Sumário
células-tronco cancerosas (CSCs), uma população rara em qualquer tipo de cancros, incluindo o cancro do cólon, são tumorigénico. Pensou-se que CSCs são responsáveis pela recorrência do câncer, metástase e resistência aos medicamentos. Isolando CSCs em cancros do cólon é um desafio, e, portanto, o mecanismo molecular que regula a auto-renovação e diferenciação de CSCs permanece desconhecida. Nós cultivaram células DLD-1, um dos tipos de células derivadas de cancros do cólon, em meio isento de soro para obter células esferóides. Estas células possuíam as características de CSCs, com a expressão de CD133, CD166, Lgr5 e ALDH1, capacidades superiores de quimio-resistência, migração, invasão e tumorigenicidade
in vitro
e
in vivo
do que as células aderentes DLD-1. Krüppel-like factor 4 (KLF4) é fator essencial para manter a auto-renovação das células-tronco adultas e embrionárias. Ele tem sido usado para induzir as células estaminais pluripotentes (IPS) a partir de células somáticas. Desde KLF4 é expresso em células de cancro do cólon, foi investigado o seu papel em células esferóides isoladas a partir de células DLD-1 e verificaram que KLF4 foi sobre-expressa apenas em células esferóides e redução da expressão de KLF4 por ARN curto-hairpin diminuiu significativamente as capacidades destas células para resistir aos produtos químicos, migram, invadem, e gerar tumores
in vitro
e
in vivo
. As células de esferóide com expressão reduzida KLF4 também tinha diminuído de expressão CSCs marcadores e marcadores mesenquimais. Tomados em conjunto, a cultura de células DLD-1 em meio enriquece CSCs e a expressão de KLF4 é essencial para as características de CSCs em DLD-1 isento de soro; assim KLF4 pode ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento de câncer de cólon
Citation:. Leng Z, Tao K, Xia Q, Tan J, Yue Z, Chen J, et al. (2013) Krüppel-Like Fator 4 Atos como um oncogene em Stem Cells cancro do cólon celular enriquecido Spheroid. PLoS ONE 8 (2): e56082. doi: 10.1371 /journal.pone.0056082
editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 07 de dezembro de 2012; Aceito: 03 de janeiro de 2013; Publicação: 13 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Leng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Estadual de Ciências naturais da República Popular da China 81071541 /H1504 (a HZ) [https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm]. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de data, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do cólon é a causa comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1], [2]. As terapias correntes, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia, foram concebidos para atingir todas as células de tumor. O sucesso destas terapias é severamente dificultados devido principalmente à existência de células de tumor resistente à terapia, que são capazes de desenvolver a todo o cancro do cólon após terapias [3]. foi Pensa-se que estas células são células estaminais cancro (CSCs), que têm capacidade de auto-renovação e diferenciação para todos os tipos de células do cancro do cólon [4]. CSCs existem em vários tipos de cânceres. Eles são raros em cancros, mas muito tumorigénico e também responsável pela progressão do cancro. Quando transplantadas em ratos imunodeficientes, CSCs mostram alta tumorigenecity. Também tem sido demonstrado que os CSCs são as células responsáveis pela recorrência de cancro, metástase, e resistência a drogas [5], [6]. Portanto, uma terapia eficaz para o tratamento de um cancro obriga a visar eficazmente CSCs no cancro [7].
CSCs em vários tipos de cancros possuem marcadores de superfície específicos, que permitem aos cientistas isolá-los. No cancro do cólon, CSCs são positivos para CD133 +, CD44 +, CD166, Lgr5, ALDH1 e ESA. CSCs do cólon também têm capacidade de expelir Hoechst 33342 dye [8] – [19]. No entanto, os CSCs são muito raros, e, em muitos casos, eles não podem ser detectados. Assim, o isolamento de CSCs em cancros do cólon com base nos seus marcadores de superfície torna-se extremamente difícil [20].
CSCs em algumas linhas celulares de cancro, incluindo cancros do cólon, pode ser isolado por meio de cultura de células em meio isento de soro para formar esferas. Nesta condição, as células que expressam Spheroid, “stemness” genes relacionados e possuem elevada capacidade para migrar, invadir, e gerar tumores [20], [21], [22], [23]. No meio isento de soro, muitas linhas celulares de cancro do cólon humano, incluindo HCT116, HT29, LaVO, SW480 e linha de células DLD-1, podem formar esferas [22].
