Abstract

Purpose

leucócitos níveis globais de metilação do DNA estão actualmente a ser considerados como biomarcadores de suscetibilidade ao câncer e têm sido associados com o risco de diversos cânceres. Neste estudo, o objetivo foi examinar a associação entre elementos nucleares de longo intercalados (Linha-1), os níveis de metilação, como biomarcador de metilação do DNA global em DNA de células do sangue, eo risco de câncer de células renais.

Experimental Design

lINE-1 metilação do DNA genômico convertido pelo bissulfito isolado de leucócitos foi quantificada por pyrosequencing medido em triplicado, e na média entre 4 locais CpG. Foram avaliados um total de 328 casos de CCR e 654 controles de frequência correspondida (02:01) na idade (± 5 anos), sexo e centro de estudo, a partir de um grande estudo de caso-controle conduzido na Europa Central e Oriental.

resultados de

linha-1 níveis de metilação foram significativamente maiores nos casos de CCR, com mediana de 81,97% (intervalo interquartil [IQR]: 80,84-83,47) em comparação com 81,67% (IQR: 80,35-83,03) entre os controles ( p = 0,003, Wilcoxon). Comparado com a linha mais baixa 1-quartil metilação (Q1), o OR para aumento dos quartis de metilação foram como se segue: OU (Q2) = 1,84 (1,20-2,81), OU (Q3) = 1,72 (1,11-2,65) e OR ( Q4) = 2,06 (1,34-3,17), com um p-tendência = 0,004. A associação foi mais forte entre os fumantes atuais (p-tendência 0,001) do que antigos ou nunca fumaram (p-interação = 0,03). Para eliminar a possibilidade de viés de seleção entre os controles, a relação entre LINE-1 metilação e tabagismo foi avaliado e confirmado em uma análise caso a única, também.

Conclusões

Níveis mais altos de LINHA -1 metilação parecem estar positivamente associado com o risco de RCC, especialmente entre os fumantes atuais. Novas investigações usando DNA tanto pós e pré-diagnóstico genômico é garantido para confirmar os resultados e será necessário determinar se as diferenças observadas ocorrer antes, ou como resultado da carcinogênese

Citation:. Liao LM, Brennan P, van Bemmel DM, Zaridze D, Matveev V, Janout V, et al. (2011) Níveis de LINE-1 de metilação no DNA dos leucócitos eo risco de câncer de células renais. PLoS ONE 6 (11): e27361. doi: 10.1371 /journal.pone.0027361

editor: Bernard W. Futscher, da Universidade do Arizona, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de junho de 2011; Aceito: 14 de outubro de 2011; Publicação: 04 de novembro de 2011

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Divisão de Cancer Epidemiology and Genetics (Bethesda , MD, EUA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Região específica hipermetilação e hipometilação global DNA estão associadas a carcinogênese [1]. hipermetilação aberrante de DNA tende a ocorrer em regiões do promotor rica em CpG e está associado com o silenciamento transcricional de genes, tais como genes supressores de tumor [2]. Em contraste, a hipometilação do ADN do genoma ocorre principalmente em sequências repetitivas de ADN, tais como as regiões de heterocromatina e retrotransposões [3]. Vários estudos têm observado uma associação entre os níveis de metilação do DNA de leucócitos e risco de bexiga, mama e cancro colorectal [4], [5], [6], [7]. No entanto, ainda não foi avaliada a associação entre níveis de metilação global e câncer de células renais (RCC).

