Abstract

inibidor tecidual de metaloproteinase-4 (TIMP-4) é um membro da matriz extracelular (ECM) inibidores de metaloproteinases que tem pleiotropic funções. No entanto, o TIMP-4 papéis na carcinogénese não são bem compreendidos. A viabilidade celular e citometria de fluxo ensaios foram utilizados para avaliar as diferenças de morte celular entre H-vetor e linhas de células H-TIMP-4. Imunoblotting e semi-quantitativo de RT-PCR foram utilizados para avaliar a expressão de reguladores de apoptose. Nós mostramos que TIMP-4 tem efeitos sensibilizadores de apoptose para vários estímulos de morte. Consistente com estes resultados, os reguladores de apoptose a partir de inibidores de apoptose Proteínas (IAP), inibidores de proteínas FLICE-like (FLIP) e membros da família Bcl-2 foram modulados por TIMP-4. Além disso, o TIMP-4 knockdown resultou em aumento de sobrevivência celular após privação de soro, tal como avaliado por análise de células clonogénicas. Este relatório mostra que TIMP-4 regula a carcinogênese através da ativação da apoptose em células de cancro do colo do útero. Compreender TIMP-4 efeitos em tumorigênese podem fornecer pistas para futuras terapias

Citation:. Lizarraga F, Ceballos-Cancino G, Espinosa M, Vazquez-Santillan K, Maldonado V, Melendez-Zajgla J (2015) Tissue Inhibitor da metaloproteinase-4 desencadeia a apoptose em células de cancro do colo do útero. PLoS ONE 10 (8): e0135929. doi: 10.1371 /journal.pone.0135929

editor: Qing-Xiang Amy Sang, da Universidade do Estado da Flórida, Estados Unidos

Recebido: 05 de fevereiro de 2015; Aceito: 28 de julho de 2015; Publicação: 20 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lizarraga et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Grants 1616519, 87.855, conacyt.mx. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a apoptose representa um tipo conservado de morte celular que é desregulamentado no cancro. Dois principais vias de sinalização desencadear a apoptose em células de mamíferos [1]. A via extrínseca liga os estímulos de morte exteriores na maquinaria apoptótica intracelular. A estimulação de receptores de morte celular por ligandos de morte desencadeia a formação da morte induzir sinalização complexo (DISCO) [2]. Em primeiro lugar, no lado citoplasmático de TNFR1, a formação de um complexo de proteína composto por TRADD, TRAF2, cIAP-1 e RIP-cinase tem lugar, com o nome Complexo I. Este complexo, em seguida, recruta e activa a IKK-quinases que fosforilam, por sua vez inibidores de IkB e permitir induzida por NFkB sobrevivência celular. Subsequentemente, a TRADD pode dissociar-se TNFR1, o que leva à formação de complexo II através da ligação de FADD e caspase-8, finalmente, provocando a morte celular. Neste modelo, Complexo I ou Complexo de ativação II depende FLIP (FLICE-como inibidor de proteínas) [3]. Por outro lado, há a via intrínseca, onde estímulos apoptóticos desencadear a libertação de proteínas espaço inter-membranas mitocondriais (tal como o citocromo c) para o citosol. Citocromo c promove a activação de caspases através da formação de um complexo de proteína composta de citocromo c, Apaf-1, e caspase-9, que conduz à activação de uma cascata de caspases. A apoptose é rigorosamente controlada por um certo número de moduladores em diferentes níveis. Entre as suas principais reguladores são o inibidor da via do receptor de morte cFLIP (FLIP celular), a proteína inibidora de apoptose (IAP) de família, e Bcl-2 membros da família [4].