Os mecanismos pelos quais CSCs de vários tipos cancros de manter a sua “stemness” têm sido extensivamente estudados. A capacidade de auto-renovação é crucial para CSCs manutenção e para a recorrência do câncer [12], [23], [24], [25], [26], [27] KLF4 é essencial para manter a característica de CSCs e necessário para a capacidade de migrar e invadir no cancro da mama [28]. Muitos grupos relataram que o KLF4 é expressa e funciona como um supressor tumoral no cancro do cólon [29], [30], [31], [32]. No entanto, conforme relatado, as células de tumor a granel são incapazes de gerar novas células. Enquanto CSCs pode regenerar todos os tipos de células no tumor através do seu comportamento de células-tronco e como fazer com que a recidiva do cancro [6]. Assim, CSCs e o grosso das células cancerosas são extremamente heterogêneo. Esses estudos não distinguem CSCs cólon a partir das células cancerosas em massa.
KLF4 é um fator de transcrição dedo de zinco. Tem sido demonstrado que KLF4 regula a proliferação, a diferenciação, a apoptose, e o metabolismo de células do cólon e thymocyto taça, respectivamente [33], [34]. Em murino, KLF4 é essencial para a auto-renovação das células estaminais embrionárias [35]. KLF4 também é usado para reprogramar fibroblastos de rato para células estaminais pluripotentes, o que implica o papel de KLF4 quanto à manutenção das características de células estaminais [36]. É importante ressaltar que as células-tronco normais demonstrar características comuns a células-tronco do câncer, ele também será importante para determinar se a regulamentação semelhante ocorre em células estaminais e células-tronco cancerosas. Assim, se KLF4 é expressa em CSCs do cólon e suas funções de KLF4 em câncer de cólon precisam ser abordadas.
Neste estudo, nós exploramos os potenciais papéis de KLF4 em células esferóides CSCs enriquecidas. Nós células cultivadas primeira DLD-1 em meio livre de soro para obter células esferóides que possuam as características de CSCs, em seguida, foi perguntado se KLF4 foram sobre-expressos em células esferóides e se reduzida expressão KLF4 em células esferóides iria perturbar as suas características.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia (número de autorização: S255). Todos cirurgia foi realizada sob uma mistura de cetamina e clorpromazina anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
Linhas Celulares
linhas celulares de cancro do cólon humano DLD-1, SW480, SW620, LaVO e do cólon humano linha de células epitélio normal FHC eram de fontes comerciais, e a forma de cada linha celular foi decidido de acordo com a American Type Culture Collection (ATCC) ou para a referência publicada. DLD-1, as células SW620 e SW480 foram cultivadas em RPMI 1640 (Hyclone) meio completo [37]. Outras linhas celulares de cancro do cólon, HCT116 e HT29 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Liu e foram cultivados em 5A de McCoy (Sigma) meio completo [38]. células FHC epitélio normal do cólon humano foram cultivadas em DMEM /F12 (Hyclone) meio completo. células LOVO foram cultivadas em DMEM (Hyclone) meio completo [39].
A cultura esfera foi realizada tal como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, cada linha de células de cancro do cólon foram cultivadas a uma densidade de 2 × 10
6 células /ml em meio DMEM /F12 isento de soro contendo 20 ng /de factor de crescimento epidérmico ml (EGF, PeproTech), 10 ng /mL Fator de crescimento básico (bFGF, PeproTech), 5 ug /ml de insulina (Sigma), 0,4% de albumina de soro bovino (Amresco), e 2% B27 (Invitrogen). Para esferas de passagem, foram coletadas-los por centrifugação a 73 g por 5 minutos. As esferas foram dissociadas de células isoladas usando digestão de tripsina. esferóides de células isoladas foram cultivadas como descrito acima. Todas as células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO2.