Elementos

nucleares longo intercaladas retrotransposons (LINE-1) não são de longo terminal de repetição (non-LTR) que constituem cerca de 17% do genoma humano, com ~500,000 elementos normalmente disperso por todo o genoma humano [3], [8]. elementos de linha-1 são normalmente fortemente metilado em tecidos normais, enquanto que a linha 1-hipometilação foi reportado em tecidos de cancro [9]. Quantificação de metilação CpG dentro elementos LINE-1 é um ensaio de elevado débito de baixo custo que tem sido amplamente utilizada como um proxy de metilação da citosina global (5MeC) níveis [10], [11]. Vários estudos de caso-controle têm sugerido que os níveis de LINE-1 metilação medidos no DNA dos leucócitos pode ser um potencial biomarcador de suscetibilidade ao câncer e instabilidade genômica; no entanto, a relação entre LINE1 e outros biomarcadores de metilação global, tais como Alu [12] está apenas começando a ser explorado em grandes estudos bem desenhados de risco de câncer [13], [14], [15], [16]. Além disso, as relações entre os níveis de metilação em tecidos-alvo e amostras de DNA não-invasiva recolhidos tecidos de proxy também não são bem compreendidos.

A incidência da RCC, o tumor maligno mais comum de câncer renal, varia em todo o mundo [17], com algumas das mais altas taxas de ocorrência na Europa Oriental [18], [19] e Central. O tabagismo, obesidade e hipertensão são bem estabelecida factores de risco para RCC, mas estas representam apenas cerca de 50% dos casos [19]. Para explorar a influência potencial da metilação global como um fator de risco para RCC, comparou-LINE-1 níveis de metilação no DNA dos leucócitos em um subconjunto de casos e controles inscritos em um estudo caso-controle multicêntrico RCC. Examinamos potencial de modificação de efeito por polimorfismos germinativas comuns e fatores de risco conhecidos RCC. Por último,

BVS

inativação do gene no tecido tumoral RCC é frequentemente (até 91%) observada.

BVS

alteração, através de alterações, quer hipermetilação do promotor ou sequência, é considerada um evento precoce e frequente na carcinogênese renal e tem sido usado como um biomarcador da heterogeneidade do tumor renal. Portanto, LINE-1 níveis de metilação foram avaliadas entre os subgrupos de casos heterogêneos para examinar se o risco de ter um tipo específico de

BVS

alteração no ADN do tumor pode ser modificado por níveis de metilação globais no DNA genômico.

resultados de

a maioria dos participantes do estudo eram provenientes da República Checa, com uma proporção ligeiramente maior entre os casos. Capas foram mais propensos do que os controlos de ter um IMC maior (p = 0,07) e tem um consumo de vegetais menor (p = 0,01; Tabela 1). Distribuições de idade, tabagismo e hipertensão arterial auto-referida foram comparáveis ​​entre os casos e controles.

Usando modelos de regressão linear, foi avaliada a contribuição de características dos participantes selecionados hipótese a ser associado com a linha 1-níveis de metilação Entre os controlos (n = 654; Tabela 1). Entre os controles, os machos tinham significativamente maior LINE-1 níveis de metilação (mediana = 81,89%) do que mulheres (mediana = 81,29%; p = 0,0003). Os indivíduos que relataram ter hipertensão também foram associados com níveis estatisticamente significantes maiores LINE-1 metilação (mediana = 82,03%) do que aquelas que não o fizeram (mediana = 81,46%; p = 0,04). Uma diferença significativa entre os centros também foi detectado entre os controles (p = 0,01), o que irá ajustar para em nossos modelos. Há tendências distintas em LINE-1 níveis de metilação por idade, tabagismo, IMC e consumo de vegetais foram detectados entre os controles. A distribuição de LINE-1% 5MeC entre os casos também é fornecido na Tabela 1 para comparação

