Abstract

receptor da hormona da tiróide (TR) medeia os efeitos cruciais da hormona da tiróide (T3) no crescimento celular, desenvolvimento e diferenciação. Redução da expressão ou inactivação de mutações somáticas de ATR foram encontrados em cancros humanos do fígado, da mama, do pulmão e da tiróide. Os mecanismos da carcinogênese associada ao TR ainda não são claros. Para estabelecer a função de TRp na proliferação de células do cancro da tiróide, construímos um vector de adenovírus recombinante, AdTRβ, que expressa ADNc TRβ1 humano. linhas celulares de cancro da tiróide em que os níveis de proteína TRp foram significativamente menores em comparação com tecidos de tireóide intactas foram infectados com AdTRβ ea função de TRp na proliferação e migração celular foi analisada. TRp induzida HDAC1 e HDAC3 dissociação, e acetilação de histonas associada com o promotor RhoB e aumentou a expressão de ARNm e proteína RhoB ligado ao ligando. Em células infectadas AdTRβ, inibidor da farnesil transferase e T3 (FTI) -Tratamento induzida a distribuição de RhoB sobre a membrana celular e reforçada a abundância de RhoB ligada a GTP activa. Esta proteína RhoB levou a paragem do ciclo celular associada a p21 na fase G0 /G1, com a inibição da proliferação celular e invasão. Por outro lado, diminuindo RhoB celular por pequeno ARN interferente knockdown em células infectadas AdTRβ-levado a regulação negativa da p21 e paragem do ciclo celular inibido. O crescimento de xenoenxertos de tumor BHP18-21v

em

vivo foi significativamente inibido por injecção AdTRβ com FTIs-tratamento, em comparação com tumores de controlo injectou-vírus. Esta nova via de sinalização desencadeada por TRp ligado ao ligando fornece insights sobre possíveis mecanismos de proliferação e invasão de câncer de tireóide e pode fornecer novos alvos terapêuticos para os cancros da tiróide

Citation:. Ichijo S, Furuya F, Shimura H, Hayashi Y, Takahashi K, K Ohta, et ai. (2014) A ativação da via de sinalização RhoB por β hormônio tireoidiano receptor em células do cancro de tiróide. PLoS ONE 9 (12): e116252. doi: 10.1371 /journal.pone.0116252

editor: Makoto Makishima, Faculdade de Medicina da Universidade de Nihon, no Japão

Recebido: 12 Agosto, 2014; Aceito: 05 de dezembro de 2014; Publicação: 30 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ichijo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI (Grant Número 24.591.359). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

receptores de hormônios da tiróide (TRs) são fatores de transcrição dependentes de ligandos que medeiam as acções da hormona da tiróide (T3) no desenvolvimento celular, crescimento e diferenciação. Dois genes TR humanos, THRA e THRB que estão localizados em cromossomos diferentes, codificação de ligação T3 isoformas (TRα1, β1, β2, e P3) que são expressos de uma maneira Tecido e dependente do desenvolvimento [1]. Ao longo das últimas décadas, os avanços significativos foram feitos na compreensão das acções TR na manutenção da função celular normal. No entanto, os papéis de ATR em cancro humano não são bem compreendidos. A expressão reduzida de TRs por causa de hipermetilação ou supressão de genes TR em cancros humanos sugere que TRs poderia funcionar como supressores de tumor [2]. A estreita associação de mutações somáticas de TRs com cancros da tiróide suporta ainda a noção de que a perda de funções normais de TR poderia levar ao crescimento descontrolado e perda da diferenciação celular [3].

Para entender as consequências funcionais do ligando -bound efeitos TRp em vias de sinalização a jusante em células de câncer de tireóide, nós nos concentramos em RhoB que é um membro da superfamília de Ras de pequenas GTPases isoprenylated, que regulam fibras de stress de actina e transporte vesicular [4]. Outros RhoGTPases, que incluem RhoA e RhoC, promover a oncogénese, invasão e metástase [5]. Em contraste, tem RhoB antiproliferativa e efeitos pró-apoptóticos em células cancerosas, e a sobre-expressão de RhoB podem inibir a migração celular, invasão e metástase [6]. associação de membrana de proteína RhoB ocorre, quer através de (RhoB-GG) geranylgeranylated ou modificações farnesilado. RhoB responde ao inibidor da farnesil transferase -tratamento (FTI) por um mecanismo de ganho-de-função, que é caracterizado pela elevação da forma RhoB-GG, que inibe a proliferação ou a apoptose de células [7] cancerosas. Assim, a expressão alterada ea atividade do RhoB pode ser crucial para a progressão do câncer e respostas terapêuticas.