Isolamento de células CD133 + e CD133-
CD133 + e células CD133- foram isolados a partir de cultura de células por selecção esférulas magnéticas utilizando o sistema de MACS (Miltenyi Biotech) ou por FACS [12], [40]. Para ambas as separações, as células foram incubadas com o anticorpo monoclonal de CD133 /2-PE (Miltenyi Biotech) durante 15 min a 4 ° C. Para a separação magnética, as células foram seleccionadas por colunas MS (Miltenyi Biotech), que retiveram células positivas ligadas por grânulos. Para a separação por FACS, as células coradas CD133 /2-PE, foram classificados com o instrumento BD FACSCanto Citómetro de Fluxo II (BD Bioscience), e o isotipo IgG2b (Miltenyi Biotech) foi utilizado como controlo.
Lentivirus Infecção de esferoidal células
vectores lentivirais que ostentam KLF4 shRNA (NM004235.3, 1582-1610) ou um não-alvo mexidos shRNA foram adquiridos a partir de Xangai GeneChem Co., Ltd. as células foram infectadas esferóides de acordo com as instruções do fabricante.
-PCR em tempo real
total de ARNm foram extraídos a partir de células e, em seguida, inversamente transcritos para ADNc com PrimeScript TA mistura de PCR (Takara, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Para medir os níveis de ARNm de genes em cada amostra, foi utilizado em tempo real baseada em PCR intercalador. O gliceraldeído-3-phpsphate-desidrogenase (GAPDH) foi usada como um controlo interno. O PCR em tempo real foi realizado com SYBR Verde Mistura Mestre (Takara, Japão) no sistema de PCR em tempo real StepOnePlus ™ (Applied Biosystems, EUA). A amplificação por PCR dos genes foi realizada sob as condições: desnaturação a 95 ° C durante 30 s, recozimento a 60 ° C durante 60 s, e estendido a 95 ° C durante 5 s; as reacções foram efectuadas durante 45 ciclos. Para cada amostra, as reacções foram duplicadas e o nível médio de ARNm de cada gene foi determinada utilizando o
-ΔΔCt método 2. Os pares de primers para medir os níveis de cada gene são listadas na Tabela S1.
Imunofluorescência Coloração
As manifestações de CD133, KLF4, E-caderina e vimentina em células monocamada e esferas também foram analisada com a técnica de imunofluorescência. Para realizar a análise de imunofluorescência, as células foram cultivadas em meio apropriado para lamelas de vidro-para 16 horas antes fixados com paraformaldeído a 2% a 37 ° C durante 15 min. As células fixadas foram então permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 15 min, seguido por incubação a 4 ° C durante a noite com os seguintes anticorpos primários: CD133 /2 (Miltenyi Biotec), E-cadherine (Santa Cruz Biotec), vimentina (celular tecnologia de sinalização), e KLF4 (Santa Cruz Biotec), respectivamente. No dia seguinte, as células foram então incubadas com PE- ou anticorpo secundário conjugado com FITC (Boster) à temperatura ambiente durante 1 hora. Estas lâminas foram então montadas com Prolong ouro com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Invitrogen). As imagens fluorescentes foram feitas usando Olympus IX71 epifluorescência (Olympus, Japão).
Análise Western Blot
Os extractos de proteína foram separados por electroforese em várias concentrações de géis de SDS-poliacrilamida dependendo dos tamanhos esperados de medidos proteínas e transferido para membranas de PVDF (Millipore, EUA). Depois bloqueou-se com 5% de leite magro e 0,1% de Tween 20 em TBS durante 1 h, a membrana foi então incubada a 4 ° C durante a noite com os anticorpos primários seguido de incubação com os anticorpos secundários anti-coelho de cabra. Os anticorpos primários utilizados nesta análise são: coelho anti-E-caderina, coelho anti-vimentina, coelho anti-ZO-1, e coelho anti-Snail (Cell Signaling Technology); de coelho anti-KLF4 e de coelho anti-Lgr5 (Santa Cruz Biotec).
