpáveis ​​que foram medidos a cada 3 dias até que ponto final humano foi alcançado, o que foi ou quando os tumores atingiram 1,5 cm, ou quando se tornaram ulcerada ao ponto de sofrimento dos animais. O volume do tumor foi medido utilizando a fórmula (comprimento x largura

2) x π /6. Os ratos foram sacrificados utilizando CO

2, como aprovadas pelo Comitê Animal Care da OCI, os tumores foram retirados, e as porções eram ou congelados em nitrogênio líquido por DNA e proteína isolada ou fixados em formol para inclusão em parafina e coloração imuno-histoquímica. Para análise estatística, um modelo de efeitos mistos lineares (LME) foi usada para incorporar a elevada correlação que ocorre entre as medições efectuadas no mesmo rato. Todas as medições de volume de tumor foram transformadas de raiz quadrada para estabilizar a variância, e Wald valor de p foi usada para indicar significância.

Resultados

Perda de RasGAP leva à perda de RhoGAP fosforilação

Para aprofundar o estudo do papel da fosforilação RhoGAP em células DLD1, investigamos a sua interacção com RasGAP, um dos seus principais parceiros de ligação. Ao mesmo tempo, queríamos saber se a perda de mutante

KRAS

na linha de células derivada isogênico DKO4 teria um efeito sobre essa interação. Descobrimos que RhoGAP só poderia ser fosforilado em células DLD1, não em DKO4, enquanto que os níveis totais de RhoGAP permanecem inalterados. Esta co-imunoprecipitada com RasGAP RhoGAP fosforilada (Figura 1A). Além disso, descobrimos que a expressão de RasGAP não era detectável na linha celular DKO4 (Figura 1A). Tem sido relatado que RasGAP fosforilação ocorre frequentemente a jusante da tirosina-cinase do receptor de sinalização [18], [36], [37], [38], [39]. No entanto, verificou-se que a maior tirosina banda que aparece após a imunoprecipitação de RasGAP estava realmente em ~190 kDa, muito provavelmente representando RhoGAP (Figura 1A), indicando que a própria RasGAP não é altamente fosforilada nestas células fosforilada.

A) RhoGAP e RasGAP foram imunoprecipitadas a partir de células DLD1 e DKO4. Os imunoprecipitados foram sujeitos a Western blotting e sondadas para fosfotirosina totais, e RasGAP RhoGAP. Transferência Western de lisados ​​de células inteiras (A) e rt-QPCR (C) foram utilizados para determinar a proteína total e os níveis de ARNm, respectivamente, nestas linhas celulares.

RasGAP expressão é perdido em células DKO4

Verificou-se que, enquanto a linha celular expressa DKO4 pouca ou nenhuma proteína RasGAP comparação com DLD1, os níveis de ARNm de

RASA1

gene manteve-se em 50% da linha celular parental (Figura 1, B C). Foi realizada matrizes SNP para examinar possíveis alterações no número de cópias entre estes pares de células isogênicos. Encontrámos uma diferença muito pequena entre as duas linhas de células (dados não apresentados). Um resultado semelhante foi recentemente encontrado em uma série de clones alternativos (DKO3 e DKO1) derivados do modelo DLD1 [40]. É importante ressaltar que há diferenças no número de cópias foram vistos no cromossomo 5q13.3, mostrando que a diminuição no nível de mRNA em DKO4 não é devido à perda cromossômica.

RasGAP mutação no CRC

Em seguida, olhou para mutações que poderiam explicar as diferenças no nível de expressão RasGAP. Nós sequenciado tanto o ADN genómico e ADNc a partir de células de DLD1 e DKO4. Encontramos um ponto de mutação heterozigótica no DNA genômico de ambas as linhas celulares. Este C T transição é uma mutação sem sentido, que codifica para uma alteração R709 * (Figura 2, A B), situado entre os domínios C2 e RasGAP de RasGAP. Se o gene mutado foi traduzido numa proteína truncada, uma banda kDa ~77 deveria ter sido detectável em transferências de Western, utilizando um anticorpo que reconhece RasGAP a porção N-terminal da proteína. No entanto, nós não ver uma banda desse porte em quaisquer condições celulares.

A) Cromatograma mostrando intensidades relativas de cada par de bases após seqüenciamento Sanger, tanto no cDNA genômica e derivados de linhas celulares. B) Ilustração da localização da mutação ao nível da proteína RasGAP. dados de C) Expressão RASA1 derivadas de todas as linhas celulares na linha celular de cancro do Instituto Broad Encyclopedia. Barras representam a média.

