Abstract

O câncer de pâncreas é uma doença mortal, e o tratamento, portanto, eficaz e /ou estratégias de prevenção são urgentemente necessários. Os objetivos deste estudo foram analisar os mecanismos moleculares pelos quais embelin crescimento das células do câncer de pâncreas humano inibiu

in vitro

e xenoenxertos em ratinhos nus Balb C, e crescimento de células de câncer de pâncreas isolado do Kras

transgênica G12D ratos. Os ensaios de XTT foi realizado para medir a viabilidade das células. células AsPC-1 foram injectadas subcutaneamente em ratinhos Balb C ratinhos nus e tratados com embelin. A proliferação celular e a apoptose foi medida por coloração de Ki67 e TÚNEL, respectivamente. A expressão da Akt, e Sonic hedgehog (Shh) e os seus produtos de genes alvo foram medidos por imuno-histoquímica e análise de Western blot. Os efeitos da embelin em células cancerígenas pancreáticas isoladas de 10 meses de idade Kras

camundongos G12D também foram examinados. Embelin inibiu a viabilidade celular em câncer pancreático AsPC-1, PANC-1, MIA PaCa-2 e linhas de células Hs 766T, e esses efeitos inibitórios foram bloqueadas tanto por proteínas Akt ou Shh constitutivamente ativo. ratinhos tratados com Embelin mostrou uma inibição significativa no crescimento do tumor que foi associado com expressão reduzida de marcadores de proliferação celular (Ki67, PCNA e Bcl-2) e do ciclo celular (ciclina D1, CDK2 e CDK6), e indução de apoptose (activação de caspase-3 e PARP de clivagem, e um aumento da expressão do Bax). Além disso, embelin inibiu a expressão de marcadores de angiogese (COX-2, VEGF, VEGFR, e IL-8), e metástases (MMP-2 e MMP-9) em tecidos tumorais. A actividade antitumoral de embelin foi associada à inibição de Akt e Shh vias em xenoenxertos, e células de cancro do pâncreas isolados de Kras

ratinhos G12D. Além disso, também embelin transição epitelial-inibiu a-mesenquimal (EMT) por cima de regulação de E-caderina e a inibição da expressão de Snail, Slug, e ZEB1. Estes dados sugerem que embelin pode inibir o crescimento do cancro do pâncreas, angiogénese e metástases através da supressão de Akt e Shh vias, e podem ser desenvolvidos para o tratamento e /ou prevenção de cancro do pâncreas

citação:. Huang H, Tang SN, upadhyay L, JL Marsh, Jackman CP, Shankar S, et al. (2014) Embelin suprime o crescimento do câncer de pâncreas humano xenoenxertos e do cancro do pâncreas células isoladas de Kras

Ratos G12D inibindo Akt e Sonic Hedgehog Pathways. PLoS ONE 9 (4): e92161. doi: 10.1371 /journal.pone.0092161

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de maio de 2013; Aceito: 19 de fevereiro de 2014; Publicação: 02 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas é uma das doenças malignas altamente agressivos em todo o mundo . A taxa de sobrevivência de 5 anos global desta doença mortal é inferior a 5% [1]. Devido às suas características invasivas e metastáticas, 10% dos doentes são elegíveis para a cirurgia no momento do diagnóstico. O mau prognóstico da doença está relacionada com a apresentação tardia, invasão local agressivo, e metástase cedo. A quimioterapia convencional ea radioterapia são geralmente ineficazes, eo surgimento de resistência aos medicamentos é comum [2], [3]. A gemcitabina é um potente anticancerígeno droga aprovada para o tratamento de cancro do pâncreas, mas a taxa de resposta é muito pobre. As principais deficiências da gemcitabina atual são a sua inactivação metabólica rápida e estreita janela terapêutica. quimioterapia FOLFOX (ácido folínico, 5-fluorouracilo e oxaliplatina) é comumente utilizada para o tratamento do cancro do pâncreas com sucesso limitado. Vários fatores estão associados com risco aumentado para câncer de pâncreas e estas incluem diabetes, pancreatite crônica, cirurgia gástrica prévia, tabagismo, radiação, e polimorfismos de genes específicos [4], [5]. mutações genéticas hereditárias adquiridas e várias (por exemplo, Kras) são comuns em tumores pancreáticos [6]. As mutações na p16 inibidor de quinase dependente de ciclina, o gene supressor de tumores

p53,

SMAD4 e também foram identificadas [7], [8]. Portanto, a compreensão da patogênese da fase de pré-invasiva, e desenvolver estratégias eficazes para prevenir e /ou tratar o câncer de pâncreas são de suma importância.

