Patient-Derived

Abstract

Atualmente, há um enorme interesse no desenvolvimento de terapias anti-câncer alvo de células vias importantes tanto para o metabolismo das células de câncer e crescimento sinalização. Vários estudos epidemiológicos têm mostrado que pacientes diabéticos que tomam metformina têm uma diminuição da incidência de câncer no pâncreas. Isso levou esforços para avaliar a metformina, uma droga com toxicidade insignificante, como uma modalidade terapêutica no cancro pancreático. Estudos pré-clínicos em xenoenxertos de linhas celulares e um estudo em modelos derivados do paciente de xenotransplante (PDX) foram promissores, enquanto que os ensaios clínicos publicados recentemente mostraram nenhum benefício para a adição de metformina para esquemas de terapia de combinação para o câncer de pâncreas localmente avançado e metastático. PDX modelos em que os tumores do paciente são directamente enxertados em ratinhos imunocomprometidos têm demonstrado ser excelentes modelos pré-clinicos para a descoberta de biomarcadores e desenvolvimento terapêutico. Avaliou-se a resposta de quatro linhas de tumor PDX para tratamento com metformina e descobriu que todos os nossos quatro linhas PDX eram resistentes a metformina. Verificou-se que os mecanismos de resistência pode ocorrer devido à falta de activação sustentada de adenosina-quinase activada por monofosfato de proteína (AMPK) ou reactivação a jusante do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). Além disso, o tratamento combinado com metformina e inibidores de mTOR não conseguiu melhorar as respostas de linhas de células, o que indica ainda que a metformina por si só ou em combinação com inibidores de mTOR será ineficaz em pacientes, e que a resistência à metformina pode ocorrer através de múltiplas vias. Mais estudos são necessários para entender melhor estes mecanismos de resistência e informar potenciais terapias de combinação com metformina e existentes ou novas terapias

Citation:. Lipner MB, Marayati R, Deng Y, Wang X, Raftery L, O’Neil BH, et ai. (2016) Metformina tratamento não inibir o crescimento do câncer de pâncreas xenoenxertos Derivado-paciente. PLoS ONE 11 (1): e0147113. doi: 10.1371 /journal.pone.0147113

editor: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, Canadá |

Recebido: 25 de julho de 2014; Aceito: 29 de dezembro de 2015; Publicação: 13 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Lipner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:.. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Lineberger Comprehensive Cancer Center (BHO) e CA140424 e CA193650 (JJY) do Instituto Nacional do Câncer

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma das neoplasias mais agressivos e letais, com 80% dos pacientes com localmente avançado ou doença metastática que prenuncia uma sobrevida média de 6-12 meses e uma taxa de dismal 6% sobrevida em cinco anos [1]. A quimioterapia produz apenas melhorias modestas na sobrevivência, e novas terapias são desesperadamente necessários para melhorar as opções de tratamento para esta grande população de pacientes [2]. Não existe actualmente um interesse muito grande no desenvolvimento de agentes terapêuticos anti-cancerígenos que têm como alvo vias de sinalização celulares importantes, quer no crescimento e metabolismo celular de células [3]. 5 ‘da proteína quinase (AMPK) via ativada por monofosfato de adenosina ganhou interesse crescente, como AMPK fisiologicamente inibe o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) para manter a homeostase em condições de diminuição das fontes de energia celular disponíveis [4, 5]. Estudos têm demonstrado que a sinalização mTOR desempenha papel fundamental na sobrevivência e proliferação de células malignas [6, 7]. Assim, ativadores de AMPK têm gerado um interesse substancial como potenciais agentes antineoplásicos que funcionam alterando o metabolismo e inibição da via mTOR [3].