A família TIMP é composta de quatro pleiotrópico proteínas que modulam a actividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) [5]. Como tal, TIMP têm sido associados com o desenvolvimento do cancro; No entanto, estas proteínas mostram diferentes e por vezes opostas papéis nos processos celulares, tais como activação de MMP, apoptose, proliferação e invasão celular [6]. TIMP-4 aumento da expressão está associado com o carcinoma mamário humano [7], carcinoma do endométrio [8], e cancro gástrico [9], enquanto que a sua expressão é diminuída em gliomas humanos [10] e em tumores Wilms’ [11]. Nosso trabalho anterior mostrou que TIMP-4 é expresso

de novo

no cancro do colo do útero com níveis aumentados em estágios mais avançados [12]. Estes dados sugerem uma participação complexo de TIMP-4 no desenvolvimento do cancro.

resistência a morte celular ocorre como uma consequência do desequilíbrio entre pro- e anti-apoptóticas factores que em última análise, responder à acumulação de mutações de ADN, e determinar a resposta de células de tumor à terapia [13]. TIMPs são conhecidos os reguladores de apoptose em células cancerosas [6]. TIMP-3 actua como um potente indutor de morte celular em células cancerosas, principalmente por promover a estabilização de receptores de morte [14]. Em contraste, o TIMP-1 e TIMP-2 tem um efeito protector contra a apoptose induzida por estímulos diferentes [15]. Além disso, o TIMP-4 pode induzir a apoptose em células vasculares lisas [16] e fibroblastos cardíacos transformadas [17], embora, paradoxalmente, também tem sido demonstrado este factor para proteger as células de cancro da mama a partir de apoptose [7], implicando um efeito específico de tecido . No entanto, tem sido descrito nenhum mecanismo para os efeitos do TIMP-4 sobre a morte celular.

No presente relatório, observamos que TIMP-4-regulação sensibiliza células cancerosas do colo do útero para a apoptose através da modulação de proteínas apoptóticas do IAP, FLIP e Bcl-2 famílias. Estes resultados revelam novos alvos terapêuticos no câncer do colo do útero que levam em conta as propriedades multifuncionais de TIMPs

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

hrTIMP-4 (No. 974. -tsf) e TNF-α (210-TA) eram de R D Systems (Minneapolis, MN, USA). Caspase-8 (N ° 9746), os anticorpos da Caspase-3 (N ° 9661) e caspase-9 (n ° 9501) foram de Cell Signaling (EUA). anticorpo FLIP era de Upstate (No. 06-697, Merck Millipore KGaA, Darmstadt, Alemanha). Mcl-1 de anticorpo foi de Millipore (No. AB9260). Bcl-2 (n ° PC-6820UG), anticorpos Bax (No.AM-04-20UG), Bak (No. AM03-20UG), PARP (n ° PC-100-100UG) eram da Calbiochem (Merck KGaA, Darmstadt , Alemanha). Bid (No. sc-6538), β-actina (No. sc-130656), TNF-RI (No. sc-1070), TNF-RII (No. sc-1074), TRAF2 (No. SC-876) e anticorpos TRADD (No. sc-1163) eram de Santa Cruz Biotechnologies (Dallas, Texas, EUA).

Clonagem Expressão, cultura de células e estável transfecção

Human TIMP-4 leitura aberta quadro foi obtido a partir de linha de células CaSki. Os seguintes iniciadores foram utilizados; senso: 5 ‘GCGGAAGCTTCCCAGCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3’ e anti-sentido: 5 ‘CTCCCGAATTCGGCTGAACGATGTCAACAAACTCTTTCC 3’. Este fragmento amplificado foi clonado no vector pLXSN (Clontech, Mountain View, CA, EUA). O novo vector foi denominado pLXSN-TIMP-4.

A linha de células HeLa cancro cervical foi transfectada com pLXSN e pLXSN-TIMP-4 e seleccionado com 800 ug /ml de G418 durante 4 semanas para criar linhas celulares estáveis. As linhas de células são daqui em diante chamado H-Vector (pLXSN) e H-TIMP-4 (pLXSN-TIMP-4) e foram cultivadas em DMEM. linha de células de câncer cervical CaSki foi cultivada em DMEM.

sensibilidade da droga

2×10

4 H-vetor e H-TIMP-4 células foram semeadas em 24 pratos bem câmara. Após 24 células h foram lavadas com meio sem FBS (Soro Fetal Bovino) e incubadas com TNF-α (10 ng /mL, Sigma-Aldrich, N ° T6674) ou TRAIL (20 ng /ml, R D Systems, Nº 375-TL-010) para os tempos indicados. As células foram então incubadas com MTT (Promega, No. G1111) durante 3 horas e a viabilidade celular foi avaliada como descrito anteriormente [18].