Embelin, derivado do fruto da

embelia Ribes

Burm planta (Myrsinaceae), ter sido demonstrado que possuem actividade contra o cancro [9]. Apesar de ter sido originalmente descoberta como um inibidor de XIAP, [10], e ele também inibe a migração celular, invasão e induz a apoptose e [11]. Tem sido demonstrado que induzem a apoptose em pâncreas, cólon, próstata e células de cancro do pulmão e leucemia crónica e células de mieloma múltiplo [12], [13]. Ele também pode modular microambiente do tumor-imune em Kras

camundongos G12D [14]. Além disso, a STAT3 via tem sido demonstrado que regulam as actividades anti-inflamatória e anti-cancro embelin [15]. Ela aumenta os efeitos pró-apoptóticos de TRAIL [16]. Apesar destas descobertas, os mecanismos moleculares pelos quais embelin inibe o crescimento tumoral, angiogênese e metástase não são bem compreendidos.

O PI3K /Akt via de sinalização desempenha papel significativo na proliferação e sobrevivência celular, e é frequentemente e anormalmente ativados em estágios posteriores do adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC) [17]. PTEN camundongos knockout condicional com activado Kras

G12D mostrou acelerou significativamente o desenvolvimento de acinar-to-ductal metaplasia (ADM), neoplasia intra-epitelial pancreáticos malignos (mPanIN), e PDAC no prazo de 12 meses [18]. Mais importante ainda, todos os ratos com Kras

activação G12D e Pten deleção homozigótica sucumbiu ao câncer por 21 dias. Este estudo confirmou o papel de PTEN, e a desregulação resultante do eixo de PI3K /AKT de sinalização em PDAC iniciação e progressão. Da mesma forma, temos demonstrado recentemente que o resveratrol pode inibir a carcinogênese pancreática em Kras

camundongos G12D [19]. Aqui, procurou-se analisar os efeitos anti-proliferativa de embelin em células cancerígenas pancreáticas isoladas de Kras

camundongos G12D.

sonic hedgehog (Shh) é um membro do Hedgehog (Hh) família de sinalização secretada proteínas com diversas funções durante o desenvolvimento dos vertebrados e na homeostase dos tecidos [20]. actividade inapropriada da via de sinalização Hh tem sido associada aos tipos de tumores que surgem esporadicamente ou em indivíduos geneticamente predispostos [21]. Os receptores de ligação de Shh para Patched (Ptch) provoca a perda de actividade de Ptch e consequente estabilização pós-transcricional e fosforilação de Smoothened (Smo) [22]. A família de factores de transcrição Gli regula vários genes que PALY papéis no ciclo celular, a proliferação, a migração e a apoptose [23]. Curiosamente, Gli regula a sua própria expressão e outros membros da Shh percurso, tais como células cancerosas Patched 1 e remendado 2 e pancreáticas isoladas de Kras

camundongos G12D. A activação da via de Shh Smo pode ocorrer quer por estimulação de proteína Hh ou através da perda de actividade Ptch [23]. Shh via estimula o crescimento celular de forma autócrina e parácrina [24]. Nós demonstramos recentemente que vários agentes quimiopreventivos e drogas anti-cancro pode inibir o crescimento celular de células de cancro e cancro do pâncreas estaminais in vitro e in vivo [19], [25] – [31]. A inibição da isoladamente ou em combinação com outros Shh via pode ser eficaz para o tratamento e /ou prevenção do cancro do pâncreas.