Curiosamente, a sequenciação de ADNc nas linhas celulares DLD1 e DKO4 mostraram que a linha celular DLD1 tinha perdido quase completamente a expressão do gene mutado, expressando apenas o de tipo selvagem, enquanto que o DKO4 linha de células manteve 50% de cada um dos do tipo selvagem e mutante

RASA1

produto do gene (Figura 2A).

Nós procuramos a presença da mutação C2330T em tumores e metástases tecidos primários de pacientes com CCR, mas foram incapazes de identificar essa mutação em qualquer um dos nossos exemplos. No entanto, fomos capazes de encontrar essa mutação em três linhas de células da linha celular Broad Cancer Institute Encyclopedia (https://www.broadinstitute.org/ccle) [41]: as linhas celulares de cancro colorectal HRT18 e HCT15, bem como a urinária linha celular de cancro do tracto 639 V. Isto implica que, embora a mutação é rara, que está presente em certos tipos de cancro. Esta mutação também não é encontrada na base de dados de SNP humano, o que implica que não é encontrada na população em geral.

Para investigar ainda mais a nossa hipótese de que o mutante

RASA1

transcrição é instável e possivelmente degradada, compararam-se os níveis de expressão de mRNA

RASA1

nas três linhas de células que contêm a mutação C2330T para o restante das linhas celulares de cancro na linha celular Enciclopédia. Estas linhas celulares expressam três significativamente menor

RASA1

do que a maioria de outras linhas de células de cancro no banco de dados (Figura 2C). Embora não seja conclusivo, isto parece indicar que esta mutação truncando pode resultar na expressão do gene mRNA diminuída.

Estas descobertas sugerem vários níveis de regulação da RasGAP, todos possivelmente como resultado da perda de KRAS ativos em DKO4. Em primeiro lugar, a falta completa de ARNm p120RasGAP mutante na linha celular DLD1 como detectado por sequenciação indica que o alelo mutante não está a ser transcrito em mRNA nesta linha de células, ou que o mRNA mutante é muito instável e degrada imediatamente após serem transcritas. Curiosamente, embora o ARNm mutante estava presente na linha celular DKO4, a diminuição de 50% no total

RASA1

níveis de mRNA como detectado por qPCR em tempo real sugerem que este mRNA mutante é também degradado, mas possivelmente não o mais rapidamente ou de forma tão eficiente como no DLD1

ao todo, afigura-se que a perda de KRAS activas em DKO4 diminui a pressão sobre a célula para estabilizar a expressão RasGAP, tanto ao nível das proteínas e ARNm.; no entanto, o mecanismo pelo qual os níveis de proteína de RasGAP são regulados nestas linhas celulares no ainda desconhecido.

Regulação da expressão de mRNA RasGAP por KRAS mutante

Para esclarecer o papel que a perda de mutante

KRAS

em DKO4 desempenha na expressão de RasGAP, nós estavelmente overexpressed o pBabepuro (PBP) vector vazio, vector contendo o comprimento do tipo selvagem completa

KRAS

, ou vector contendo

KRAS

com mutações pontuais no códon 12 (G12V ou G12D) ou códon 13 (G13D), em células DKO4. Colocámos a hipótese de que a mutação G13D teria o maior efeito na estabilização e resgate de expressão RasGAP em DKO4, devido a esta mutação sendo aquela que originalmente ocorreu nesta linha celular. No entanto, após repetidas tentativas, nós só foram capazes de sobre-expressar o

KRAS

G12V gene mutante nesta linha celular (Figura 3A). A sobre-expressão de G12V foi acompanhada por um aumento global no GTP-KRAS, como esperado (Figura 3C). Curiosamente, a transfecção transiente de construções mostraram que estes KRAS foi capaz de ser sobre-expresso até 7 dias após a transfecção com todos os mutantes, indicando que a expressão de longo prazo de KRAS constrói diferente de G12V não se mantiveram em DKO4. Superexpressão de

KRAS

G12V causou um aumento significativo no

RASA1

mRNA; No entanto, este aumento não foi observado com o nível de proteína (Figura 3, B C). Curiosamente, embora não poderíamos detectar qualquer

KRAS

superexpressão com o mutante G13D, ainda observou um ligeiro aumento no

RASA1

expressão de mRNA, embora não foi significativa (p = 0,074).