No presente estudo, nós exploramos a função de TRp ligado ao ligando em células de cancro da tiróide. Ligando-ligado TRp induzida a expressão da proteína RhoB, levando ao aumento da expressão de p21, seguido por diminuição da proliferação celular e a motilidade. FTI-tratamento melhorado destas funções antiproliferativos de TRp ligado ao ligando. Nossos resultados identificam RhoB regulação positiva como um passo fundamental para o direcionamento proliferação de células cancerosas da tiróide e progressão tumoral. Esta nova via de sinalização desencadeada por TRp ligado ao ligando fornece insights sobre possíveis mecanismos de proliferação e invasão de cancro da tiróide.

Materiais e Métodos

cultura celular

BHP18-21 células, que foram relatados por Ohta

et al.

[8], foram fornecidos como um presente pelo Dr. Jerome Hershman, UCLA. BHP18-21v células, que expressam Pax-8, mas não expressam quer a tiroglobulina ou a transcrição da tiróide gene do factor-1, foram isolados a partir de células BHP18-21v [9]. FRO e células WRO, que foram relatados na citação [10], [11] foram gentilmente cedidas pelo Dr. Shunichi Yamashita, da Universidade de Nagasaki. Estas linhas celulares não são

de

Novo

linhas de células, mas já foram relatados [8], [10], [11] e foram gentilmente cedidas como presentes por nossos colaboradores. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) numa incubadora humidificada sob 5% de CO

2 atmosfera. perfis de DNA de linhas celulares de cancro foi analisada pela Promega Japão (Tóquio, Japão) e é mostrada na Tabela 1. hormona tiróide, triiodotironina (T3) e o inibidor da farnesil transferase (FTI), FTI-277, foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. . Louis, MO). As células foram incubadas com despojado-resina (T

3-empobrecido) de FBS [12] e foram, então, infectadas com 30 MOI de AdTRβ AdLacZ ou controlo. As células foram incubadas em meio com ou sem 30 nM de T3 ou 5 uM de FTI.

Construção dos vectores adenovirais recombinantes

AdTRβ é um adenovírus recombinante ΔE1-ΔE3 que expressa o gene humano TRp [13] sob o controlo do promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV). Construção do vírus AdTRβ foi previamente descrito [13]. AdLacZ, que contém o promotor de CMV-controlada

lacZ gene, foi adquirido a partir de Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá) e foi usada como um controlo. AdTRβPV é um vector adenoviral recombinante que expressa TRβPV humano, que é um mutante negativo dominante de TRp [14], sob o controlo do promotor precoce de citomegalovírus imediato. O plasmídeo FLAG-TRβPV [15] foi utilizado como molde para a clonagem de

TRβPV

em pShuttle2 (Clontech, Mountain View, CA) utilizando a reacção em cadeia da polimerase. Os iniciadores de PCR foram: FLAG-Apal-5 ‘(AAGGGCCCGCCGCCATGGACTACAAAGACGATGACGAC), e TRβPV-3’ Kpnl (AATGGTACCTTCAGTCTAATCCTCGAACACTTCC) na qual os sublinhados indicam os sítios de restrição. Um vector de adenovírus foi então construído utilizando o Sistema Expressando adeno X (Clontech) de acordo com o protocolo do fabricante. Os adenovírus recombinantes foram purificados em placa, colhido 48 h após a infecção de células 293, e purificado por ultracentrifugação com gradiente de cloreto de césio dupla [16]. títulos virais foram determinados por ensaios de placa com células cultivadas 293 [16] e um kit de adenovírus titulação (Clontech).

construção de plasmídeo e ensaios de luciferase

O plasmídeo repórter RhoB -726 /+ 86 RhoB plasmídeo -Luc foi gentilmente cedido pelo Dr. Dimitris Kardassis (Universidade de Creta Medical School) [17]. Transient co-transfecções foram efectuadas em triplicado. O plasmídeo de luciferase de Renilla foi co-transfectado para a normalização. transfecções de plasmídeos foram realizadas em AdTRβ ou controlar as células cancerosas da tiróide infectadas por vírus usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com ou sem T3 para um adicional de 24 h. Os ensaios de luciferase duplas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI).