A quimioterapia Sensibilidade e resistência Ensaio
A sensibilidade das células de cancro do cólon em 5-FU foi analisada utilizando CCK-8 kit de ensaio (DOJINDO, technolonies moleculares, Inc, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 2.000 células foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços contendo meio de crescimento suplementado com várias concentrações de 5-FU (Sigma) e incubados a 37 ° C e 5% de CO
2 num estado húmido durante 48 horas. A absorção de cada cavidade foi lida a 450 nm num leitor de placas. A taxa de sobrevivência das células foi calculada como se segue:. Absorção de experimento /absorção de controlo x 100%
Anexina V-APC /PI Duplo Rotulagem
células foram recolhidos, lavados com fosfato tamponado solução salina (PBS) e coradas com anexina V-APC (Keygen, China) e PI (Sigma), ambos durante 30 min à temperatura ambiente no escuro de acordo com as instruções do fabricante. Todas as células coradas foram depois examinadas usando instrumento BD FACSCanto Citómetro de Fluxo II (BD Bioscience).
agar mole Ensaio
ensaio de agar mole foi realizado para células de esferóide conforme previamente descrito [41]. Resumidamente, a cada poço de uma placa de 6 poços foi carregado com 2 mL de 0,5% de agar (w /v) em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% como base. Após a polimerização da base de agar, 1 × 10
4 células misturadas em 2 mL de 0,375% de agar (w /v) em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% foram adicionados. As culturas foram mantidas num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO
2 de 2 semanas antes colónias foram contadas e fotografadas.
Ensaio de Formação de Colónias
ensaio de formação de colónias foi realizada durante células aderentes DLD-1 como previamente descrito [27]. Resumidamente, as células individuais (2.000 células por poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 2 semanas. Depois de coradas com violeta, as células foram fotografadas e analisadas quanto à sua proliferação e formação de colónias eficiência. Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes.
A migração celular e invasão Ensaio
Migração e ensaio de invasão foi realizada tal como descrito anteriormente [42]. Resumidamente, 10
6 células foram plaqueadas em cultura de células insere com 8 uM filtros microporosos (BD Bioscience) revestidas com (invasão) ou sem (migração) Matrigel (Sigma) e incubados durante 20 h, respectivamente. As células que migraram ou invadidas foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas em cinco campos aleatórios. As experiências foram realizadas em triplicado.
In vivo
Tumorigênese
As células foram obtidas por esferas colhidas tripsina. Várias quantidades de células (1 × 10
4, 5 × 10
4, 1 × 10
5, 5 × 10
5, ou 1 × 10
6 células) em 200 ul PBS foram transplantados subcutaneamente em 4 a 6 semanas de idade do sexo feminino atímicos, Balb /c nu /nu camundongos (Beijing HFK Bioscience). O tamanho do tumor foi medido a cada 4 dias utilizando um compasso de calibre. O volume de cada tumor foi determinada utilizando a seguinte fórmula: comprimento x largura
2 × 0,5. Todo o trabalho animal tinha sido conduzido de acordo com o guidline da Comissão de Ética da Universidade Huazhong da Ciência e Tecnologia (S255). Os ratos foram alojados em um estabelecimento de ambiente controlado livre de patógenos específicos. Os ratinhos foram sacrificados com injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio e os enxertos foram retirados quando os tumores atingiram um comprimento de 2,0 cm, ou 60 dias após a injecção, quando foi pela primeira vez [41]. tumores colhidos foram preparadas para análise histopatológica.
A análise histopatológica
Os tumores foram colhidos e fixados em formalina a 4% durante 24 horas antes embutidos em parafinas. Secções (2,5 uM) foram obtidos e corados com H E. As imagens foram tiradas com a Olympus IX71 (Olympus, Japão).
Análise Estatística
Cada experiência foi realizada pelo menos três ensaios independentes. Os resultados foram expressos como a média ± DP. As análises estatísticas foram realizadas utilizando um Student
t
-teste, onde
P
. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
Geração de Células Spheroid a partir de linhas celulares de cancro do cólon
estudos anteriores mostraram células HCT116 e de cancro do cólon HT29 formar esferas quando cultivadas em meio isento de soro e as células esferóides possui as características de CSCs [22], [43], [44]. Nós perguntado se HCT116, células HT29, SW620, SW480, LOVO, e DLD-1 poderia formar esferas quando cultivadas em meio sem soro, respectivamente. As células de cada linha de células foram cultivadas a uma densidade de 2 × 10
6 /ml em meio isento de soro. No dia 3, podemos ver a formação de esfera de HCT116, HT29, SW620, LOVO, e DLD-1, mas não a partir de SW480 (Figura 1 e os dados não mostrados). As esferas aumentado em tamanho ao longo do tempo. Além disso, as células esferóides nas esferas pode ser passado para mais de 25 vezes sem perda de quaisquer características testadas abaixo, indicando que eles podem possuir capacidade de se auto-renovar. Como as células DLD-1 formam esferas mais facilmente do que outras linhas de cancro do cólon testados anteriormente, nós só usamos focada em células DLD-1 nos seguintes experimentos. Para nossa descrição conveniente, nós designado as células esferóides de DLD-1 como DLD-S.