A metformina é o agente de primeira linha para o tratamento de diabetes mellitus tipo 2. A metformina inibe a fosforilação oxidativa mitocondrial, aumentando deste modo o rácio de AMP em ATP [8, 9]. Altos níveis de AMP ativar a AMPK, que, em seguida, inibe as vias de consumo de energia, tais como a síntese de proteínas, em parte, pela regulação negativa de sinalização mTOR por fosforilação directa do supressor de tumor TSC2 e o parceiro de ligação de mTOR rapina [9-13]. O estado de conservação de energia induzida pela metformina tem sido propostos para explicar o efeito citostático da metformina sobre o cancro [9] e do aparente efeito protetor observado em pacientes diabéticos tratados com metformina, que posteriormente desenvolver câncer pancreático [14].

vários estudos epidemiológicos têm indicado que os pacientes com diabetes tomar metformina têm uma diminuição da incidência de câncer de pâncreas [14-17]. Isso fez com que uma grande quantidade de emoção para avaliar a metformina, uma droga amplamente utilizada com toxicidade insignificante, como uma modalidade terapêutica no cancro pancreático. Atualmente 3 estudos clínicos que avaliaram a metformina em combinação com várias quimioterapias em câncer pancreático (cancer.gov/clinicaltrials). promessa Estudos pré-clínicos em xenoenxertos da linha de células e um estudo recente em xenoenxerto derivado de paciente modelos (PDX) têm mostrado [18-22].

PDX modelos em que os tumores do paciente são directamente enxertados em ratinhos imunocomprometidos demonstraram Recapitulando arquitetura tumor primário e das características genéticas, mesmo depois passaging e expandindo os tumores em gerações sucessivas de ratos [23, 24]. Além disso, os modelos de PDX são superiores aos tradicionais xenoenxertos da linha de células, que estão adaptadas para crescimento in vitro e não possuem a heterogeneidade de tumores de pacientes, para avaliar as respostas para as terapias e novos biomarcadores [23-27]. Até recentemente, tem havido estudos muito limitadas de respostas PDX para muitos agentes oncológicos proposto e resultados para terapias metabólicas, como a metformina ainda estão faltando severamente [27]. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a resposta de modelos PDX do cancro do pâncreas à metformina e investigar o mecanismo de metformina de ação e resistência compensatória vias.

Materiais e Métodos

Drogas e reagentes

O cloridrato de metformina (Spectrum, New Brunswick, NJ, EUA) foi dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante tanto in vitro e in vivo. Rapamicina (LC Laboratories, Woburn, MA, EUA) e BEZ235 (Centro de Biologia Integrativa química e descoberta de medicamentos, UNC Eshelman Escola de Farmácia, Chapel Hill, NC, EUA) foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) para estudos in vitro terapia combinada . Os anticorpos contra fosforilada AMPKα (Thr172), AMPKα, AMPKα1, AMPKα2, mTOR fosforilada (Ser2448), mTOR, fosforilada p70S6K (Thr389), p70S6K, fosforilada 4E-BP1 (Thr37 /46), e 4E-BP1 eram de sinalização celular (Beverly , MA, EUA). Anti-gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) e peroxidase de rábano silvestre conjugado com anticorpos de cabra anti-IgG de coelho foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Pierce® ECL Western Blotting Substrate foi de Thermo Scientific (Rockford, IL, EUA). Apo-ONE kit Caspase-3/7 ensaio homogéneo foi da Promega (Madison, WI, EUA).

cultura celular e transdução com lentivírus

linhas celulares de cancro do pâncreas Capan-2, CFPAC- 1, HPAF-II e SW1990 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC), autenticado através de curto repetições em cadeia (STR) de perfis (Genética, Burlington, NC, EUA), e teste negativo para micoplasma por coloração indirecta. As linhas celulares foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO2 a 5% atmosfera.

o domínio puromicina do plasmídeo repórter AMPKα1-859 pLKO.1 (generosamente doada pelo laboratório de Channing Der, PhD da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC, EUA) foi substituído por um domínio blasticidina por digestão com enzimas de restrição com BamHI e KPMI. O lentivírus replicação incompetente segunda geração foi gerado em células 293T com um sistema de quatro plasmídeo: O plasmídeo repórter, pMDL gag /pol RRE, pRSV-Rev, e pCMV-G de VSV. Para a transdução com lentivírus, 1 × 10

6 CFPAC-1 e HPAF-II células foram semeadas em placas de 100 mm com lentivírus e polibreno numa concentração final de 8 ug /mL. Após 24 horas, o meio foi substituído e as células foram cultivadas durante mais 4 dias com 2 ug /ml de puromicina ou 10 dias com 10 ug /ml de blasticidina. As células foram tratadas com tripsina e analisados ​​por transferência de Western para determinar o silenciamento de genes.