Ensaio ChIP

ChIP ensaios foram realizados utilizando um kit de cromatina imunoprecipitação ChIP enzimático simples (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). células AdTRβ-infectadas (5 x 10

7) que foram tratados com ou sem T3 foram fixadas com formaldeído a 1% e digerido cromatina foi imunoprecipitada com anti-histona 3 (controlo positivo), IgG de coelho normal (controlo negativo), anti histona-acetil 3 (Lis 9), desacetilase anti-histona (HDAC) 1 ou anticorpos anti-HDAC3. Quinhentos mL de cromatina diluída foram imunoprecipitados com 5 ug de cada anticorpo e proteína G pérolas magnéticas de acordo com as instruções do fabricante. Quantitativo em tempo real (RT) -PCR foi realizada utilizando um tempo real SYBR verde kit de PCR (Life Technologies). As sequências dos iniciadores utilizados para RT-PCR foram: para a frente 5′-GCAGCAGCAGCGCAGACT-3 ‘e inverso 5′-ACTCGGCCTAGCTCTCTC-3’

quantitativo em tempo real da transcriptase reversa PCR

O ARN total foi. extraiu-se a partir de células utilizando uma RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Após quantificação por espectrofotometria, 5 ug de RNA total foi transcrito de forma reversa para obter ADNc usando 160 uM de trifosfato de desoxinucleótido, 50 ng de iniciadores de hexâmero aleatório e 200 unidades de Superscript II, de acordo com as recomendações do fabricante (Life Technologies). As sondas TaqMan para RhoB humano, TRp, e rRNA 18S foram adquiridos de Life Technologies. níveis de mRNA foram determinadas por real-time RT-PCR como previamente descrito por Furuya

et al.

[18].

Western blot análise

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Yamanashi. tecidos tireoidianos normais a partir do lóbulo oposto de carcinomas foram obtidos por cirurgia após os pacientes assinaram consentimento informado. Os documentos sobre o consentimento informado, que foram aprovados pelo comitê de ética, foram mantidos no armário de armazenamento hospital universitário. tecido normal de quatro dos pacientes foi reunido para o experimento de Western blotting. Os tecidos foram congelados em azoto líquido imediatamente após ressecção. Os lisados ​​de proteína de tecido normal da tiróide e de linhas celulares de cancro foram preparados usando tampão de lise celular (Cell Signaling Technology), de acordo com as instruções do fabricante. proteína de membrana foi purificado a partir de células BHP18-21v AdTRβ-infectadas utilizando um kit de purificação de proteína de membrana (GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, PA) de acordo com as instruções do fabricante. Determinação da abundância de proteína por análise de transferência de Western foi realizada como descrito [19] utilizando os seguintes anticorpos primários (diluição): 1:500 anti-RHOB e anti-fosforilado Rb (Cell Signaling Technology); anti-PPARy, anti-p21, anti-tubulina, e anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX). siRNA controlo negativo e ARNsi contra RhoB foram adquiridos da Dharmacon (Thermo Fisher, Leicestershire, Reino Unido). A análise de transferência de Western de células transfectadas com ARNsi foi realizada como se segue: linhas celulares de cancro (1,0-1,3 x 10

5) infectadas com adenovírus (MOI 30) foram incubadas com T3 durante 12 h e, em seguida, de 50 nm de ARNip foi transfectado as células, utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 h, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (Ca

2 + /Mg

2 + -livre) e analisado como descrito acima.

A análise de imunoprecipitação

para analisar a expressão de proteínas de TRp em células, 500? g de lisado de proteína a partir de tecido da tiróide, HepG2 ou linhas celulares de cancro da tiróide transfectadas com vírus foi imunoprecipitada com 5 ug de anticorpo monoclonal de ratinho C3 contra o terminal C do TRp (Santa Cruz Biotechnology) ou com 5 ug de IgG de rato como indicado no texto, utilizando o kit de imunoprecipitação de proteína G Dynabeads (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. A análise por Western blot foi realizada utilizando um anticorpo anti-TRp (Santa Cruz Biotechnology) contra um péptido TRp N-terminal ou um anticorpo anti-TRa (Santa Cruz Biotechnology) contra um péptido TRa N-terminal. Os lisados ​​celulares de células AdTRβ-infectadas foram imunoprecipitados com Rhotekin RBD etiquetado esferas de agarose e a abundância de RhoB GTP-ligada foi analisada pelo ensaio de pull-down, usando RhoB kit de ensaio de activação (Biolabs celular, Inc. San Diego, CA).