HT29, HCT116, as células SW620, LoVo e DLD-1 poderia formar redonda grande, colonsphere flutuante solta da 50-100 M, quando cultivadas em SFM (como mostrado no grupo DLD-1). Enquanto SW480 não podia.
caracterização de células Spheroid
O primeiro perguntado se DLD-S expressaram os marcadores de superfície de CSCs de cancro do cólon e os genes do núcleo de células-tronco. Descobrimos que a expressão dos genes nucleares de células estaminais tal como Oct4 /3, Sox2 e Nanog e os genes marcadores de CSCs do cólon, tais como CD133, CD166, Lgr5, e ALDH1 foram aumentados em células DLD-S quando comparada com a sua expressão níveis em DLD-1 (Figura 2A), sugerindo que as células esferóide pode ter alta porcentagem de CSCs.
(A) a expressão de CD133, CD166, Lgr5, ALDH1 e resultam genes do núcleo celular Oct4 /3, Sox2 e Nanog em células esferóides foram regulados positivamente em relação ao DLD-1 células aderentes. (B) mais células esferóides foram, obviamente, observados em comparação com as suas células paternas DLD-1, analisados utilizando Transwell migração e invasão de ensaio, respectivamente. (C) tal como avaliado por ensaio de agar mole e ensaio de formação de colónia, os esferóides células apresentam maior capacidade de formação de colónias. (D) Tal como avaliado pelo ensaio de CCK8, a taxa de sobrevivência de células do esferóide é aumentada em comparação com células aderentes em várias concentrações de 5-FU. (E) conforme avaliado pelo modelo de xenoenxerto mouse, as células esferóide tinha maior capacidade tumorigénica do que suas células-mãe DLD-1. * P . 0,05
, em seguida, investigou o perfil maligna de células DLD-S, incluindo a sua capacidade para migrar e invadem, para formar colónias, para responder ao 5-FU, e gerar tumores em ratinhos imunodeficiência. Usando transpoço ensaio de migração /invasão, descobrimos que as células DLD-S teve significativamente maior capacidade de migrar e invadir inserções Matrigel-revestidas do que suas células-mãe, DLD-1, fez (Figura 2B).
Usando o ágar mole ensaio e ensaio de formação de colónia, descobrimos que DLD-S apresentaram maior capacidade de formação de colónia significativa do que suas células-mãe, DLD-1 (Figura 2C).
para testar a sensibilidade dos DLD-S à quimioterapia, nós tratados células com 5-FU a diferentes concentrações. As taxas de sobrevivência de DLD-S e DLD-1 em meio de crescimento com mesma concentração de 5-FU foram comparados, e descobrimos que DLD-S teve significativamente maior taxa de sobrevivência em concentrações testadas de 5-FU do que suas células-mãe, DLD- 1 células fez, indicando que DLD-S foram mais resistentes à quimioterapia (Figura 2D).
Finalmente, nós investigamos a capacidade tumorigénica de células DLD-S
in vivo
. Vários quantidade de DLD-S ou DLD-1 (1 × 10
4, 5 × 10
4, 1 × 10
5, 5 × 10
5, ou 1 × 10
6) As células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos Balb /c nu /nu e os ratos com a formação de tumores foram contadas aos 60 dias após o transplante de células. Descobrimos que as células DLD-S tinha capacidade tumorigénica maior do que suas células-mãe, DLD-1 (Tabela S2). Um rato transplantados com 1 × 10
5DLD-S ou DLD-1 células em 60 dias foi mostrado na Figura 2E.