do tipo selvagem (WT) ou KRAS mutante foi sobre-expressos em células DKO4. ARNm foi extraído a partir de células e quantificado utilizando RT-qPCR para medir KRAS (A) ou RASA1 (B). C) transferência de Western que mostra os níveis destas proteínas, juntamente com o estado de activação de KRAS. Correlação de mRNA (D) e expressão da proteína usando a análise de densitometria of Western blot (E) de KRAS e RASA1 após knockdown de KRAS utilizando 11 shRNAs diferentes. Para correlação de proteínas, foram excluídos valores atípicos mais de 3 desvios padrão da média. Todos quantificação é relativo ao vector vazio. A análise estatística de expressão utilizando teste t não emparelhado, *** p 0,001, * p 0,05

células DLD1 Para sondar adicionalmente o papel de KRAS activas na expressão RasGAP, que transitoriamente transfectadas com 11. shRNAs separadas contra

KRAS

. Encontramos uma correlação significativa entre a quantidade de

KRAS

knockdown ea diminuição da

RASA1

expressão de mRNA em relação ao controle shRNA não específica (Figura 3D). No entanto, estas alterações não foram observados no nível de proteína (Figura 3E). Para garantir que KRAS shRNA knockdown causou quaisquer mudanças significativas em genes não-específicas, Figura S1A mostra os níveis de dois genes de limpeza que não são afetados pela knockdown. Figura S1B mostra as manchas de Western de que Figura 3E foi derivados.

Em conjunto, estes resultados sugerem que a perda de KRAS activo desempenhado um papel parcial na estabilidade e /ou a expressão de

RASA1

ARNm, embora os mecanismos adicionais estão presentes que regulam a expressão da proteína nesta linha celular.

RasGAP actividade superexpressão salvamentos RasGAP

para determinar se algum dos fenótipos atribuídas à perda de KRAS activas na célula isogénica DLD1 linhas pode ser explicado pela perda de expressão da proteína RasGAP, que sobre-expresso RasGAP na linha celular DKO4 (Figura 4A). Apesar de a nossa capacidade para obter . 100 vezes a sobre-expressão de ARNm de RasGAP na linha celular DKO4, os níveis de proteína resultantes foram semelhantes para expressão endógena em células DLD1 (Figura 4D)

A) a expressão de ARNm de RasGAP após sobre-expressão DKO4 em células em comparação com o controlo de vector de GFP. B) A análise de RMN em tempo real da actividade RasGAP, que mostra a taxa de hidrólise de GTP (B) e actividade ao longo do tempo significa GAP (C). Cada curva em (C) é derivado a partir de uma única experiência representativa. As barras de erro em (B) indicam o erro padrão da média (SEM). D) ensaio da atividade RAS mostrando níveis de KRAS activo após RasGAP superexpressão. Os números indicam valores de densitometria deste blot, que é representativa de três réplicas biológicas. E) RhoGAP foi imunoprecipitada a partir de linhas celulares, submetido a Western blot, então sondado para fosfotirosina total RasGAP e RhoGAP.

Para determinar se a superexpressão de RasGAP teve qualquer efeito sobre a atividade KRAS, um ensaio de actividade RAS foi realizada, utilizando esferas de agarose Raf-RBD-ligadas para imunoprecipitar KRAS activa (Figura 4D). Tal como foi mostrado anteriormente [40], KRAS global foi menos activo nas células DKO4 em comparação com as células DLD1. Nós vimos uma diminuição ligeira, mas significativa na actividade KRAS em células DKO4 depois

RasGAP

superexpressão, indicando que RasGAP é capaz de regular o tipo selvagem KRAS em DKO4. Para esclarecer melhor o papel dos RasGAP nestas células, utilizou-se um ensaio à base de RMN em tempo real para determinar a actividade RasGAP. Descobrimos que os níveis de atividade RasGAP foram concordantes com a expressão da proteína RasGAP (Figura 4, B C). Extratos de células DLD1 acelerada hidrólise RAS GTP ~1.8 vezes, enquanto extratos DKO4, pareados por conteúdo de proteína total provocou uma modesta 1.2 aumento da taxa de hidrólise vezes. Estes resultados eram consistentes com a presença de actividade basal de outros RasGAPs. RasGAP superexpressão em DKO4 levantou esta taxa de volta para ~1.8 vezes.