O vector de expressão de myc-mTOR sobreexpressão transiente foi obtido a partir de Addgene (plasmídeo 1861, Cambridge, MA, EUA). A transfecção de 5×10

5 células CFPAC-1 ou HPAF-II foi levada a cabo com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) utilizando as instruções do fabricante. Após 24 horas de incubação, as células transfectadas foram tratadas com metformina 5 mM durante mais 24 horas, ponto em que as células foram lavadas com PBS, colhidas por raspagem, e armazenado a -80 ° C até o isolamento das proteínas.

MTT ensaio para a proliferação celular

para determinar a viabilidade celular após tratamentos com drogas, 5×10

3 células foram colocadas em placas em quadruplicado em placas de 96 poços em 200 ul de meio RPMI 1640 e cultivadas durante a noite. O meio foi então substituído com meio fresco contendo ou PBS como um controlo de veículo, a metformina (0-5 mM), ou com metformina e quer rapamicina (0-80 | iM) ou BEZ235 (0-1? M). Após uma incubação adicional de 48 horas, 50 ul de 5 mg /ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT), dissolvido em PBS a pH 7,4 foi adicionado a cada poço. Após 1 hora de incubação, o meio de cultura e o MTT foi aspirado e 200 mL de sulfóxido de dimetilo foi adicionado a cada poço e misturou-se homogeneamente. A absorvância a OD560 nm foi medida utilizando um leitor de placas de Sinergia 2 (BioTek, Winooski, VT, EUA). a proliferação relativa a cada concentração de fármaco foi calculada de acordo com a fórmula: 100 *% (experimental OD560 /veículo OD560). A significância estatística foi determinada utilizando-se análise ANOVA com o teste de comparações múltiplas de Dunnett. Para os estudos de terapia de combinação, a sinergia foi avaliada utilizando o software Compusyn empregando o princípio do efeito mediano de Chou-Talalay (ComboSyn, Inc. Paramus, NJ, EUA). Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

condições de transferência de Western

Após o tempo indicado de incubação com a metformina, as células foram lavadas com PBS, colhidas por raspagem e, em seguida lisaram-se em 200 ul de tampão RIPA contendo Tris-HCl 50 (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X, NaF 1 mM, e 0,25% de desoxicolato e inibidores de protease de Na. Os extractos de proteína (30 ug) foram sujeitas a electroforese em géis de 10% de SDS poliacrilamida e electrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Para a determinação do knockdown de AMPKα1 e AMPKα2, as membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% em solução salina tamponada com Tris e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com 1: 1000 diluições de anti-AMPKα1, anti-AMPKα2, e anti- anticorpos AMPKα. Para lisados ​​de células e tecidos isolados após tratamentos de metformina, as membranas foram incubadas a 4 ° C durante a noite com 1: 1000 diluições de anti-fosfo-mTOR, anti-mTOR, anti-fosfo-p70S6K, anti-p70S6K, anti-fosfo-4e- BP1, anti-4E-BP1, anti-fosfo-AMPKα, e anti-anticorpos de AMPK. As membranas foram então lavadas e incubadas com uma diluição 1: 5000 de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano de cabra anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). bandas imunorreactivas foram detectadas por quimiluminescência utilizando o Pierce® ECL Western Blotting substrato. A intensidade de cada banda imunorreactiva foi quantificada por densitometria utilizando o software Image J. (NIH, Bethesda, Maryland, EUA), e expressa em relação às células tratadas com PBS ou ratinhos. GAPDH foi usada para assegurar a carga de proteína equivalente. A significância estatística foi determinada utilizando o

t

-Testes por duas comparações de amostras e one-way análise de variância com teste de comparações múltiplas de Dunnett para três ou mais comparações de amostra.