-ciclo celular análise

As células foram coradas com 20 ug /ml de iodeto de propídio (Life Technologies) e foram analisados ​​por meio de um fluxo BD Biosciences FACS Calibur citómetro (Franklin Lakes, NJ) e celular quest software versão 3.0. A percentagem de células no G

1, S ou G

2 /M fase foi calculado usando ModFitLT versão 3.1.

Ensaios

proliferação celular e invasão

O número de células foi medido utilizando um ensaio de proliferação celular não radioactivo (Contagem celular Kit-8; Dojindo, Kumamoto, Japão) tal como anteriormente descrito por Furuya

et al [19]. invasão celular foi medida utilizando o kit de ensaio de Cytoselect celular Invasão (Biolabs celular, Inc.), de acordo com as instruções do fabricante. meio de cultura celular com 10% de FBS foi utilizado como um quimioatractivo na parte inferior do poço da câmara. Depois de re-hidratação da membrana basal, as linhas celulares de cancro da tiróide foram semeadas no compartimento superior da câmara em meio isento de soro (1 × 10

4 células por poço) com T3 ou FTI-tratamento. Após incubação a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 24 h, as células não invasoras foram removidos a partir da superfície superior, e as células que tinham invadido a membrana (8 um de tamanho de poro) para atingir a superfície inferior eram coradas com CyQUANT GR corante fluorescente. A sua fluorescência foi analisada a 480 nm utilizando um leitor de placas de fluorescência.

xenoenxertos de células BHP18-21v e

injecção vector

BHP18-21v células (1 × 10

7) foram transplantadas em o tecido subcutâneo abdominal de ratos nu masculina 8 semanas de idade (BALB /C

nu /nu

). Três semanas mais tarde, quando os tumores tinham atingido aproximadamente 1 cm de diâmetro, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente para o grupo experimental ou de controlo (6 ratinhos por grupo). Cinco x 10

8 unidades formadoras de placas de AdTRβ ou AdLacZ em 100 ul de PBS foram injectadas em tumores. administração de adenovírus foi repetido a cada 7 dias. Em cada ponto de tempo, todos os ratinhos foram também injectados intraperitonealmente com o peso de 100 mg /kg /corpo de FTI-277. No dia 30, os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação. Os tumores que foram removidos dos ratinhos foram fixados em formalina a 10% tamponada e embebidos em parafina. As secções foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. Serum T3 livre e TSH foram determinados usando o T3 livre ELISA kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, CA) e um kit de ensaio de TSH (Uscn Life Science Inc, Wuhan, China), respectivamente, de acordo com as instruções dos fabricantes. A comissão de biossegurança institucional da Universidade de Yamanashi aprovou os procedimentos de animais e o uso de DNA recombinante.

Estatísticas

Os dados são expressos como média ± S.D. A análise estatística foi realizada por meio de análise de uma via da variância ou não pareado de Student 2 caudas