Populações Expressão da KLF4 em células cancerígenas do cólon e CSCs enriquecidas
o primeiro tentou acessar para confirmar que as expressões de KLF4 em várias linhas celulares de cancro do cólon foram menores do que as linhas de células epiteliais do cólon normais como relatado anteriormente [45]. Os níveis de expressão de KLF4 em SW620, HT29, SW480, HCT116, DLD-1, e linhas celulares de cancro de cólon humano LOVO, bem como FHC, uma linha de células epiteliais do cólon normal, foram analisados por meio de PCR em tempo real e análise de transferência de Western. Como esperado, o KLF4 foi expressa em todas as linhas celulares testadas e os níveis de ARNm (Figura 3A) e os níveis de proteína (Figura 3B e 3C) nestas linhas celulares de cancro foram significativamente menores do que a linha de células de CSF.
(a) tal como avaliado por PCR em tempo real, a expressão de KLF4 em várias linhas celulares de cancro de cólon foi significativamente mais baixo do que a linha de células epiteliais do cólon normal. (B e C) Como avaliado por Western-blot, a expressão de KLF4 em várias linhas celulares de cancro de cólon foi significativamente mais baixo do que a linha de células epiteliais do cólon normal. (D) A expressão de KLF4 foi significativamente maior do que em células de esferóides em DLD-1, HT29, células aderentes HCT116, tal como avaliado por PCR em tempo real e Western-blot, respectivamente (como se mostra no grupo DLD-1). (E) tal como avaliado por PCR em tempo real, a expressão de KLF4 foi significativamente maior em células CD133 + de CD133 em células de DLD-1. * P . 0,05
, em seguida, comparados os níveis de expressão em células de KLF4 esferóides e células aderentes de DLD-1, HT29, e as células HCT-116, e descobriram que os níveis de mRNA e proteína de KLF4 eram significativamente maior em células de esferóide do que em células aderentes (Figura 3D e data não mostrado). Nós classificados mais CD133 + e células CD133- a partir de células DLD-1 por tecnologia MACS separação e medidos os níveis de ARNm em ambos os subgrupos de células DLD-1, utilizando PCR em tempo real. Observou-se que o nível de ARNm de KLF4 foi significativamente maior em células CD133 + do que em células CD133- (Figura 3E). A expressão de CD133 e KLF4 em células DLD-S foi adicionalmente confirmada por coloração de imunofluorescência (Figura 4). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que KLF4 é mais provável expressa em células de esferóides DLD-1 derivadas CD133 + subpopulação e, o que enriqueceu CSCs, desafiando a conclusão prévia de que as funções KLF4 como um supressor tumoral na progressão do cancro do cólon.
análise por imunofluorescência confirmando a presença de CD133 e KLF4 em células DLD-1 e DLD-S, o núcleo está corado com DAPI.
Knockdown da expressão do KLF4 em células Spheroid alteraram suas stemness
em seguida, perguntou se KLF4 é essencial para a auto-renovação e /ou o perfil maligna das células esferóides de DLD-1. Para este efeito, foram geradas DLD-S siKLF4 infectando células DLD-S com KLF4-shRNA vetor lentiviral e o SICON DLD-S infectando células DLD-S com o não-alvo shRNA vector lentiviral. Em primeiro lugar, examinou a apoptose de células DLD-S SICON e DLD-S siKLF4 para excluir a possibilidade de que a capacidade diminuída de quimio-resistência, a migração, a invasão e a tumorigenicidade das células siKLF4 DLD-S era devido ao aumento da apoptose por derrubar expressão KLF4 e descobriram que a taxa de sobrevivência foi semelhante entre ambos DLD-S SICON e células DLD-S siKLF4 (Figura 5A). Em seguida, estudou-se o ARNm e os níveis proteicos de KLF4 nestas células DLD-S infectadas virais e descobriu que tanto de ARNm e de proteína dos níveis de KLF4 foram significativamente mais baixos em células DLD-S siKLF4 do que em células DLD-S SICON (Figura 5B), sugerindo que a expressão do gene KLF4 foi batido com sucesso para baixo.