expansão coorte PDX

pâncreas do tecido adenocarcinoma ductal de pacientes identificou-de com câncer pancreático localizada submetidos à ressecção cirúrgica curativa foram obtidos a partir da University of North Carolina Institutional Review Board (IRB) aprovou Tissue instalação de colheita após a aprovação IRB (08-1153). O tecido tumoral foi implantada subcutaneamente nos flancos de ratinhos NSG /NOD, expandida, e passados ​​ao longo do tempo, tal como descrito anteriormente [28, 29]. 7-8 semanas de idade, ratinhos nu /nu, com um peso médio de 18-20 g, foram utilizados em todas as experiências. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob protocolos aprovados pela Universidade da Carolina do Norte Animal Care Institucional e Comitê de Uso (12-314).

O tratamento com metformina de PDX coorte

O tratamento foi iniciado tumores após enxertados cresceu a um tamanho de tumor médio de 108 mm

3. Pelo menos cinco ratinhos foram incluídos em cada grupo de tratamento para cada linha tumoral PDX. Os ratinhos foram tratados com metformina (200 ou 400 mg /kg) ou PBS (20 mL /g) por sonda oral uma vez por dia. O primeiro dia de tratamento foi designado como dia 0 e o tratamento foi continuado durante 28 dias. O volume do tumor (V) foi medida duas vezes por semana usando pinças, e calculada como (comprimento x largura

2) /2. pesos corporais dos animais foram medidos uma vez por semana. A significância estatística foi determinada utilizando-se análise ANOVA com o teste de comparações múltiplas de Dunnett. O tecido tumoral foi recolhido duas horas após o último tratamento e cortada em duas partes: uma parte foi congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até o isolamento das proteínas, enquanto que a segunda parte foi fixada em formalina a 10% e embebidos em parafina ( FFPE). blocos de tecido FFPE foram seccionados e corados com hematoxilina e eosina para avaliação histopatológica.

Resultados

A metformina não inibe o crescimento de tumores PDX

Foi avaliada a resposta de quatro câncer de pâncreas linhas tumorais PDX para a metformina (200 e 400 mg /kg) durante 28 dias. Estas doses foram escolhidas como doses mais elevadas demonstraram ser necessário em ratinhos para produzir uma diminuição de glucose no sangue em animais diabéticos [19, 30, 31]. Além disso, doses mais elevadas de metformina (0,1% w /w) foram mostrados para aumentar a longevidade dos ratos [32]. A inibição do crescimento do tumor ou regressão foi observada em qualquer uma das quatro linhas tumorais PDX em qualquer ponto de tempo medido (Figura 1). Nenhuma mudança de peso corporal ocorreu ao longo do estudo e arquitectura do tumor permaneceu inalterada seguinte grosseiramente 28 dias de tratamento como avaliado por hematoxilina e eosina (Fig S1).

n inibição significativa do crescimento foi observado em quatro diferentes linhas tumorais do cancro PDX pâncreas em qualquer ponto de tempo, durante um curso de tratamento de 28 dias com 200 mg /kg ou 400 mg /kg de metformina, administrada por gavagem oral diariamente.

a activação de AMPK e inibição da fosforilação em p70S6K tumores PDX não é sustentada após um tratamento de 28 dias com metformina

para determinar se o tratamento com metformina alterada de sinalização AMPK e mTOR, avaliamos todas as quatro linhas tumorais PDX para a fosforilação da AMPK (Thr172) e p70S6K (Thr389) no final do tratamento de 28 dias (Fig 2A e 2B e Fig S2). Nesta coorte tratamento a longo prazo, nenhuma alteração na fosforilação da AMPK e p70S6K foi visto na metformina em comparação com os tumores tratados com veículo. Em seguida, avaliou o efeito de metformina em dois tumores PDX depois de apenas 3 dias de tratamento. Em contraste com os tumores de tratamento a longo prazo, os tumores de tratamento de curto prazo mostraram um aumento da fosforilação da AMPK e diminuiu a fosforilação de p70S6K (fig 2C e 2D).