t

-teste e valores de probabilidade de menos de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Para explorar TRp função na proliferação de células de cancro da tiróide, que focado na análise de RhoB, que é um alvo de TRp e é expresso em níveis muito baixos em 130 linhas de células de cancro humano [20]. Para o presente estudo, foram utilizadas as linhas celulares de cancro da tiróide 3, BHP18-21v, FRO e WRO, que foram infectadas com 30 MOI de AdTRβ ou AdLacZ. O primeiro analisada a expressão da proteína nestas células TRp. Quinhentos ng de proteína de lisado de células inteiras foi imunoprecipitado com um anticorpo monoclonal que reconhece a região do terminal C TR, seguido por análise de transferência de Western com um anticorpo contra um péptido N-terminal TRp. Como mostrado na Fig. 1A, TRp expressão foi claramente observado nos controlos positivos; tecido intacto tiróide (pista 1) e células HepG2 que expressam TR funcional [21] (pista 2), e também em BHP18-21v AdTRβ-infectadas, FRO e células WRO (pistas 6-8). Nenhuma expressão de proteína foi observada em TRp BHP18-21v AdLacZ-infectadas, FRO ou células WRO (pistas 3-5) ou em células HepG2 que foram imunoprecipitadas com um anticorpo monoclonal de IgG de rato como controlo negativo (pista 9). expressão tubulina no lisado de proteína (10 ug) foi também analisada como controlo de carregamento (Fig. 1B). Foram também analisadas expressão TRa nestes lisados ​​de células por análise por Western blot das proteínas imunoprecipitadas com um anticorpo contra um péptido TRa N-terminal. TRa expressão foi observada no controlo positivo; tecido da tiróide e HepG2 (pistas 1 e 2, respectivamente). Nenhuma expressão de proteína TRa foi observada em células BHP18-21v, FRO WRO ou que foram infectados com AdLacZ (pistas 3-5) ou AdTRβ (pistas 6-8). A regulação negativa da expressão de PPARy e a sua actividade é considerada como sendo um mecanismo da carcinogénese da tiróide [22]. portanto, analisamos também a expressão da proteína de PPARy em BHP18-21v, FRO ou células WRO (Fig. 1C). expressão de PPARy foi diminuída nestas células cancerosas em comparação com a do tecido da tiróide intacta, mas a infecção com AdTRβ não teve efeito sobre a expressão de PPARy em células de cancro da tiróide. Estes dados indicam que os três AdTRβ ou AdLacZ infectado linhas de células testadas são um bom modelo para análise da função TRp.

A. Western blot de lisados ​​celulares (500 ug) preparada a partir de tecido normal da tiróide, a partir de células HepG2 de controlo positivo, ou a partir das linhas celulares de cancro da tiróide BHP18-21v, FRO e WRO que foram infectadas com AdLacZ AdTRβ ou controlar o vírus. Os lisados ​​foram imunoprecipitados (IP) com 5 ug de anticorpo anti-TRp monoclonal de ratinho (C3) que reconhece o TRp terminal C, ou com 5 ug de IgG de rato normal (IgG) como indicado. As manchas foram sondadas com um anticorpo contra um péptido N-terminal TRp (HT), ou com um anticorpo contra um péptido TRa N-terminal (TRa). B. expressão tubulina em lisados ​​celulares totais foram utilizadas como um controlo de carga. C. transferência de Western análise do nível de proteína de PPARy (painel superior) em extractos de células (20 ^ g de lisado de proteína) de expressão. Tubulin também foi apagado como um controle de carga (painel inferior).

A seguir, analisou o efeito do tratamento T3 de AdTRβ- ou linhas celulares de cancro da tiróide AdLacZ infectados na expressão RhoB (Fig. 2A-C ). T3-tratamento (30 nM) de AdTRβ-infectadas (pistas 1-4), mas não de AdLacZ-infectadas (pistas 5-7) BHP18-21v, FRO e WRO células durante 6, 12 ou 24 h aumentou significativamente a expressão de RhoB ARNm de uma forma dependente do tempo em comparação com células não-tratadas não-infectadas por vírus. Além disso, a análise de transferência de Western indicou que o T3-tratamento para 12 ou 24 h induzida a expressão da proteína em RhoB BHP18-21v AdTRβ-infectadas, FRO e células WRO mas não em células infectadas com AdLacZ (Fig. 2D-F, pistas 2-4 e pistas 5-7, respectivamente). Assim, a indução de ARNm RhoB e expressão de proteína são T3 /AdTRβ-dependente em linhas celulares de cancro da tiróide.

Os níveis de expressão de ARNm RhoB (A-C) ou proteína (D-F) em AdTRβ-infectadas, controlo AdLacZ-infectadas, ou linhas celulares de cancro da tiróide não infectadas expostas a 30 nM de T3 para 0, 6, 12 ou 24 h, como indicado. (A-C) A expressão do ARNm de 18S RhoB e foi determinada utilizando em tempo real de RT-PCR com 100 ng de ADNc. Os níveis de expressão de ARNm relativos foram determinados por ajuste de forma arbitrária o valor para as células infectadas com vírus de controlo incubadas em meio isento de T3 a 1. Os dados estão expressos como médias ± S.D. (

n

= 6). *,

p Art 0,05. (D-F) análise de transferência de Western de 20 ug de proteína de lisados ​​de células foi realizada utilizando anticorpos contra RhoB (painel superior) ou tubulina (painel inferior), o qual foi utilizado como um controlo de carga.