(A) A taxa de sobrevivência foi semelhante entre ambos DLD-S SICON e células DLD-S siKLF4 como avaliado por ensaio anexina-V APC /PI Duplo Rotulagem. (B) A expressão de KLF4 foi eficientemente derrubar em células DLD-S. (C) Citometria análises de células CD133 +. A fração CD133 + diminuiu significativamente após derrubar KLF4 em células DLD-S. (D) A expressão de CD133, CD166, Lgr5, ALDH1 e foi significativamente inferior em DLD-S do que em siKLF4 DLD-S SICON. (E) cultivadas em SFM, as células DLD-S siKLF4 formado pequenas esferas com uma frequência significativamente menor do que as células DLD-S SICON fez. * P . 0,05
Em seguida, perguntou se knockdown de expressão KLF4 em DLD-S alterou a sua expressão do gene CSC-marcador usando análise FACS, PCR em tempo real e análise de Western blot. Verificou-se que o número de células CD133 + é significativamente mais baixa em células DLD-S siKLF4 do que em células DLD-S SICON (Figura 5C) e a expressão de todos os genes CSC-marcadores, incluindo CD133, CD166, Lgr5, e ALDH1, significativamente inferior em DLD-S do que em siKLF4 DLD-S SICON (Figura 5D). Finalmente, foi perguntado se knockdown de KLF4 afetou a auto-renovação da DLD-S. Quando cultivadas em meio isento de soro, as células DLD-S siKLF4 formadas pequenas esferas com uma frequência significativamente mais baixa do que as células DLD-S SICON fez (Figura 5E), o que sugere que KLF4 é essencial para a auto-renovação das células DLD-S.
knockdown da expressão do KLF4 alterou o perfil maligna das células Spheroid de DLD-1 células
Nós investigou também se knockdown de expressão KLF4 em DLD-S iria alterar o seu perfil maligno, comparando a capacidade de DLD-S siKLF4 e DLD-S SICON a migrar e invadem, para formar colónias, para responder ao 5-FU, e gerar tumores em ratinhos imunodef iciência. Em primeiro lugar, usando transpoço ensaio, descobrimos que a DLD-S siKLF4 migraram e invadiu significativamente mais lento do que as células DLD-S SICON (Figura 6A). Em segundo lugar, testou-se as taxas de sobrevivência das células DLD-S siKLF4 em meio de crescimento com 5-FU e descobriram que a DLD-S siKLF4 tinham menores taxas de sobrevivência significativas do que as células DLD-S SICON (Figura 6B). Em terceiro lugar, utilizando um ensaio de agar macio e ensaio de formação de colónia, descobrimos que as células DLD-S siKLF4 formada número significativamente menor de colônias e colônias menores do que o DLD-S SICON (Figura 6C). Por fim, foi utilizado o modelo de xenoenxerto mouse para perguntar se KLF4 é necessário para
in vivo
tumorigénese de células DLD-S CSC-enriquecido. Um milhão de células DLD-S siKLF4 ou o SICON foram injectadas subcutaneamente em cada Balb /c nu /nu de rato, respectivamente. Descobrimos que os tumores foram formados em murganhos transplantados com células DLD-S SICON anterior e significativamente maiores do que em murganhos transplantados com células DLD-S siKLF4 (Figura 6D). Por exemplo, a injeção de células pós dia 56, os tumores em ratos que receberam DLD-S SICON cresceu a uma média de 1256.52 mm
3 de volume, enquanto os tumores em ratos que receberam DLD-S siKLF4 cresceu apenas a média de 374.11 mm
3. A histologia de tumores de xenoenxerto foi examinado por coloração HE. Não houve diferença histológica significativa entre DLD-S SICON e grupos DLD-S siKLF4 (Figura 6E). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o knockdown de expressão KLF4 em células DLD-S prejudicou a capacidade destas células para migrar, invadir, resistir a 5-FU, e gerar tumores.