e fosforilação da AMPKα p70S6K em (A) e P505 tumores (B) P710 PDX após tratamento de 28 dias com 400 mg /kg de metformina. A fosforilação de AMPKα e p70S6K em (C) e P505 (D) tumores P710 PDX após três dias de tratamento com 400 mg /kg de metformina (* p 0,05).

A metformina inibe o crescimento e altera a AMPK e sinalização mTOR em linhas celulares de cancro pancreático

uma vez que a falta de resposta sustentada em nossos modelos PDX foi surpreendente, o próximo examinaram os efeitos da metformina sobre a proliferação de quatro linhas celulares de cancro do pâncreas (Capan-2, CFPAC-1 , HPAF-II, e SW1990). A metformina inibe a proliferação celular de um modo dependente da dose em todas as quatro linhas de células (Fig 3A). O tratamento com metformina AMPK activado, tal como determinado por fosforilação da AMPK no Thr (172) em todas as linhas celulares testadas, com uma activação de pico ocorrendo a 4-8 horas após o tratamento (Figura 3B). Dado que a activação da AMPK é conhecido por inibir a mTOR, analisou-se ainda mais os efeitos do tratamento com metformina sobre o estado de fosforilação de mTOR e seus alvos a jusante p70S6K e 4E-BP1. Curiosamente, foi observada uma inibição retardada de mTOR e fosforilação alvo a jusante, com o ponto mais baixo de fosforilação observada de p70S6K e 4E-BP1 ocorrendo às 48 horas em ambas as células HPAF-II (Fig 3C e 3D) CFPAC-1 e.

(a) células foram semeadas em quadruplicados em placas de 96 poços a uma densidade de 5×10

3 por poço, incubada durante a noite, e depois tratou-se com meio contendo PBS como um controlo do veículo ou diferentes concentrações de metformina (0 -5 mM). Após 48 horas, os índices de proliferação foram determinadas utilizando o ensaio de MTT e normalizadas para as de células tratadas com o veículo. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. (B) A fosforilação de AMPKα e AMPKα total a vários pontos de tempo após o tratamento com metformina 5 mM. O tratamento começou às 0 horas (h). (C) A fosforilação de mTOR, p70S6K, e 4E-BP1 em vários pontos de tempo após o tratamento com metformina 5 mM. (D) A densitometria de fosforilada AMPKα, mTOR, p70S6K, e 4E-BP1 em relação aos níveis totais mostrados em (B) e (C).

AMPK é apenas parcialmente necessária para o efeito anti-proliferativo de metformina

o efeito anti-proliferativo de metformina tem sido atribuída principalmente à sua capacidade para activar a via de AMPK. Colocámos a hipótese de que a falta de activação de AMPK sustentada visto em todas as quatro linhas de tumor PDX pode explicar a falta de resposta de crescimento do tumor. Assim, foi realizada knockdown induzida shRNA de uma ou de ambas as subunidades catalíticas de AMPK em linhas celulares de cancro do pâncreas, para determinar se os efeitos anti-proliferativos de metformina seria afectada. Descobrimos que knockdown da AMPK α1 e /ou α2 AMPK parcialmente, mas não completamente invertida capacidade de metformina para inibir a proliferação celular (Fig 4A e 4B).

(A) shRNA knockdown de subunidades AMPKα em CFPAC-1 e HPAF linhas celulares -II. (B) Proliferação de CFPAC-1 e HPAF-II linhas celulares estáveis ​​com knockdown de subunidades AMPKα após tratamento com diferentes concentrações de metformina (0-5 mm). (C) fosforilação de mTOR e p70S6K em CFPAC-1 e HPAF-II linhas celulares com knockdown estável de subunidades AMPKα.