O objectivo deste estudo foi examinar os mecanismos moleculares pelos quais embelin inibe o crescimento tumoral, angiogénese e metástase de células de câncer de pâncreas xenoenxerto em ratinhos nus Balb C. Além disso, os mecanismos moleculares pelos quais embelin inibiu o crescimento de células de cancro do pâncreas isolados de Kras

G12D ratinhos foram também examinados. Nossos dados mostraram que embelin crescimento das células do cancro do pâncreas inibido

in vitro,

AsPC-1 do crescimento do tumor xenoenxerto

in vivo

e células cancerosas pancreáticas isoladas de Kras

camundongos G12D suprimindo Akt e Shh vias de sinalização. Em conclusão, pode ser desenvolvido para a prevenção e /ou tratamento de câncer no pâncreas.

Resultados

Embelin inibe a viabilidade celular em linhas celulares de cancro do pâncreas

Em primeiro lugar, examinou o efeitos anti-proliferativos de embelin sobre quatro linhas celulares de cancro pancreático ASPC-1, PANC-1, MIA PACA-2 e Hs 766T por ensaio de XTT. Estas linhas celulares foram tratadas com embelin (0-15 uM), durante 48 h, e a viabilidade celular foi realizado através de ensaios de XTT. Como mostrado na Fig. 1A e B, embelin viabilidade celular inibida em todas as linhas celulares. A seguir, examinou o envolvimento da caspase nesse processo, utilizando um inibidor da caspase z-VAD-fmk pan. Embora só z-VAD-inibidor foi ineficaz na inibição da viabilidade celular, que bloqueou significativamente os efeitos anti-proliferativos de embelin em AsPC-1 e linhas de células PANC-1 (Fig. 1 C e D). Estes dados sugerem que a caspase (s) de activação pode ser necessária para inibir o crescimento celular por embelin.

, linhas de células MIA PaCa-2 e Hs 766T (A e B), do cancro do pâncreas AsPC-1, PANC-1 foram tratados com embelin (0-15 uM) durante 48 h. No final do período de incubação, os ensaios de XTT foram realizadas para medir a viabilidade das células. (C e D), os efeitos do inibidor da caspase panela em efeitos anti-proliferativos de embelin. do cancro do pâncreas AsPC-1 e PANC-1 As células foram pré-incubados, z-VAD-fmk (10 pM), durante 2 h e tratou-se com várias doses de embelin (0-15 uM) durante 48 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de XTT. Os dados representam a média ± S.D. a, b, c, d, e e = significativamente diferente do respectivo controlo, P . 0,05

Akt constitutivamente activa ou inibe a proteína Shh efeitos anti-proliferativos de Embelin

Akt foi mostrado para regular a via de Shh por fosforilação Gli. A seguir, analisou se a activação da Akt e Shh vias bloqueia efeitos anti-proliferativa de embelin usando proteína Akt e Shh constitutivamente activa, respectivamente. Akt constitutivamente activo (CA-Akt) foi previamente descrito [28]. Várias doses de embelin (0-15 uM) inibiu a viabilidade celular de AsPC-1 e PANC-1 transfectadas com o vector vazio (Fig. 1A e B). Além disso, Akt constitutivamente activo (CA-Akt) inibiu significativamente os efeitos anti-proliferativos de embelin em ambas as linhas celulares. Estes dados sugerem que embelin pode inibir a proliferação de células de câncer pancreático, suprimindo Akt.

A seguir, analisou se Shh via medeia efeitos anti-proliferativa de embelin. linhas celulares de cancro pancreático foram incubadas com a proteína Shh para activar Gli. Como mostrado na Fig. 2 C e D, várias doses de embelin (0-15 uM) inibiu a viabilidade celular de linhas celulares AsPC-1 e PANC-1. Por contraste, a proteína Shh inibiu significativamente os efeitos anti-proliferativos de embelin nestas duas linhas de células do cancro do pâncreas. Estes dados sugerem que embelin pode inibir a proliferação de células do cancro do pâncreas, suprimindo Shh via.