No geral, medianos LINE-1 níveis de metilação foram significativamente maiores nos casos de CCR 81,97%. (Intervalo interquartil: 80,84-83,47), em comparação para 81,67% (intervalo interquartil: 80,35-83,03) entre os controles (p = 0,003, Wilcoxon; Tabela 1). Em comparação com os indivíduos na linha inferior-quartil uma metilação, os indivíduos no quartil mais alto foram associados com a 2 vezes maior risco de RCC (P = 0,004; Tabela 2). O OR ajustado para RCC em associação com um aumento de 1% no total LINE-1 metilação foi de 1,10 (IC 95%: 1,03-1,19; p = 0,008). Metilação variou ligeiramente em cada um dos quatro locais CpG seqüenciados, com a menor mediana% 5MeC observado na quarta loco (mediana de casos: 78,4%, controles: 78,2%) e os mais altos níveis no primeiro lugar (mediana de casos: 85,4 %, controla: 84,8%). Comparados aos controles, os casos tinham significativamente maior% 5MeC em cada locus (p-valores que variam de 0,0001 a 0,05, Wilcoxon). Superior% 5MeC no lócus 1 demonstrou a associação mais forte com o risco de RCC (OR = 1,24, 95% CI: 1,14-1,35); No entanto, as tendências ascendentes semelhantes foram observadas para os outros três loci (locus de 2: OR = 1,07, 95% CI: 0,99-1,14; lócus 3: OR = 1,06, 95% CI: 1,00-1,13; lócus 4: OR = 1,05, IC 95%: 0,99-1,11)

na análise estratificada por tabagismo, o risco aumentou com a 5MeC quartil mais alto lINE-1% (Q4) foi mais acentuada entre os fumantes (OR

Q4 = 6,48, 95% CI: 2,68-15,67; p-tendência 0,0001) do que entre os antigos ou nunca fumaram (p-interação = 0,03; Figura 1). A associação positiva com o risco de RCC foi igualmente restringida aos fumantes atuais em todo loci indivíduo (Tabela S1). Para explorar ainda mais a interação entre tabagismo e alta LINE-1 5MeC (Q2-Q4)%, foi realizada uma análise caso apenas para garantir que a associação não foi devido a uma série de controle que não era representativa da população do estudo em relação à condição de fumante. Em comparação com casos RCC que nunca foram fumantes, partidas positivos de multiplicatividade foram observados para os casos de CCR que foram ou ex-(IOR CI = 1,83, 95%: 0,69-4,83) ou fumantes atuais (IOR CI = 2,47, 95%: 0,91-6,70 ; p-tendência = 0,06). Isto indicaria que a relação do aumento da metilação global e RCC é mais forte entre os fumantes atuais do que nunca fumaram. Em ambas as análises, o estado de fumar e LINE-1 apareceu níveis de metilação para modificar a contribuição do outro factor de risco. análises estratificadas adicionais por sexo, IMC, consumo de vegetais e hipertensão auto-referida não resultou em diferenças significativas (dados não mostrados).

odds ratio e intervalos de confiança de 95% para a associação entre LINE-1 metilação níveis e RCC, ajustados para sexo, idade, centro, IMC, pressão arterial elevada, legumes e verduras.

para avaliar se a variação comum em genes selecionados envolvidos no metabolismo de um carbono e tabaco modificado a associação observada , realizamos análises estratificadas por sete variantes funcionais em cinco genes (

MTHFR, MTR, Tyms, GSTM1,

e

GSTTI

). Duas variantes genéticas,

MTHFR

c.1298A C e

MTR c.2756A G,

pareceu influenciar a associação entre LINE-1 níveis de metilação e risco de RCC (Tabela 3). Observou-se uma forte tendência positiva entre os quartis de metilação LINE-1 e risco de RCC entre aqueles que realizou pelo menos uma cópia do alelo menor C de

MTHFR

c.1298A C (p-tendência = 0,0009; p interacção = 0,15). Aumento do risco com maiores níveis de LINE-1 metilação foi restrita àqueles com o genótipo AA de

MTR c.2756A G

(p-tendência = 0,004; p-interação = 0,19) e não foi significativa entre aqueles realização de pelo menos uma cópia do alelo secundário. Nenhuma dessas variantes demonstrou efeitos principais estatisticamente significativas, que foi publicado anteriormente [20].