A metformina parece actuar sobre mTOR de forma independente-AMPK

a seguir investigou se a falta de inibição p70S6K sustentada visto na linha de tumor P710 PDX apesar da evidência de alguma activação AMPK sustentada pode ter sido devido a um mecanismo independente de AMPK. Foi avaliado o efeito da metformina sobre a fosforilação de mTOR e p70S6K seguinte knockdown de α1 AMPK e /ou α2 AMPK. linhas de células CFPAC-1 e HPAF-II com knockdown estável de NS, AMPK α1 e /ou α2 AMPK (Figura 4A) foram tratados com metformina 5 mM (Figura 4B e 4C). Em ambas as linhas celulares, knockdown de uma ou ambas as subunidades não resgatar a capacidade de metformina para inibir o crescimento ou a fosforilação de mTOR e p70S6K, o que sugere que a capacidade de metformina para inibir mTOR e p70S6K é pelo menos parcialmente independente da activação de AMPK nestas células linhas.

mTOR superexpressão é suficiente para superar os efeitos anti-proliferativos de metformina, mas o tratamento com inibidores de metformina combinatória e mTOR não produz sinergia

Como a metformina não conseguiram manter a inibição da via mTOR tal como medida por p70S6K fosforilação nos metformina tumores tratados PDX a longo prazo, e por causa das nossas descobertas de que a inibição de mTOR induzida por metformina foi pelo menos parcialmente AMPK-independente, o próximo determinar se a activação de mTOR sozinha foi suficiente para eliminar os efeitos da metformina. Verificou-se que a sobre-expressão de mTOR utilizando uma construção de myc-mTOR foi suficiente para produzir a inibição do crescimento e uma resistência completa ao limitar a diminuição da p70S6K fosforilação após o tratamento com metformina (Figura 5A e 5B). Para determinar se a combinação de metformina com inibidores de mTOR de segmentação pode ser uma estratégia terapêutica lógico, que tratada linhas celulares com doses de razão constante de metformina e tanto a rapamicina inibidor de mTOR alostérica ou o inibidor de mTOR catalítica BEZ235, que são conhecidos para inibir a linha celular de cancro pancreático crescimento. A inibição do crescimento não foi reforçada em qualquer combinação de dose em relação ao tratamento medicamentoso único, e nenhuma sinergismo entre a metformina e ou inibidor de mTOR foi calculado em qualquer dose usando a equação de efeito mediano de Chou-Talalay (Fig 5C e 5D).

(a) Fosforilação de p70S6K e (B) a proliferação de células HPAF-II após o tratamento com metformina 5 mM seguinte expressão transiente de uma construção de myc-mTOR transfectadas. Usando o cálculo médio equação efeito para o índice de combinação (Cl) seguinte tratamento de 3 dias com doses de razão constante de metformina e ou (C) a rapamicina inibidor de mTOR alostérica ou (D) o inibidor de mTOR catalítica BEZ235 não conseguiu produzir sinergia (CI 1 ) em qualquer combinação de dose. valores de CI a inibição do crescimento de 50%: (C) CFPAC-1 1,54, HPAF-II 1,43; (D) CFPAC-1 1,30, HPAF-II 1,29. (* P 0,050, ** p 0,005, *** p 0,001).