(A e B), a inibição de efeitos anti-proliferativos de embelin por Akt constitutivamente activa. células de cancro do pâncreas AsPC-1 e PANC-1 foram transientemente transfectadas com vector vazio ou Akt constitutivamente activo (CA-Akt), e tratados com várias doses de embelin (0-15 uM) durante 48 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de XTT. (C e D), a inibição de efeitos anti-proliferativos de embelin por proteína Shh. cancro do pâncreas AsPC-1 e células PANC-1 foram pré-tratadas com a proteína Shh (2 uM), durante 2 h, e tratou-se com várias doses de embelin (0-15 uM) durante 48 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de XTT. Os dados representam a média ± S.D. A, AA, b, c, d, e e = significativamente diferente um do outro, P . 0,05

Embelin inibe o crescimento de xenoenxertos ASPC-1 em ratinhos Balb C nu Ratinhos

a fim de examinar o potencial tumorigénico do embelin, primeiro analisou os efeitos da embelin no crescimento de AsPC-1 tumores xenoenxerto em ratinhos nus Balb C. células AsPC-1 foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus Balb C. Após a formação do tumor, os ratinhos foram tratados com embelin (0 ou 40 mg /kg de peso corporal) por meio de sonda esofágica (segunda a sexta-feira, uma vez por dia) durante 6 semanas. Como mostrado na Fig. 1A, embelin inibiu o crescimento tumoral AsPC-1 de pâncreas em ratos pelados Balb C. Além disso, embelin não teve efeito sobre o peso corporal de AsPC-1 portadores de tumor ratinhos, ratos, embora ganharam peso durante o tratamento (Fig. 3B). É importante notar que não se observou qualquer toxicidade no fígado, baço e intestino dos ratos tratados com embelin, sugerindo que é um produto natural seguro.

AsPC-1 células (2 x 10

6 células misturadas com Matrigel, 50:50) foram implantadas subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus Balb C. ratinhos portadores de tumores foram tratados com embelin (0 ou 40 mg /kg de peso corporal) por meio de sonda esofágica (segunda a sexta-feira, uma vez por dia) durante 6 semanas. O volume do tumor (A) e o peso corporal de ratinhos (B) foram registados semanalmente. Os dados representam a média ± S.D. * = Significativamente diferente do controlo, P 0,05

Embelin Inibe tumor a proliferação celular, e induz a apoptose através da activação de caspase-3 e a clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP)

a seguir, examinou os efeitos de embelin na proliferação de células tumorais em tecidos derivados de controlo e embelin ratinhos tratados utilizando anticorpos anti-PCNA ou anti-Ki67 anticorpo (Fig. 4). PCNA e Ki67 são os marcadores de proliferação celular. Embelin inibiu a proliferação de células tumorais em tecidos obtidos a partir de xenoenxertos de AsPC-1 em comparação com ratinhos de controlo, tal como medido por imuno-histoquimica (IHC) e a análise de transferência de Western (WB).

(A), a expressão de PCNA, Ki67, caspase-3 e PARP em tecidos tumorais. A imuno-histoquímica foi realizada para medir a expressão de PCNA, Ki67, caspase-3 e PARP activa em tecidos tumorais isoladas de controlo e murganhos tratados com embelin. (B), A quantificação de células positivas TUNEL. A apoptose foi medida por ensaio de TUNEL. Os dados representam a média ± S.D. * = Significativamente diferente do controlo, P 0,05. (C) Efeitos de embelin em marcadores de proliferação celular e da apoptose. A análise por Western blot foi realizada para medir a expressão de PCNA, Ki67, caspase-3 e PARP em tecidos tumorais. A β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

activação de caspase e clivagem da PARP seu substrato são as marcas do salão de apoptose [32]. A seguir, analisou se embelin induzida célula tumoral apoptose através da ativação de caspase-3 e clivagem de PARP. a activação da caspase-3 foi medida por IHC e análise de Western blot utilizando activa anti-caspase-3 de anticorpo (Fig. 4A e B). Embelin induziu activação de caspase-3. A PARP é um substrato da caspase-3 [32]. Embelin tratamento resultou na clivagem de PARP. Activação da caspase-3 pelo embelin correlacionada com a clivagem de PARP em tecidos tumorais. No geral, estes dados sugerem que embelin inibiu a proliferação celular e a apoptose induzida em tecidos tumorais pancreáticas através da inibição de PCNA, Ki67, e a activação de caspase-3 e PARP de clivagem.