ensaios de privação de soro

2×10

4 H -vector células e H-TIMP-4 foram semeadas numa placa de 24 poços e cultivadas em FBS a concentração indicada durante 5 dias. Independentemente, 1×10

4 células CaSki foram semeadas em placa de 24 poços e cultivadas com ou sem hrTIMP-4 (10 nM) durante 48 h em DMEM com FBS a 8%. Em seguida, as células CaSki foram desenvolvidas com 3% de FBS durante 6 dias, com ou sem hrTIMP-4. As células foram fixadas com etanol a 70% e coradas com violeta de cristal. A mancha foi solubilizado com ácido acético a 33% e a absorvância foi medida num leitor de ELISA a 570 nm. triplicados biológicos foram analisados ​​para cada conjunto de experiências.

TIMP-4 Knockdown

Dois shRNAs (GAATCACAGCCCTCAGTTT, CCATCACATCCCTTCAAGA) foram concebidos com Selector do RNAi alvo Sequence (Clontech, Mountain View, CA, EUA ). oligonucleótidos de cadeia dupla que corresponde a estes shRNA foram clonados no vector pSIREN-RetroQ acordo com o procedimento do fabricante (pSIREN-RetroQ ARNi-Ready Vector, Cat. No. 631526, Clontech). Um shRNA contra luciferase foi usado como um controlo. As células HeLa foram transfectadas com pSiren-Luc (shRNA controle), cada plasmídeos pSiren-TIMP4 separadamente ou pSiren-TIMP-4 plasmídeos em conjunto e seleccionadas com 1 ug /mL de puromicina para 2 semanas. linhas de células estáveis ​​que são daqui em diante chamado de H-Luc (pSiren-Luc) e H-PS-TIMP-4 (pSiren-TIMP-4). knockdown TIMP4 foi verificada por meio de PCR em tempo real.

ensaios de sobrevivência

5×10

3 H-Luc e as células H-PS-TIMP-4 foram semeadas numa placa de 24 poços e soro -deprived durante 7 dias. Colónias foram fixadas com etanol 70%, coradas com violeta de cristal, e quantificados de acordo com Guzman e colaboradores [19]. triplicados biológicos foram analisados ​​para cada conjunto de experiências.

A citometria de fluxo

H-vetor e H-TIMP-4 células foram analisadas para a coloração de anexina V-FITC de acordo com o protocolo do fabricante (BD Pharmingen) .

extracção de proteínas e imunotransferência

mitocondrial foram obtidos e extractos de proteínas solúveis como previamente descrito [20, 21]. quantidades iguais de proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF (Amersham) bloqueados, incubados com anticorpos específicos, lavadas, e incubadas com os anticorpos secundários anti-IgG-HRP, como descrito anteriormente [22]. Para extractos de proteínas solúveis carga igual foi verificada através da realização de análise de densitometria de géis paralelas corados com Coomassie azul brilhante.

A análise estatística

As análises estatísticas foram feitas com Statistica e Intercooled Stata versão 7.0 (TX, EUA ) softwares. Os testes são indicados para cada experimento. A significância estatística foi assumida quando

p

valor foi 0,05.

Resultados

TIMP-4 sensibiliza células cancerosas do colo do útero para apoptótica morte celular

Os trabalhos anteriores mostraram que TIMP-4 regula negativamente o crescimento de células tumorais diversas [11 , 16, 17]. Para analisar se TIMP-4 também regula a morte celular em células de câncer do colo do útero, geramos uma linhagem de células HeLa que super-expressa de forma estável (Fig 1A, adiante denominado H-TIMP-4) TIMP-4 e linha celular de controlo (doravante denominado H-Vector) . Nós estudamos o efeito da privação de soro em H-vetor e linhas de células H-TIMP-4. Embora não foram observadas diferenças no número de células cultivadas em meio suplementado com soro de 8%, foram observadas poucas células H-TIMP-4 quando o soro estava ausente da forma (Fig 1B). Em seguida, para testar se estes efeitos foram restringidos ao factor de crescimento de fome, avaliou-se factores de morte celular a partir da família do TNF, bem. Após a exposição à morte ligandos TNF-α e TRAIL, houve menos H-TIMP-4 células viáveis ​​do que as células H-vetor (Figura 1C). Para confirmar ainda mais estes resultados, as células HeLa de tipo selvagem foram tratadas com hrTIMP-4 na presença ou ausência de TNF-α e TRAIL. Verificou-se que a exposição a hrTIMP-4 sozinho reduziu a viabilidade das células HeLa e potenciados os efeitos de TRAIL e TNF-α (Figura 1D e 1E, respectivamente).