Para esclarecer os mecanismos pelos quais TRp ligado ao ligando aumentou a expressão de RhoB em células BHP18-21v, FRO e WRO AdTRβ-infectadas, analisamos o efeito do tratamento T3 destas linhas celulares sobre a actividade de transcrição do promotor RhoB. células infectadas com AdLacZ AdTRβ- ou de controlo, por conseguinte, foram transientemente transfectadas com a construção repórter da luciferase promotor-RhoB, -726 /+ 86 RhoB-Luc. A actividade de luciferase conduzida pelo promotor RhoB foi significativamente aumentada em células AdTRβ-infectadas, mas não em células infectadas com AdLacZ seguintes T3-tratamento (Fig. 3A-C).

(A-C) RhoB promotor-luciferase ensaios repórter. -Adenovírus infectados BHP18-211v (A), FRO (B), ou células WRO (C) foram transfectados com 1 ug de um plasmídeo repórter RhoB promotor-luciferase e foram incubadas durante um período adicional de 24 h na ausência ou na presença de 30 nM T3. Actividades promotoras relativas (actividade de luciferase) foram determinados por ajuste de forma arbitrária o valor para as células infectadas com vírus de controlo incubadas em meio isento de T3 a 1. Os dados estão expressos como médias ± S.D. (

n

= 6). *,

p Art 0,05. (D-F) Ensaio ChIP utilizando AdTRβ-infectados BHP18-211v (D), FRO (E), ou WRO (F) as células tratadas com ou sem 30 nM de T3. Os anticorpos que reconhecem histone3 (H3), acetiladas H3, HDAC1, HDAC3 ou IgG normal de coelho foram utilizados para a imunoprecipitação da cromatina. Entrada indica 10% da cromatina. Os produtos de PCR foram separados num gel de 2% de agarose.

A transcrição do promotor é inibida por RhoB repressores transcricionais que recrutam histona desacetilases (HDACs) para remover a acetilação de resíduos de lisina em histones3 (H3) caudas [23]. Está bem estabelecido que o estado de acetilação dos domínios de cauda de histones3 (H3) mudança durante a activação transcricional do promotor RhoB [24]. Para determinar se a indução da expressão do gene por RhoB TRp ligado ao ligando se correlaciona com alterações no estado de acetilação de H3 na região promotora do gene RhoB, foram realizados ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP). AdTRβ-infectados BHP18-21v, FRO ou células WRO foram incubadas com ou sem T3 para 24 h e chip ensaios foram realizados usando anticorpos para H3, H3 acetilada, HDAC1 e HDAC3. Como mostrado na Fig. 3D-F, H3 foi encontrada em fragmentos do promotor RhoB (pista 3) em células AdTRβ-infectados com ou sem T3-tratamento. No entanto, HDAC1 e HDAC3 foram associados com fragmentos do promotor RhoB somente quando as células foram incubadas sem T3, e não quando as células foram incubadas com T3 (HDAC1 /3; pistas 5 e 6, respectivamente). Consistente com estes resultados, nenhum H3 acetilada foi associada com o promotor na ausência de tratamento T3, enquanto que na presença de T3, o H3 que foi associado com o promotor foi muito acetilado (pista 4). Estes resultados indicaram que TRp ligada ao ligando de transcrição induzida RhoB através de alteração do estado de acetilação de histonas de células de cancro da tiróide.

próxima analisaram o efeito de TRp ligado ao ligando na localização celular e a função de RhoB. Para isso, empregou o agente FTI. FTI tratamento das células induz a associação de membrana de RhoB por modificação de RhoB através da adição de radicais lipídicos [4]. Associação de membrana de RhoB é importante para a sua actividade. Em primeiro lugar, determinado o efeito de 5 uM de tratamento FTI sobre a expressão de proteínas em células RhoB BHP18-21v AdTRβ-infectados que foram tratados com ou sem T3 (30 nM). Western blotting de lisados ​​de células inteiras de células tratadas /BHP18-21v não tratadas infectadas com AdTRβ com RhoB anticorpo (Fig. 4A) indicou que o FTI-tratamento não alterou a indução de expressão T3 RhoB (pistas 2 e 4) e não aumentou a proteína RhoB expressão em células BHP18-21v AdTRβ-infectadas na ausência de T3-tratamento (pista 3).