Embelin Regula Bcl-2 Family Members e celular Proteínas de ciclo e inibe Akt ativação no Tumor tecidos

Os membros da família Bcl-2 pode promover ou inibir a apoptose [33], [34]. a paragem do crescimento por inibidores do ciclo celular pode conduzir à indução de apoptose [35]. Por isso, foram avaliados os efeitos de embelin sobre a expressão de proteínas de ciclo celular (ciclina D1, CDK-2, e de CDK-6), e Bcl-2 membros da família (Bcl-2, e Bax) em tecidos de tumor por análise de transferência de Western e imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig. 5, embelin inibiu a expressão de proteínas relacionadas com o ciclo celular ciclina D1, CDK-2 e CDK-6 em ASPC-1 tumores xenoenxertados em relação ao grupo de controlo não tratado. Além disso, o tratamento de embelin AsPC-1 ratinhos xenoenxertados resultou na inibição de proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e a indução de proteína pro-apoptótica Bax em tumores, em comparação com o grupo de controlo não tratado. Estes dados sugerem que embelin pode regular o crescimento do tumor do cancro do pâncreas, causando a paragem do ciclo celular e induzir a apoptose.

(A), a expressão de Bcl-2, Bax, ciclina D1, CDK2, CDK6 e fosfo-Akt. A imuno-histoquímica foi realizada como descrito em materiais e métodos. (B), análise por Western blot foi realizada para medir a expressão de Bcl-2, Bax, ciclina D1, CDK-2, CDK-6, P-AKT (Ser473), e AKT. A β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

A via PI3K /Akt sinalização regula a progressão do ciclo celular e a tumorigénese, e é constitutivamente activa no cancro pancreático [36]. agentes anticancerígenos que inibem PI3K /Akt pode ser desenvolvido para a gestão de câncer pancreático. Por isso, medir a expressão de fosfo-Akt em tecidos de tumor (Fig. 5). Embelin inibiu a expressão de pAkt em tecidos tumorais isoladas de ASPC-1 xenoenxertos em relação ao grupo de controlo não tratado. No geral, estes dados sugerem que embelin inibe PI3K /Akt na ASPC-1 tumores xenoenxerto, e inibição da Akt poderia induzir parada do ciclo celular, suprimir a proliferação de células tumorais e crescimento do câncer de pâncreas.

Embelin inibe a angiogênese

O crescimento de tumores sólidos depende da angiogénese para o fornecimento de nutrientes, factores de crescimento e de oxigénio [37]. Vascular Endothelial Growth Factor é um factor de crescimento segregado essencial para a angiogénese. funções de VEGF, tanto a angiogênese fisiológica e patológica, particularmente nas metástases tumorais, tornando-se um alvo terapêutico atractivo. Por isso, procurou medir os efeitos de embelin da angiogénese através da medição da expressão de VEGF e VEGFR em AsPC-1 tumores xenoenxertados. Como mostrado na Fig. 6, o tratamento do tumor com ratinhos portadores embelin resultou em inibição significativa na expressão de VEGF e VEGFR em tecidos tumorais em comparação com o grupo de controlo não tratado.

(A), A imuno-histoquímica foi realizada para examinar a expressão de VEGF, VEGFR, Cox -2, e IL-8 nos tecidos tumorais isoladas de controlo e murganhos tratados com embelin. (B), análise por Western blot foi realizada para medir a expressão de VEGF, VEGFR, a COX-2, e IL-8. A β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C), A imuno-histoquímica foi realizada para examinar a expressão de E-caderina, Snail, Slug, ZEB1, MMP-2 e MMP-9 em tecidos tumorais isoladas de controlo e murganhos tratados com embelin. (D), a análise por Western blot foi realizada para medir a expressão de E-caderina, Snail, Slug, ZEB1, MMP-2 e MMP-9. A β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

ciclo-oxigenase-2 (COX-2) sobre-expressão promove a inflamação, proliferação de células endoteliais, metástase e tumorigénese [38]. Nós, portanto, examinar se embelin inibe a expressão de COX-2 em AsPC-1 tumores xenoenxerto. Como shwon na Fig. 6, embelin inibiu a expressão de COX-2 em tecidos de tumor isoladas de ASPC-1 xenoenxertos em relação ao grupo de controlo não tratado. Estes dados sugerem que embelin podem suprimir a inflamação e crescimento de tumor pancreático pela supressão da COX-2.