Discussão

Os estudos epidemiológicos em pacientes diabéticos descobriram que pacientes tratados com metformina tem um diminuição da incidência de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pâncreas [14-17]. Vários estudos pré-clínicos de metformina como um terapêutico anti-cancro ter sido promissora, demonstrando a inibição do crescimento do tumor impressionante [20, 22, 33] e a apoptose [34] de linhas de células do cancro do pâncreas. No entanto, os xenoenxertos de linhas celulares têm sido geralmente pouco fiáveis ​​preditores de respostas ao fármaco em seres humanos. Lonardo et ai. avaliaram o efeito da metformina sobre quatro linhas de tumor de cancro do pâncreas e PDX, semelhante à linha celular de estudos de xenoenxerto anteriores, encontrada inibição substancial do crescimento [21]. Em contraste, emergindo estudos clínicos que avaliaram a metformina em câncer pancreático moderaram o otimismo criado por este trabalho pré-clínico. Um estudo duplo-cego, randomizado, de fase II ensaio clínico controlado com placebo avaliando metformina em combinação com gemcitabina e erlotinib em doentes com cancro do pâncreas avançado não mostrou nenhuma diferença no resultado, como resultado do tratamento com metformina [35]. Outro ensaio clínico de fase II combinação de metformina com paclitaxel em pacientes com doença gemcitabina refratário não conseguiu cumprir o seu objectivo primário da taxa de controlo da doença [36].

Neste estudo, observou-se uma falta uniforme da resposta a metformina na quatro linhas tumorais PDX que se avaliou. Existem várias razões potenciais para os resultados díspares entre trabalho pré-clínico anterior, em comparação com o nosso estudo e ensaios clínicos recentes. Em primeiro lugar, tumores PDX são inerentemente muito heterogéneo porque os tumores PDX são passadas a granel e são ‘biópsias’ representativos de tumores semelhante heterogêneos paciente fonte. Em segundo lugar, embora a gama de dose no nosso estudo sobrepõe-se com os estudos anteriores, a farmacocinética da absorção de metformina ainda não são claras [37]. microambiente tumoral e o conteúdo do estroma parecem influenciar o acesso de metformina para células tumorais, que podem conduzir a diferentes resultados entre os estudos [21]. Em terceiro lugar, o volume do tumor em que o tratamento foi iniciado varia entre os estudos, que podem afetar a composição do tumor, especificamente a carga de células-tronco do câncer. Lonardo et ai. e outros têm mostrado que apenas esta subpopulação de células-tronco sofre apoptose como um resultado do tratamento com metformina, enquanto que a grande maioria das células tumorais detectar a paragem do crescimento reversível [18, 21]. Curiosamente, embora Lonardo et ai. descobriu que a metformina foi capaz de retardar o crescimento do tumor inicialmente PDX, notaram que todos os tumores PDX progrediu eventualmente na terapia [21], sugerindo que a metformina em monoterapia não será eficaz em pacientes.

Para obter insights sobre possíveis mecanismos de resistência, nós ainda avaliados dois dos nossos quatro linhas PDX e descobriu que a resistência a metformina pode ser multifatorial e dependente do tumor. Por exemplo, em P505, a ativação da AMPK não foi sustentada enquanto que no P710, continuou o crescimento do tumor ocorreu apesar de alguma ativação da AMPK sustentado. Os nossos resultados subsequentes em linhas de células sugere que isto pode ser por dois motivos. Em primeiro lugar, o efeito da metformina sobre a proliferação de células parece ser apenas parcialmente AMPK-dependente. Em segundo lugar, a capacidade de metformina para inibir a via mTOR no cancro pancreático também parece ser apenas parcialmente AMPK-dependente. Em todos os tipos de cancro, o grau em que a metformina depende activação AMPK para inibir o crescimento e alterar a sinalização mTOR /p70S6K é claro, e provavelmente dependente do tipo de célula. A inibição da expressão através da AMPK AMPK silenciamento da subunidade catalítica α utilizando inibidores específicos de AMPK ou knockout de LKB1, o sinal de activação a montante de AMPK, reverteu os efeitos anti-proliferativos de metformina no peito e células de cancro do ovário [38-40]. Por outro lado, Ben Sahra et ai. mostrou que a regulação negativa da AMPK não teve nenhum efeito sobre a capacidade de metformina para inibir o crescimento de células de cancro da próstata e mTOR sinalização [41]. Em vez disso, eles descobriram que a metformina conduziu à inibição de mTOR e de paragem do ciclo celular através da activação do inibidor de mTORC1 REDD1 [42]. Outros estudos na mama e linhas celulares de cancro do ovário, também descobriram que os efeitos da metformina pode ser apenas parcialmente dependente da activação da AMPK [43, 44]. O efeito anti-proliferativo da metformina foi mantido na linha de células do cancro do ovário A2780, apesar siRNA silenciamento de AMPKα1. Além disso, o tratamento com metformina era capaz de atenuar a proliferação de ambas AMPKα1 /2 do tipo-selvagem e AMPKα1 /2 de ratinho deficiente em fibroblastos embrionários (MEFs), embora AMPKα1 /2 MEFs deficientes foram ligeiramente menos sensíveis à metformina [43]. Em linhas celulares de cancro da mama, foi encontrada inibição de HER2 por metformina para ser completamente independente da AMPK-[44]. Estudos recentes em linhas celulares de cancro pancreático descobriram que a metformina pode inibir o crescimento independente de AMPK através de regulação positiva de miR-26a [45], enquanto que os efeitos da metformina sobre células estaminais do cancro do pâncreas podem ser mediados através de re-expressão de miARN específicas [18]. Estes resultados sugerem que a modulação da expressão de miARN pode ser ainda um outro importante mecanismo subjacente aos efeitos biológicos de metformina.