A, TIMP-4 Análise da expressão por RT-PCR em H-Vector e células H-TIMP-4. B, O gráfico mostra as percentagens de viabilidade celular H-H-Vector e TIMP-4 seguintes crescimento com FBS (8%) ou sem FBS (0%) durante 5 dias. C, O gráfico mostra as percentagens de viabilidade celular H-vetor e H-TIMP-4 depois de TNF-α e TRAIL (20 ng /mL, 7 h) tratamento (mL, 48 h /20 ng). D, O gráfico mostra a viabilidade das células HeLa analisados ​​após hrTIMP-4 (10 nM, 48 h) e TRAIL (20 ng /mL, 7 h) de exposição. E, O gráfico mostra a viabilidade das células HeLa após um período de pré-incubação de 48 h com hrTIMP-4 (10 nM), seguido de estimulação de TNF-α (20 ng /mL, 48 h). Os asteriscos indicam diferenças significativas com valores de p = 0,03 em A, P = 0,006 em C e p = 0,003 em D e E.

A linha celular H-TIMP-4 também apresentou um número maior de corpos apoptóticos (Fig 2A). Para explorar este tipo de morte celular em pormenor, analisou-se a translocação de fosfatidilserina a partir do interior para o lado exterior da membrana plasmática (marcador de apoptose precoce) por citometria de fluxo após privação de soro e tratamento TNF-α. Detectamos uma maior proporção de H-TIMP-4 células que foram positivas para fosfatidilserina membrana plasmática externa em comparação com células H-vetor (Tabela 1).

A, H-vetor e H TIMP-4 linhas celulares foram incubadas com ou sem TRAIL (20 ng /ml, 7 h). As células foram observadas por microscopia de campo brilhante. fragmentos B, ativação da caspase-9 e clivagem PARP foram examinadas por Western blot de H-Vector e H-TIMP-4 extratos de proteína celular em cima FBS fome. imunotransferência de p-actina foi utilizado como controlo de carga. C, caspase-8 e caspase-3 clivada foi analisado por western blot em H-vector e células H-TIMP-4 mediante tratamento do TNF-α. coloração de gel Coomassie foi utilizado como controle de carga. D, O gráfico mostra porcentagens de viabilidade de células CaSki cultivadas com FBS 3% para 6 dias em conjunto com ou sem hrTIMP-4 (10 nM) (asteriscos indicam diferenças significativas com valores de p = 0,0114, un-teste t pareado com correção de Welch ).

TIMP-4 knockdown aumenta sobrevivência de células HeLa

a fim de validar nossos dados anteriores, dois shRNAs 4 específicas TIMP-foram utilizados para inibir a sua expressão em células HeLa. O melhor TIMP-4 knockdown em células HeLa foi conseguida por uma piscina do shRNAs (42% de inibição em comparação com células de controlo H-Luc, conforme avaliado por qPCR) específico dois TIMP-4. Surpreendentemente, a sobrevivência celular foi aumentada em H pS TIMP-4-células em comparação com células de controlo H-Luc após 7 dias de inanição de FBS (Fig S1).

TIMP-4 modula a activação de caspase

Porque uma cascata de caspases é responsável pela execução de morte celular por apoptose, avaliou-se a activação de caspase por western blotting. Como mostrado na Fig 2B, verificou-se que a clivagem induzida por privação de soro de caspase-9-H em células de controlo e H-TIMP-4. Além disso, observou-se a clivagem de PARP, um marcador de activação de caspase utilizada. Quantidades mais elevadas de caspase-3 clivada e caspase-8, que são responsáveis ​​pela via de transdução após a ligação de receptor de morte, foram encontrados em H-4 TIMP-células tratadas com TNF-α (Fig 2C). Além disso, os efeitos de TIMP-4 não eram restritas à linhagem de células HeLa, uma vez que a exposição de células CaSki para hrTIMP-4 também potenciou a actividade citotóxica da privação de soro (Figura 2D). Estes resultados suportam a noção de que TIMP-4 tem efeitos sensibilizadores de apoptose em células de cancro cervical.