As citocinas têm sido implicados na iniciação, progressão, metástase e de tumores sólidos e angiogénese [39]. Recentemente, relatou a desregulação da expressão das citocinas e /ou sinalização em câncer pancreático [14], [25], [31]. O eixo do receptor de IL-8 /IL-8 desempenha um papel crucial no crescimento e metástase tumoral, e também modulam microambiente tumoral [39]. Por conseguinte, medida a expressão de IL-8 nos tecidos tumorais isoladas de controlo e os xenoenxertos tratados com embelin. Tratamento de AsPC-1 ratinhos xenoenxertados com embelin resultou em supressão de IL-8 em comparação com o grupo de controlo não tratado (Fig. 6A e B). Estes dados sugerem que a inibição de /IL-8 do eixo receptor de IL-8 podem ser significativas na inibição do crescimento do cancro do pâncreas por embelin.

Embelin inibe Marcadores de epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) AsPC-1 em Xenoenxertos

epitelial-a-mesenquimal de transição e seu processo inverso, mesenquimal-epitelial de transição (MET), desempenham papéis importantes na embriogênese, stemness, a progressão do cancro, metástases e chemoresistance. Várias vias de sinalização e redes de transcrição reguladores podem regular EMT [40]. Uma característica de EMT é a regulação negativa da molécula de adesão celular E-caderina, e a sobre-regulação do marcador mesenquimais N-caderina. Uma variedade de factores de transcrição, incluindo os homólogos de dedo de zinco do caracol (caracol) e factores básicos hélice-laço-hélice, tais como torção, zeb-1, e ZEB2, interagem com o elemento E-box no interior da região proximal da E-caderina promotor. Durante EMT, as MMPs digerir a matriz extracelular e membrana basal e, assim, permitindo que as células para invadir e metástase [41]. Por isso, foram avaliados os efeitos de embelin na expressão de E-caderina, Snail, Slug, ZEB1, MMP-2 e MMP-9 em tecidos tumorais. Tratamento de ASPC-1 ratinhos xenoenxertados com embelin induziu a expressão de E-caderina e inibiu a expressão de MMP-2, MMP-9, Snail, Slug, e Zeb-1 em tecidos de tumor comparado com o grupo de controlo não tratado (Fig. 6 C e D). Os nossos dados demonstram que podem inibir embelin /metástase de tumor pancreático inversa através da indução da expressão de E-caderina e inibindo a sua factores de transcrição associadas (caracol, Slug, e ZEB1) e MMPs (MMP-2 e MMP-9). No geral, nossos dados demonstram que embelin pode um potencial inibidor da metástase cedo.

Embelin Inibe de Sonic Hedgehog Pathways e Up-regula TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5

Shh percurso promove a invasão de células, migração, metástases, crescimento tumoral e por mediar uma rede de sinalização no complexo cancro pancreático [20], [42]. A inibição de Shh via tem sido mostrado para suprimir o crescimento de tumores e metástases. Por isso, procurou examinar os efeitos de embelin em Shh via através da medição da expressão de factores de transcrição e Gli1 Gli2. Gli1 regula a sua própria expressão. Tratamento de AsPC-1 ratinhos xenoenxertados com embelin inibiu a expressão de Gli1 Gli2 e comparado com o controlo não tratado (Fig. 7 A e B). Estes dados sugerem que embelin pode inibir o crescimento tumoral AsPC-1 por via supressora de Shh.

(A), A imuno-histoquímica foi realizada para medir a expressão de Gli1, Gli2, DR4 e DR5 em tecidos tumorais isoladas de controlo e embelin camundongos tenha sido tratada com. (B), análise por Western blot foi realizada para medir a expressão de Gli1, Gli2, DR4 e DR5. A β-actina foi utilizado como um controlo de carga

Demonstrámos que a activação da via do receptor de TRAIL-morte induz a apoptose em células cancerosas [43] -. [45]. Desde TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5 são induzidas pela inibição da actividade de Gli [29], inibidores de Shh pode ser combinar com o ligando TRAIL para induzir apoptose. Por conseguinte, examinou os efeitos de embelin sobre a expressão de TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5 em tecidos tumorais isoladas de AsPC-1 xenoenxertos (Fig. 7 A e B). Tratamento de AsPC-1 portadores de tumor ratos com embelin-regulada a expressão de TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5 em tecidos tumorais em relação ao grupo controle sem tratamento. Estes dados sugerem que embelin pode ser combinado com ligantes de receptores de morte (TRAIL ou anticorpos agonistas) para o tratamento de câncer pancreático.