Porque

BVS

inativação do gene é um evento precoce freqüente em RCC que tem sido usado para definir subgrupos moleculares de cânceres renais [21], exploramos se a metilação global estava associado a um subconjunto específico de casos RCC definido pelo mecanismo através do qual

BVS

inativação do gene no DNA do tumor ocorre. Definimos subgrupos RCC como tendo

BVS

inativação do gene através de mecanismos epigenéticos (promotor hipermetilação), mecanismos genéticos (alterações na sequência de codificação que resultariam em uma proteína alterada (ie mutações missense, deleções, inserções, mutações no local emenda) ou tumores de tipo selvagem (aqueles sem observável

BVS

inativação). Entre um subconjunto de casos de CCR em que os dados estava disponível no

BVS

metilação do promotor ou o estado alteração genética no tecido somático (n = 144 ), o risco de ter uma alteração no

BVS

aumentou com quartis de metilação aumentando (OR

Q2 = 1,26, 95% CI: 0,34-4,64; OR

Q3 = 1,62, 95% CI : 0,42-6,18; e OR

Q4 = 2,57, 95% CI:.. 0,68-9,72; p-tendência = 0,12) Embora sugestivos mais casos, são necessários para avaliar plenamente esta associação

Discussão

Este estudo avaliou o papel de lINE-1 metilação no DNA do sangue periférico como um proxy para a metilação global em tecido de tumor renal. em nosso estudo, maior lINE-1% 5MeC foi associado com um risco aumentado de RCC. Superior LINE-1% níveis 5MeC parecia ser um forte fator de risco para o desenvolvimento da RCC em fumantes atuais do que em anteriores ou nunca fumaram. Além disso, os resultados de nosso estudo sugerem uma possível interação entre LINE-1 metilação e

MTHFR

c.1298A Cand

MTR c.2756A . G

com RCC

a associação foi observada contrasta com o que foi observado em outros estudos epidemiológicos câncer. A hipometilação de DNA global no tecido de tumor tem sido observada, mas varia amplamente dentro e entre os tipos de cancro [7], [22]. hipometilação do DNA global de DNA de leucócitos, medido pelo conteúdo 5MeC%, tem sido associada com maior risco de câncer em vários estudos de caso-controle recentes, incluindo um grande estudo de caso-controle de câncer de bexiga [4], [6], [7]. Em vários estudos de caso-controle, os níveis mais baixos de LINE-1 tem sido associado com aumento do risco de tumores testiculares [14], e gástrica [13], cabeça e pescoço [16], e cancro da bexiga [15]. No entanto, um pequeno estudo de câncer de mama não encontrou diferença na% 5MeC níveis LINE-1 entre casos e controles, mas a% significativamente menor níveis 5MeC entre os casos [5]. Esse mesmo estudo também observou que os níveis de% 5MeC e% 5MeC LINE-1 (ambos medidos em DNA de leucócitos) não se correlacionam bem [5].

estão disponíveis sobre o impacto dos níveis de metilação do DNA global em dados limitados tumores renais e são difíceis de comparar devido a diferentes métodos de avaliação da metilação. Para o melhor do nosso conhecimento, não há dados disponíveis sobre a correlação entre o estado de metilação global no soro e tecido renal. Entre os estudos de metilação do promotor, um estudo relatou que o estado metilação do promotor de

Wnt

genes medidos no soro combinado geralmente a de amostras de tumores renais correspondentes [23], enquanto a proporção de casos em que o promotor metilação do específica oncológicos genes detectados no soro combinada com metilação do mesmo marcador em tumores variavam de 0 a 60% [24]. Alguns estudos detectaram aumento da metilação global em tecido RCC. Arai et al. relatou que os perfis de metilação do DNA do genoma, incluindo hipermetilação mundial, determinado a partir de tecido renal normal adjacente foram altamente associado com a agressividade do correspondente RCC [25]. Um pequeno estudo realizado pela Minardi et al. observado um aumento significativo na metilação global em tecidos tumorais, com o aumento do grau de RCC [26]. Dois estudos experimentais têm descrito

LINHA

-1 estado de metilação em amostras de tecido RCC. Chalitchagorn et ai. demonstrou que LINE-1 metilação variou significativamente entre os diferentes tipos de tecidos, mas não houve diferença no

LINHA

-1 níveis hipometilação entre RCC e tecidos renais [9]. Outro estudo observou-se uma ausência de hipometilação das sequências LINE-1 em diferentes estágios e os tipos de carcinoma de células renais, o que estava em contraste com outros carcinomas uroteliais [27]. Em conjunto, estes estudos sugerem que o RCC pode não ter a típica associação com a metilação do DNA observado em outros cancros; no entanto, dado os métodos de avaliação utilizados variados, são necessários mais estudos.

Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para encontrar uma associação com, em vez de níveis de metilação maiores baixas LINE-1 (medida em leucócitos DNA) eo risco de câncer. Phokaew et ai. casos esporádicos observados de hipermetilação em LINE-1 loci entre linhas celulares de cancro [28]. hipermetilação específicos de linhas-1 também tem sido relatada na proliferação anormal e diferenciação do tecido de placenta [29]. Embora se preveja que os níveis de metilação LINHA-1 para proporcionar uma avaliação rápida e fácil de metilação global, apenas um terço de metilação de ADN genómico é estimada ocorrer em elementos repetitivos [11]. É também possível que RCC tem uma relação incomum com metilação dentro elementos repetitivos em comparação com outros tipos de cancro. Por último, até aos nossos achados são replicados permanece também a possibilidade de que a associação foi observada pode ser devida ao acaso. A associação observada parece um pouco robusto e consistente em nossas análises sugerem que esses achados não foram devido ao acaso; no entanto, esta constatação não exige replicação em uma segunda população do estudo.

Na nossa avaliação dos preditores de LINE-1 níveis de metilação no DNA dos leucócitos, o sexo era a única característica que foi fortemente associada à variação dos níveis. Os machos tinham níveis LINE-1 metilação significativamente maiores do que as fêmeas, o que está de acordo com outros estudos [14], [15], [16], [30], [31], [32], [33]. hipertensão auto-referida também foi associado com níveis de metilação LINE-1 superiores, mas não foi previamente avaliada em estudos publicados. Idade é geralmente considerado para ser inversamente associado com o aumento da metilação global de [34]; No entanto, a idade não foi correlacionada com os níveis de LINE-1 de metilação em nosso estudo ou em vários estudos anteriores [9], [16], [31], [32], [35], [36]. O fumo tem sido associada tanto à hipermetilação do promotor e hipometilação de DNA genómico de tumor [16], [37]. No entanto, não se observou uma associação entre tabagismo e LINE-1 níveis de metilação no DNA dos leucócitos, o que é consistente com os resultados de outros estudos [15], [16], [31], [32]. A falta de associação entre a linha de 1 níveis de metilação no sangue com várias características em nosso estudo foi geralmente semelhante ao que tem sido observado em outros estudos; no entanto, deve notar-se que os nossos controles podem não ser representativos como eram controles baseados em hospitais.

O fumo tem sido associada a níveis globais de metilação no tecido tumoral [16], [37]. Com base em dados obtidos no nosso estudo e outros, no entanto, não parece existir uma relação bem definida com relação a ADN genómico isolado a partir de sangue [15], [16], [31], [32]. Tendo em conta os dados contraditórios sobre a associação entre os níveis de fumadores e metilação, é possível que o efeito de agentes cancerígenos fumadores em estado de metilação pode ser diferente entre diferentes tipos de tecidos. Em nossos dados, o risco associado com maior% 5MeC de LINE-1 parece ser aumentada em fumantes atuais, sugerindo uma interação entre tabagismo e LINE-1 hipermetilação. Deve-se notar que os relatórios anteriores da população deste estudo não se observou um efeito principal de fumo, presumivelmente devido a alguma fonte de viés de seleção controle [38]. No entanto, fizemos notar que, entre os três maiores quartis de LINE-1, tabagismo atual foi associada com um aumento no risco RCC em comparação com pessoas que nunca fumaram. Para lidar com o viés, realizamos uma análise caso a única que minimiza qualquer potencial viés de seleção a partir do uso de controles baseados em hospitais. Estes resultados entre os casos foram semelhantes e confirmou que os fumantes atuais que são fortemente metilados dentro de LINE-1 têm um maior risco de RCC do que nunca fumaram, que são pesadamente metilado. Vários mecanismos potenciais de como fumar afeta o estado de metilação do DNA existem, como indirectamente, através de inflamação sistêmica aumentada ou danos fita dupla-break, ou diretamente através da expressão alterada de metiltransferases de DNA, mas o mecanismo exato é mal compreendida [39].