células BHP18-211v

AdTRβ-infectadas foram expostas to30 nM de T3 e /ou 5 uM do inibidor da farnesil transferase ( FTI) durante 24 h e, em seguida, foram analisados ​​como se segue. A. Análise de Western blotting do nível da proteína RhoB (painel superior) em extractos de células (20 ^ g de lisado de proteína) de expressão. Tubulina foi também apagados como um controlo de carga (painel inferior). B. lisados ​​celulares foram imunoprecipitados com pérolas de agarose Rhotekin RBD-tag. RhoB ligada a GTP nos precipitados foi analisada por Western blotting utilizando um anticorpo contra RhoB. C. transferência de Western análise de proteína RhoB na fracção de proteína de membrana. GAPDH foi apagado como uma proteína de membrana de controlo marcador de carga (painel inferior).

Em seguida, analisamos o efeito do tratamento T3 com /sem co-tratamento FTI sobre a atividade RhoB. Como outras pequenas GTPases, RhoB regula eventos moleculares pelo ciclismo entre uma forma ligada a GDP inactiva e uma forma ligada a GTP activa. Na forma ligada a GTP activa, RhoB se liga especificamente ao domínio de ligação a Rho (RBD) de Rhotekin para regular cascatas de sinalização a jusante. Por conseguinte, analisada a abundância de RhoB ligada a GTP em lisados ​​celulares de células BHP18-21v AdTRβ-infectados que foram tratados com ou sem T3 e /ou FTI por imunoprecipitação de lisados ​​de células com esferas de agarose-RBD Rhotekin marcados, seguido por imunotransf erência para RhoB ( A Fig. 4B). Estes ensaios de pull-down indicou que não só a abundância de RhoB mas também a abundância da forma ligada a GTP activa de RhoB em células BHP18-21v AdTRβ-infectadas foi reforçada pela T3-tratamento (pista 2) e fortemente aumentada pelo FTI e T3 co-tratamento (pista 4). N-GTP ligado RhoB foi detectada em células tratadas com FTI sem T3-tratamento (pista 3). Estes resultados indicaram que a proteína induzida por RhoB AdTRβ ligado ao ligando em células BHP18-21v era uma quinase activa cuja actividade foi melhorada por co-tratamento com FTI.

Para determinar se T3 e FTI poderia induzir a associação de membrana RhoB em células BHP18-21v AdTRβ-infectadas, proteínas da superfície celular foram biotinilados. proteínas biotiniladas em lisados ​​de células foram, então, puxada para baixo com contas de estreptavidina e analisada por imunotransf erência com um anticorpo anti-RhoB (Fig. 4C). T3-tratamento induziu a expressão de RhoB na membrana celular (pista 2), que foi grandemente aumentada por co-tratamento com FTI (pista 4). FTI-tratamento não aumentou a expressão da proteína RhoB na membrana celular de células BHP18-21v AdTRβ-infectadas na ausência de T3-tratamento (pista 3). Estes resultados indicaram que a associação de membrana de RhoB que foi aumentada por co-tratamento FTI e foram consistentes com a indução de actividade RhoB T3 em células infectadas BHP18-21v AdTRβ induzida por T3.