Tomados em conjunto com os estudos acima, os nossos resultados que knockdown de subunidades de AMPK não resgatar os efeitos inibidores da metformina sobre mTOR /p70S6K fosforilação mas que reexpressão mTOR foi capaz de inverter os efeitos anti-proliferativos de metformina, sugerem que a activação de AMPK e inibição da via mTOR /p70S6K pela metformina são eventos independentes que podem contribuir tanto para a inibição do crescimento de células de cancro. Além disso, a regulação da AMPK pela metformina pode ser do tipo celular dependente, e no cancro do pâncreas, os efeitos anti-proliferativos da metformina pode ser parcialmente ou em grande parte da AMPK-independente.

De modo geral, o nosso estudo mostra que, embora a metformina inibe pancreático proliferação de linha celular de cancro, o seu efeito em tumores de doentes vai provavelmente ser transitórios e muito mais complexa. Enquanto os mecanismos de resistência provavelmente envolver a activação da via mTOR, o tratamento simultâneo com metformina e inibidores de mTOR pode fazer pouco para aumentar a eficácia de qualquer terapia. Mais estudos são necessários para determinar se a metformina pode um dia fornecer o benefício para pacientes com câncer pancreático, aproveitando a sua metabólica complexa e efeitos em combinação com quimioterápicos ou terapias específicas sinalização.

Informações de Apoio

S1 Fig. metformina tratamento a longo prazo não afecta o peso do rato ou a histologia do tumor.

pesos (A) de ratos ao longo de um curso de tratamento de 28 dias, quer com 200 mg /kg ou 400 mg /kg de metformina mostrado em relação ao peso de base. Hematoxilina e eosina de (B) P505 e (C) P710 tumores de xenoenxerto derivado de paciente após 28 dias de tratamento com (painéis da esquerda) do veículo ou 400 mg /kg de metformina (painéis da direita) não mostram nenhuma diferença na arquitectura do tumor, formação ductal, ou conteúdo estromal. Barras de escala são 300 mm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147113.s001

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S2 Fig. A activação de AMPK e inibição da fosforilação p70S6K em tumores PDX não é mantida após 28 dias de tratamento com metformina.

Fosforilação de AMPKα e p70S6K em (A) e P722 (B) tumores PT4 PDX após tratamento de 28 dias com 400 mg /kg . metformina

doi: 10.1371 /journal.pone.0147113.s002

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obrigado Agradecimentos

os autores Charlene M. Santos, da Universidade da Carolina do Norte (UNC ) Lineberger Comprehensive Cancer Center animal Estudos core, o Programa UNC PDX, a UNC recolha de tecidos Facility, eo Laboratório de Patologia UNC Translational para assistência técnica.