Como genes envolvidos no metabolismo de um carbono têm sido associados com os níveis de metilação global e de RCC, realizamos análises exploratórias utilizando dados de genótipos disponíveis para avaliar se polimorfismos modificado a associação entre a linha-1 e os níveis de metilação risco RCC. No presente estudo, os resultados de duas variantes genéticas

MTHFR

c.1298A Cand

MTR c.2756A G

foram sugestivos. Outros estudos de metilação global e câncer não observaram quaisquer diferenças perceptíveis no risco de câncer por estas variantes [4], [13], [15].

Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliar LINE- 1 níveis de metilação do DNA de leucócitos e risco de RCC. Embora um subconjunto do estudo caso-controle completo foi selecionado, este estudo tem poder estatístico suficiente para detectar associações e eles não foram diferentes para o grupo como um todo. Uma limitação é que este estudo de caso-controle incluídos controles e DNA a partir de casos foi coletado antes do tratamento ainda pós-diagnóstico baseados no hospital. Não detectamos diferenças substanciais em LINE-1 níveis de metilação por grupos de doenças entre os controles, ou pelo estágio e grau dos casos. Isto sugere que a progressão da doença é menos provável que afetaram os resultados. A análise caso a única conduzida, eliminou o potencial viés de seleção que ocorre com o uso de controles baseados em hospitais, e apoiou a associação observada na análise estratificada. Embora os níveis de metilação LINHA-1 são consideradas como um proxy para a metilação do DNA global geral, as duas medidas não são inteiramente permutáveis ​​e podem ser de medição diferentes aspectos de metilação global. Independentemente disso, muitos estudos têm demonstrado que o uso de linha de 1 níveis de metilação no sangue pode fornecer um marcador útil para a doença e iria oferecer um método simples, não invasivo para identificar os indivíduos em risco de RCC

.

Em resumo, os nossos resultados sugerem que lINE-1 níveis de metilação no DNA dos leucócitos são positivamente associado com o risco de RCC e pode servir como um biomarcador para RCC susceptibilidade. As investigações para determinar se a metilação global em ADN genómico reflecte alterações epigenética em tecido renal são necessárias para provocar ainda mais o papel da epigenética e RCC. Para responder a estas questões, os futuros estudos em amostras de DNA coletados prospectivamente será necessário, bem como estudos projetado para resolver a aparente interação entre estado de metilação e fumo de tabaco relacionada ao risco RCC.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o protocolo de estudo foi aprovado pelos comitês de ética relevantes e conselhos de revisão institucional de todos os centros participantes, a Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC), eo Instituto Nacional do Câncer (NCI) no US National Institutes of Health. Todos os sujeitos do estudo e seus médicos desde consentimento informado por escrito.