(A) DLD-S siKLF4 migrado e invadiu significativamente mais lento do que as células DLD-S SICON, avaliada pelo transpoço ensaio. (B) Como avaliada pelo ensaio CCK8, DLD-S siKLF4 tinham taxas de sobrevivência significativamente menores do que as células DLD-S SICON em várias concentrações de 5-FU. células (C) DLD-S siKLF4 formada número significativamente menor de colônias e colônias menores do que o DLD-S SICON. (D e E), as células DLD-S SICON formado tumores anteriormente e significativamente maior do que em murganhos transplantados com células DLD-S siKLF4. Não houve diferença histológica significativa entre DLD-S SICON e grupos DLD-S siKLF4. ampliações originais × 200. * P . 0,05
derrubando KLF4 Expressão Suprime transição epitelial-mesenquimal em Células Spheroid
epitelial-mesenquimal transição processo (EMT) está intimamente relacionado com o recurso metastático de células cancerosas [46], [47]. As células cancerosas que exercem processo EMT expressar genes mesenquimais, tais como Vimentin, caracol e lesma, enquanto as expressões de genes marcadores epiteliais, como a E-caderina e ZO-1 diminuem. Estas células também têm perfil maligno semelhante como CSCs ou células iniciadoras de câncer de fazer. Em primeiro lugar, demonstrou que, ao contrário das células DLD-1, DLD-S expressa um típico marcador epitelial, E-caderina e um marcador mesenquimais típico, vimentina por imunofluorescência e em tempo real A análise de PCR (Figura 7A e 7B), sugerindo que DLD-S possuía as características de células que passam por EMT. Em seguida, compararam a expressão de marcadores epiteliais e mesenquimais entre as células DLD-S siKLF4 e DLD-S SICON e descobriram que as células DLD-S siKLF4 tinham níveis mais elevados de proteína significativas de ZO-1, mas os níveis de proteína inferior significativas de E-caderina e vimentina que DLD-S SICON (Figura 7C). Curiosamente, a expressão de caracol foi semelhante entre ambos DLD-S siKLF4 e DLD-S SICON. Estes resultados sugerem que KLF4 é necessário para promover processo de EMT em células do cólon esferóides.
(A) Análise por imunofluorescência em células DLD-S SICON e DLD-S siKLF4 para E-caderina e vimentina, núcleo é corado com DAPI . (B) como avaliado por Real-time PCR células, DLD-S teve significativos maior níveis de mRNA de E-caderina, vimentina e Caracol. A expressão de ZO-1 foi diminuída. células (C) DLD-S siKLF4 tinham níveis significativos de proteína mais elevado de ZO-1, mas níveis mais baixos de proteína significativas de E-caderina e vimentina que DLD-S SICON. A expressão de caracol foi semelhante entre eles. * P . 0,05
Discussão
Neste estudo, nós fomos capazes de enriquecer CSCs de várias linhas celulares de cancro do cólon através da cultura deles em meio isento de soro. As esferas formadas no meio isento de soro continham células esferóides, que possuía características de CSCs do cólon: em primeiro lugar, estas células apresentaram uma alta expressão de genes marcadores de CSCs do cólon e as células-tronco (Figura 2A); Em segundo lugar, estas células eram mais características malignas do que as suas células parentais DLD-1 (Figura 2b, 2c, e 2d); Finalmente, essas células apresentaram aumento tumorigenicidade quando transplantados subcutaneamente em ratinhos imunodeficientes (Figura 2E). Outros também utilizado um sistema de meio isento de soro para obter esferas CSCs enriquecido de HCT116, linhas celulares de cancro do cólon HT29 [22], [43], [44]. É importante ressaltar que este método CSCs-enriquecedora não é adequado para todas as linhas de células de cancro do cólon. Por exemplo, em nosso estudo, não foram capazes de enriquecer esferas de SW480 utilizando este método.
Nós também concluiu que KLF4 foi necessário para as características de CSCs do cólon. Em primeiro lugar, foi KLF4 só é altamente expresso em células de esferóides CSC-enriquecidos de DLD-1, HCT116, HT29, células CD133 + e células isoladas a partir de células DLD-1 (Figura 3D, 3E, e data não mostrado). Em segundo lugar, derrubando a expressão KLF4 em células DLD-S reduziu o número de células CD133 + e reduziu os níveis de genes marcadores de células-tronco de câncer de cólon (Figura 5C e 5D) e as células de expressão não pode efetivamente formar esferas em meio isento de soro ( Figura 5E). Em terceiro lugar, as células DLD-S com a diminuição da expressão KLF4 mostrou capacidade avariado para migrar, invadir, resistir ao 5-FU, e gerar tumores (Figura 6A, 6B, 6C, 6D e 6E).