Embelin inibe o crescimento de células cancerígenas pancreáticas isoladas de Kras

Ratos G12D

mutações Kras são encontrados em cerca de 95% dos adenocarcinomas do ducto pancreático humanos [6]. Estudámos, portanto, os efeitos da embelin nas características de crescimento e vias de sinalização em células de câncer de pâncreas de rato isolados a partir de 10 meses de idade Kras

ratos G12D. células de cancro pancreático foram isoladas a partir de ratinhos e

in vitro

estudos foram realizados para examinar os efeitos biológicos de embelin. Embelin inibiu a viabilidade celular e formação de colónias em células de cancro do pâncreas do rato (Fig. 8A). Para confirmar o papel de Shh, e vias Akt sobre os efeitos anti-proliferativos de embelin, foi medida a expressão de componentes destas vias. Embelin inibiu a expressão de Gli1 e Gli2 e seu alvo a jusante da ciclina D1 em células de cancro do pâncreas do rato (Fig. 8B). Além disso, embelin inibiu a expressão de fosfo-Akt, uma quinase altamente activa no cancro pancreático (Fig. 8C). Estes dados sugerem que embelin pode inibir rato o crescimento do câncer de pâncreas, suprimindo Shh e Akt vias de sinalização.

(A), células de câncer pancreático foram isolados a partir de 10 meses de idade Kras

ratos G12D. As células foram tratadas com embelin (0-5? M) para medir a viabilidade das células e formação de colónias a 2 e 21 dias, respectivamente. * = Significativamente diferente do controlo, P 0,05. (B), células do cancro do pâncreas de rato foram isolados a partir de 10 meses de idade Kras

G12D ratos, e tratou-se com ou sem embelin (3 uM) durante 36 h. No final do período de incubação, proteína bruta foi extraída. análise de Western blot foi realizada para medir a expressão de Gli1 e Gli2. A β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C), células de cancro do pâncreas de rato foram isolados a partir de 10 meses de idade Kras

G12D ratos, e tratou-se com ou sem embelin (3 uM) durante 36 h. A análise por Western blot foi realizada para medir a expressão de phopho-Akt (pAkt) e Akt. A β-actina foi usado como um controle de carga.

Discussão

O câncer de pâncreas é uma das neoplasias malignas mais agressivas e devastadoras. Demonstramos, pela primeira vez, que inibiu embelin viabilidade de linhas celulares de cancro do pâncreas e

In vitro

e AsPC-1 do crescimento do tumor xenoenxertado que foi associado com a supressão da AKT e vias Shh. Além disso, embelin inibiu o crescimento de células cancerígenas pancreáticas isoladas de Kras

camundongos G12D através da supressão da Akt e Shh vias. Estes percursos foram mostrados a desempenhar papéis importantes na carcinogênese pancreática. Embelin inibiu a proliferação de células de tumor e ciclo celular e apoptose induzida. Embelin também inibiu marcadores de angiogénese e metástase. Curiosamente, o tratamento da ASPC-1 ratos xenoenxerto com embelin resultou em aumento da regulação do receptor de morte DR4 e DR5, sugerindo a combinação de embelin com agonistas TRAIL poderia ser uma estratégia viável para tratar o câncer pancreático humano.

O PI3K /Akt sinalização regula a proliferação e sobrevivência celular, e é com frequência e anormalmente ativados no PDAC. No nosso estudo, embelin inibiu a fosforilação /activação de Akt em células de cancro pancreático humano e de ratinho e tecidos. A activação de Kras resulta em fosforilação e activação da Akt quinase. Desde embelin apoptose induzida em células de câncer pancreático que abrigam a mutação Kras suprimindo Akt, sugerindo seus benefícios clínicos contra o câncer pancreático humano, onde Kras é principalmente mutado. Em um estudo recente, a perda de heterozigotos de Pten em Kras ratos mutantes

G12D acelerou o desenvolvimento de acinar-to-ductal metaplasia (ADM), mPanIN e PDAC dentro de um ano [18]. Este estudo sugere fortemente o papel da PTEN /PI3K /Akt e Kras vias de sinalização, tanto a iniciação do câncer de pâncreas e progressão.