TIMP-4 regula inibidores de apoptose do IAP, cFLIP e Bcl-2 famílias

Muitos transdução de sinal vias são necessários para morte celular de apoptose. Ao nível dos receptores de morte celular, proteínas FLIP regular a apoptose. Curiosamente, a expressão do ARNm para a isoforma FLIP S era inferior em células HeLa após o tratamento hrTIMP-4. Consistente com este achado, TIMP-4 superexpressão inibido FLIP isoforma

expressão da proteína S a níveis indetectáveis ​​(Fig 3A). Em contraste, H-TIMP-4 células apresentaram maiores níveis CIAP-1 e cIAP-2 mRNA, enquanto a expressão survivin não foi modificado (Fig 3B).

A, A acumulação de mRNA ‘isoformas FLIP foi analisado por RT -PCR em células HeLa tratadas com hrTIMP-4 (10 nm, painéis superiores) durante o tempo indicado. FLIP expressão da proteína foi determinada por imunotransf erência em H-vector e linhas celulares H-TIMP-4 (painéis inferiores). B, cIAP-1, cIAP-2 e ARNm de survivina presença foram examinadas por semi-quantitativo de RT-PCR em H-vector e linhas celulares H-TIMP-4.

Após a activação a montante de caspases iniciadoras, mitocôndrias libertar vários factores apoptóticos em um processo controlado pela família de proteínas Bcl-2 [23]. Como mostrado na Fig 4A, as células H-TIMP-4 demonstraram menores níveis de Bcl-2 e de Mcl-1, que são ambos os membros anti-apoptóticos da família Bcl-2. Além disso, também foi observada maior expressão de proteínas pró-apoptóticas lance e Bax em células H-TIMP-4. Estas diferenças foram reflectido em mitocôndrias isoladas, em que uma diminuição na expressão de Bcl-2 em células que sobre-expressam foi observada TIMP-4, bem como um aumento em Bak mitocondrial associada (Fig 4B).

família Bcl-2 os membros foram avaliados por imunotransferência em citosólica (a) e mitocondrial (B) H-vector e os lisados ​​celulares H-TIMP-4. anticorpos anti-actina e Mit foram empregues respectivamente como controlos de carga.

Recentemente, tem sido mostrado que o TIMP-3, um potente indutor da apoptose, promove a morte de células de melanoma através da estabilização de receptores de morte e consequente activação da sua cascata de sinalização apoptótica através de caspase-8 [14]. Uma vez que observamos a caspase-8 produtos de clivagem em H-TIMP-4 células após estimulação de TNF-α (Figura 2C), avaliou-se os níveis de proteína de TNFRI, RII, e a componentes DISC TRAF2 e TRADD. Como mostrado na Fig 5A, observou-se uma diminuição na TNFRI, TRADD, e os níveis de proteína TRAF2 em células H-TIMP-4, enquanto que os níveis de TNFRII ficaram inalterados. Em conjunto, esses resultados mostraram que TIMP-4 sensibiliza células HeLa à apoptose

in vitro

alterando o equilíbrio de jogadores apoptóticos chave no suporte de morte celular.

A, TIMP-4 modula TNFRI, TNFRII e DISC componentes TRAF2 e TRADD. As proteínas foram detectadas por immunoblot em H-Vector e H-TIMP-4 extratos de proteínas das células.

Discussão

TIMPs são proteínas pleiotrópicos que modulam a proliferação celular, apoptose, atividade MMP, celular invasão e na angiogénese durante o desenvolvimento do tumor [6]. No entanto, a participação de TIMP-4 na carcinogénese foi examinada apenas alguns tipos de tecido.