A quinase dependente de ciclina (CDK ) inibidor, p21, é um regulador negativo da progressão do ciclo celular e é um dos alvos a jusante de RhoB. Para confirmar a actividade de RhoB em células BHP18-21v AdTRβ-infectados tratados com T3 e /ou FTI, analisou-se a expressão da proteína de p21 por análise de transferência de Western (Fig. 5A-C). a expressão da p21 foi analisada em células transfectadas com siRNA controle RhoB-alvo ou para confirmar a dependência RhoB de p21changes. Três células de cancro da tiróide foram pré-cultivados em meio isento de T3 com soro retirado, tal como descrito em “Materiais e Métodos”. FTI-tratamento não aumentou a expressão de proteína p21 em células infectadas por AdTRβ-ARNsi de controlo sem T3-tratamento (pista 2). Em células AdTRβ-infectados, o nível de expressão foi aumentado de p21 em células tratadas com T3 (pista 3) e foi grandemente aumentada por co-tratamento com FTI (pista 4) em comparação com células não tratadas (pista 1). No entanto, p21 não foi induzida por T3 mais o tratamento FTI de células AdTRβ infectadas 24 horas após a transfecção com siRNA RhoB-alvo (pista 5). p21 inibe a actividade das CDK, levando a hipo-fosforilação da proteína do retinoblastoma (Rb), que por sua vez provoca a paragem do ciclo celular na fase G0 /G1 [25]. Analisou-se a fosforilação de Rb (p-Rb) em células de cancro da tiróide AdTRβ-infectados tratados com T3 e /ou FTI [(Fig. 5 (A-C)). Rb foi fosforilado em BHP18-21v AdTRβ-infectadas, ou FRO WRO células com ou sem T3-tratamento (pistas 1 e 3). FTI-tratamento por si só não inibiu a fosforilação de Rb em células AdTRβ-infectadas (pista 2). fosforilação de Rb foi significativamente diminuída em células AdTRβ-infectados por co-tratamento com T3 e FTI (pista 4). Por outro lado, a inibição de fosforilação de Rb não foi observada por mais T3 FTI tratamento de células infectadas com AdTRβ após transfecção com ARNsi RhoB-alvo (pista 5).

(A-C) análise de transferência de Western do nível de p21 ou da proteína Rb fosforilado em BHP18-21v AdTRβ-infectadas (a), células WRO FRO (C) (B), ou que foram expostas a 30 nM de T3 sozinho durante 12 horas ou a 30 nm T3 expressão mais 5 uM de FTI durante 12 h, com ou sem siARN knockdown de RhoB como indicado. Tubulin foi apagado como um controle de carregamento (painéis inferiores). (D-F) A percentagem de células em G

0 /L

1, S, ou L

2 /H de fase foi calculada usando ModFitLT versão 3.1. Os dados são expressos como média ± S.D. (

n

= 6). *,

p

. 0,05

Nós ainda estudou as fases do ciclo celular destas células por citometria de fluxo (Fig 5D-F.). Em células infectadas por AdTRβ de controlo Si, tratamento com T3 mais FTI induziu um aumento significativo na população em fase G0 /G1 em comparação com células não tratadas ou tratadas com T3, enquanto que em RhoB-alvo células transfectadas com ARNsi, tratamento FTI T3 + tinha nenhum efeito sobre a população de células na fase G0 /G1. Além disso, o tratamento com FTI mais T3 reduziu o número de células no /fase G2 M em Si-Control, mas não em células de siRNA-AdTRβ-infectadas RhoB segmentados. Estes resultados indicam que a expressão aumentada RhoB em células cancerosas AdTRβ-infectados que foram tratados com T3 e FTI, foi acompanhada por um aumento da expressão de p21 e a inibição da progressão do ciclo celular.

Para confirmar que as alterações observadas em a expressão da p21 reflectiu alterações na proliferação de células, que próxima analisados ​​os efeitos de TRp sobre a proliferação de células de cancro utilizando o ensaio MTT. Para este ensaio, as células BHP18-21v, FRO WRO ou foram infectadas com 30 MOI de AdTRβ e, após 12 horas de incubação em meio contendo adenovirus, as células foram cultivadas com ou sem T3 (30 nM) e 5 fiM de FTI para 24 ou 72 h. Após 24 e 72 h de incubação o número de células tinha aumentado na ausência de T3-tratamento, mas foi reduzida na presença de T3 e foi significativamente diminuída na presença de T3 mais FTI (Fig. 6A-C).

(A-C) ensaio de proliferação celular. BHP18-21v (A), células FRO (B) ou WRO (C) foram incubadas em meio depletado de T3 durante 24 h e foram depois infectadas com 30 MOI de AdTRβ. As células foram então incubadas em meio com T3 e /ou FTI durante um adicional de 24 ou 72 h. os números de células relativos foram determinados por ajuste de forma arbitrária o valor de culturas de controlo incubadas em meio isento de T3 a 1. Os dados estão expressos como médias ± S.D. (

n

= 6). Como mostrado na Fig. As barras de escala, 10