Estudo da População

O Cancer Study Europa Central e Oriental Renal (CEERCC) é um estudo de caso-controle de base hospitalar de câncer renal (1.097 casos e 1.555 controles) que foi realizado em sete centros na Europa Central e Oriental (Moscou, Rússia; Bucareste, Romênia; Lodz, na Polónia, e Praga, Olomouc, Ceske Budejovice e Brno, República Checa). A população de estudo foi previamente descrito [40]. Resumidamente, recém-diagnosticados e confirmados histologicamente casos de câncer renal, mas não pelve renal (ICD-0-2 código C64) entre as idades de 20 e 79 anos foram recrutados a partir de 1999 através de 2003. Treinado pessoal médico revisados ​​registros médicos e extraiu informações sobre data e método de diagnóstico, classificação histológica, estágio do tumor e grau. controles elegíveis foram escolhidos a partir de pacientes internados no mesmo hospital como casos de condições não relacionadas ao fumo ou perturbações geniturinárias (exceto para a hiperplasia benigna da próstata) e foram aos casos relativos à idade, sexo e centro de estudos pareados por freqüência. Nenhuma doença única constituída por mais do que 20% do grupo de controlo. Todos os casos e controles recrutados eram caucasianos. As taxas de resposta em cada centro variou 90,0-98,6% para os casos e 90,3-96,1% para controles. estilo de vida e de frequência alimentar questionários padronizados foram administrados em pessoa por pessoal treinado [38], [41].

As amostras de sangue foram coletadas e armazenadas a -80 ° C e, posteriormente, enviado para o Instituto Nacional do Câncer (NCI). O ADN genómico foi extraído a partir de buffy coat pelo método de fenol clorofórmio padrão no laboratório NCI. Para avaliar a metilação global, selecionamos um subconjunto de casos e controles RCC com uma grande quantidade de DNA disponível (≥10 mg) e dados sobre

BVS

status usando os seguintes critérios de correspondência. Os controles foram selecionados aleatoriamente e combinados-frequência (2:1) sobre a idade (± 5 anos), sexo e centro de estudos (se possível) para obter energia suficiente (90% para detectar uma menor de 1,80). Todos os sujeitos neste estudo forneceu consentimento informado por escrito. Este estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais no NCI, Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC), e cada centro participante.

A genotipagem

testes de genotipagem foram realizadas no Núcleo de Genotipagem Facilidade de NCI . Os seguintes polimorfismos funcionais de nucleotídeo único (SNPs) no prazo de três genes foram consideradas neste estudo devido ao seu papel no fornecimento de precursores necessários para a síntese de DNA e reparação, bem como a metilação do DNA: 5,10 metilenotetrahidrofolato redutase (

MTHFR

; c.1298A C,

c.677C T)

, metiltransferase 5-metiltetraidrofolato-homocisteína (

MTR; c.2756A G

) e timidilato sintetase (

Tyms ; EX8 + 157C T, EX8 + 227A G

). Glutationa S-transferase mu 1 (

GSTM1

) e glutationa S-transferase teta 1 (

GSTT1

) exclusões também foram selecionados por causa de associações anteriores com risco de RCC e do seu papel no metabolismo de fase II . métodos experimentais específicos foram descritos anteriormente (https://snp500cancer.nci.nih.gov) [20], [42].

Quantificação de LINE-1 níveis de metilação

LINE-1 níveis de metilação foram quantificados usando um ensaio de pyrosequencing em EpigenDx (Worcester, MA) [43], [44], [45]. O nosso ensaio foi concebido para examinar o estado de metilação de CpG em quatro locais no promotor de região da linha-1 (GenBank Accession #: M80343, -605, -593, -590 e -583 pb do ATG do ORF1) [16], [46]. Resumidamente, 500 ng de DNA de leucócitos foi bissulfato tratados e purificados utilizando o Kit de Zymo Metilação de DNA (pesquisa Zymo, Orange, CA). Bissulfato tratada ADN foi purificado e eluída em 20 ul de tampão de eluição. Cada PCR continha tampão 50 ul de PCR 10X, 3,0 mM MgCl