Para complicar este cenário, o TIMP-4 também demonstra actividades reguladoras da apoptose, que são específicos para cada tipo celular. Enquanto TIMP-4 inibe a apoptose espontânea [7], também potência a apoptose em fibroblastos cardíacos e células do músculo liso vascular [16, 17]. Semelhante aos resultados anteriores, na presente pesquisa que mostrou que TIMP-4 sensibiliza células cancerosas do colo do útero à morte

in vitro

.

Foi observada a capacidade impressionante de TIMP-4 para aumentar a apoptose em cervical linhas celulares de cancro após ligando de receptor de morte (TNF-α e TRAIL) tratamento e privação de soro. Em conformidade, mostramos que TIMP-4 knockdown aumenta HeLa células sobrevivência após a privação de soro. Tummalapalli

et al

., Relatou que TIMP-4 apoptose induzida em fibroblastos cardíacos transformadas [17], indicando um potencial papel protector contra a carcinogênese em órgãos que expressam essa molécula. Uma vez que o TIMP-4 paradoxalmente protege outros tipos de células da apoptose [7, 24] (Tabela 2), um efeito específico de tecido e uma subpopulação pode ser inferida, o que pode ser causado pelas relações complexas deste inibidor com outras proteínas, como mostrado em

in vitro

estudos [25].

O nosso relatório anterior demonstrou que, em pacientes com cancro do colo do útero, TIMP-4 expressão aumenta em estádios clínicos mais avançados [12]. Porque TIMP-4 pode afetar a sensibilidade das células cancerosas à quimioterapia, como sugerido pelo nosso trabalho presente, seria atraente para realizar estudos adicionais para investigar se os pacientes que expressam níveis mais elevados deste inibidor ter uma melhor ou pior prognóstico.

Para obter mais conhecimentos sobre como TIMP-4 exerce actividades indutora de morte celular, foi investigado se o TIMP-4 modulada a expressão de vários moduladores de apoptose. De fato, observamos que TIMP-4 diminuiu os níveis de FLIP

S, cIAP-1, cIAP-2, Bcl-2, Mcl-1, Bid, e Bak. Alterações na expressão CIAPS pode ser uma consequência do aumento de TNF-α e activação de NFkB, como verificou-se que o TIMP-4 aumenta os níveis solúveis deste ligando de receptor de morte (Lizarraga

et ai.,

inédita

dados).

de acordo com nossos resultados, trabalho anterior mostrou que TIMP-4 regula de expressão de proteínas Bcl-2 em um modelo do rato do cancro da mama [7]. Curiosamente, também descobriram que as células de TIMP-4-sobre-expressam caspase-8 activada mediante tratamento TNF-α. Isso pode ter sido causado pela marcado para baixo-regulação da FLIP

S, uma isoforma da família FLIP. FLIP

S, uma proteína anti-apoptótica com uma estrutura semelhante a caspase-8, não possui actividade catalítica e, portanto, tem a capacidade de bloquear a transdução de sinal a partir de vários receptores de morte [26]. No caso de TNF-α, a relação entre a aleta e a caspase-8 na DISCO determina o destino celular [3]. A este respeito, observou-se que as células H-TIMP-4 expressa níveis inferiores das proteínas TRAF2 e TRADD. No total, nossos dados sugerem que TIMP-4 modula proteínas disco e expressão FLIP, o que pode resultar em aumento da caspase-8 ativação e morte celular [27].

Em conclusão, o presente trabalho demonstra que TIMP-4 exibe um papel apoptose sensibilizante anti-tumorigénico em células de câncer cervical. Mais estudos são necessários para determinar o fator (s) que determinam o equilíbrio entre o TIMP-4 actividades pleiotrópicas. No entanto, os nossos resultados podem influenciar a concepção de futuras abordagens terapêuticas que levem em conta os múltiplos papéis dos TIMPs em câncer.

Informações de Apoio

S1 Fig. TIMP-4 inibição aumenta a sobrevivência das células

O gráfico mostra os H-Luc e células H-PS-TIMP-4 percentagens suvival após um crescimento sem FBS durante 7 dias, em três experimentos independentes

doi:.. 10.1371 /revista. pone.0135929.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Julio Pérez-Carreón (INMEGEN) por sua ajuda na aquisição de imagem e biólogo molecular Paulina Sanchez de revisão gentilmente o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão 161.619 de CONACyT a JM-Z.