Shh é anormalmente expressa em adenocarcinoma de pâncreas e de suas lesões precursoras (pancreáticas intraepiteliais). Pâncreas de ratos PDX-Shh (em que Shh é misexpressed na endoderme pancreático) desenvolver estruturas tubulares anormais, PanIN-1 e -2 [46]. Além disso, estas lesões pancreáticas intraepiteliais também conter mutações K-ras em sobre-expressar e HER-2 /neu, que são mutações genéticas encontradas no início da progressão do cancro pancreático humano. Nós demonstramos recentemente que os componentes da via de Shh são altamente expresso em células humanas do cancro do pâncreas estaminais e linhas celulares de cancro do pâncreas, e vários agentes quimiopreventivos inibiu o crescimento do cancro pancreático [19], [26], [27], [47]. Da mesma forma, no presente estudo, embelin crescimento do tumor AsPC-1 inibido e o crescimento de células do rato PDAC suprimindo Shh percurso. Noutro estudo, demonstrou-se que a inibição da via de Hh diminuição da proliferação celular e a apoptose induzida através da inibição da via PI3K /Akt e cancerosas células estaminais [48]. Além disso, demonstrámos que a inibição da via de sinalização de Shh EMT significativamente inibida por supressão da activação de factores de transcrição Snail e Slug, que foram correlacionadas com a invasão de células estaminais significativamente reduzida cancro pancreático [26], [27], [47], [ ,,,0],49], [50], sugerindo que a via de sinalização do Shh está envolvido na metástase precoce. No geral, estes dados sugerem que a inibição da via de Shh pode ser um potencial alvo molecular de novas estratégias terapêuticas para o cancro pancreático humano.

evidências acumuladas sugerem um papel importante para a COX-2 na patogénese de uma ampla gama de malignidades. A COX-2 é sobre-regulada em PDAC pancreático [38]. De COX-2 na supressão Pdx1 + células progenitoras pancreáticas atrasa de forma significativa o desenvolvimento de PDAC em ratinhos com activação K-ras e Pten haploinsu-. Por outro lado, a COX-2 sobre-expressão promove de início precoce e progressão da PDAC no modelo de ratinho K-ras. Perda da função PTEN é um fator crítico na determinação início PDAC letal e sobrevida global. Mecanisticamente, a sobre-expressão da COX-2 aumenta os níveis de P-Akt nas lesões precursoras de Pdx1 (+); K-ras (G12D) (/+); PTEN (LOX) (/+) ratos na ausência de PTEN LOH. Em contraste, a COX-2 deleção no mesmo ambiente diminui os níveis de P-Akt e progressão do câncer de atrasos. O presente estudo sugere um papel importante intrínseca de células para COX-2 na iniciação e progressão do tumor através da activação da via PI3K /Akt. Na ausência de intrínseca de COX-2, PDAC eventualmente se desenvolve diminuiu com o aumento da expressão FKBP5 e GRP78, duas vias alternativas para a activação de Akt conduz [38]. Portanto, a inibição simultânea de ambas a COX-2 e AKT podem representar uma nova estratégia para o tratamento do cancro pancreático.

As células de tumor EMT submetidos também são conhecidos por aumentar a secreção de factores específicos, incluindo citocinas, quimiocinas e crescimento fatores, que poderia desempenhar um papel importante na progressão tumoral [39], [51]. No presente estudo, embelin inibiu a expressão de IL-8 em AsPC-1 tecidos tumorais. Assim, a IL-8, o bloqueio de sinalização por embelin pode fornecer um meio de inibir ou inverter EMT. Além disso, a inibição da Caracol, Lesma e ZEB-1 expressão e regulação positiva da E-caderina por embelin poderia regular a progressão do câncer de pâncreas através de sua influência sobre a reversão da EMT. Por conseguinte, a inibição da expressão ou função de EMT-indução de factores de transcrição no cancro pancreático é antecipada para conduzir a novas estratégias terapêuticas.

metástase de células do cancro é um processo passo a passo que inclui descolamento das células a partir do tumor primário