2, 200? M de dNTP, 0,2 uM primários, 1,25 U de polimerase de ADN (HotStar, Qiagen Inc., Alameda, CA), 1,25 U, e ~ 10 ng de ADN convertido com bissulfito . A polimerase foi activada por incubação a 95 ° C durante 10 min, seguido por 34 ciclos de 95 ° C durante 15 seg, 45 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg. A reacção foi então deixada a estender-se por 5 min a 72 ° C. Um iniciador biotinilado universal foi utilizado na reacção de PCR inicial para permitir o isolamento do fragmento amplificado, seguido por desnaturação e libertação de um produto único fio para pirossequenciao [47]. Os produtos de PCR (10 ul) foram sequenciados utilizando o Sistema PSQ96 HS pirossequenciao (pirossequenciao Qiagen) seguindo as instruções do fabricante (Qiagen) pirossequenciao. estado de metilação em cada um dos 4 loci foi analisado individualmente, como a /C SNP utilizando software T QCpG (pirossequencia�o Qiagen). estado de metilação de todos os quatro loci são em média em conjunto para proporcionar um por cento estado geral 5MeC. A pyrogram exemplo é incluído como dados complementares (figura S1). metilação do DNA por cento dentro de LINE-1 foi medida em triplicado.

Análises Estatísticas

triplicado LINE-1 medições 5MeC foram em média juntos. corridas individuais com 7,5% os valores de citosina não convertidos bissulfito e amostras com um coeficiente de variação (CV) 10% foram excluídos da nossa análise (n = 19). Foi realizada uma análise de sensibilidade, excluindo indivíduos com CV 5%. Esta exclusão não resultou numa diferença significativa nas estimativas de risco em pelo menos 10% e, portanto, estes sujeitos permaneceram nas análises. Após essas exclusões, os dados estavam disponíveis em 982 amostras (328 casos RCC e 654 controles). As diferenças entre casos e controles foram testados para a significância utilizando testes de postos sinalizados de Wilcoxon. Para identificar potenciais determinantes de LINE-1 níveis de metilação e /ou fatores que podem modificar a associação entre LINE-1 níveis de metilação e risco de câncer renal, modelos de regressão linear foram utilizados para avaliar diferenças entre os controles em relação a características selecionadas. A distribuição da Linha-média 1% 5MeC entre os controlos foi utilizada para determinar pontos de corte para os quartis. Para avaliar a associação entre os níveis de linha 1 metilação e RCC, modelos de regressão logística, ajustados para os fatores correspondentes, estado do tabaco, IMC, consumo de vegetais e de hipertensão auto-referida, foram utilizados para estimar odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC 95%). Os testes de tendência foram calculados por modelagem de uma variável codificada 0, 1, 2 e 3 para cada quartil. Nós também modelado LINHA-1 como um valor constante. Para avaliar o potencial de modificação de efeito de LINE-1 metilação, análises estratificadas por tabagismo, sexo, IMC, consumo de vegetais, hipertensão auto-referida e SNPs selecionados foram conduzidas. variantes funcionais comuns dentro

MTHFR, MTR, Tyms, GSTM1,

e

GSTT1

foram avaliados quanto à associação com LINE-1 metilação. A principal alelo homozigoto foi codificado como o grupo de referência, e os genótipos de alelos heterozigotos e homozigotos menores foram combinadas entre si devido a um pequeno número de indivíduos homozigotos para os menores alelos. A análise caso a única avaliar a interação entre LINE-1 níveis de metilação de fumar e também foi realizado para fornecer uma estimativa da modificação de efeito (interação OR: IOR) que não seria influenciado por vieses de seleção entre os nossos controles. Os IORs representam a saída do efeito conjunto do tabagismo e LINE-1 metilação do esperado sob um modelo multiplicativo no risco de RCC. Todas as análises foram realizadas usando SAS versão 9.1. (SAS Institute, Cary, NC).

Informações de Apoio

Figura S1.

Amostra pyrogram Manifestação níveis LINE-1 metilação.

doi: 10.1371 /journal.pone.0027361.s001

(DOC)

Tabela S1.

análises estratificada por Fumar Estado e Individuais posição LINE-1. Odds ratio e intervalos de confiança de 95% para a associação entre níveis de metilação LINE-1 e RCC, ajustada para sexo, idade, centro, IMC, pressão arterial elevada e consumo de vegetais

doi: 10.1371. /Journal.pone.0027361.s002

(DOC)