Abstract
Purpose
A /AKT /mTOR PI3K é frequentemente desreguladas em cancros e inibição da mTOR tem demonstrado a capacidade de modular vias pró-sobrevivência. Como tal, procuramos determinar a capacidade do everolimus inibidor de mTOR para potenciar os efeitos antitumorais do irinotecano em câncer colorretal (CRC).
Experimental Design by
Os efeitos combinatórias de everolimus e irinotecano foram avaliadas
in vitro
e
in vivo
em linhas celulares de CRC com mutações comumente encontrados em
PIK3CA
,
KRAS
e /ou
BRAF
. Farmacocineticamente-dirigida protocolos de dosagem de everolimus e irinotecano foram estabelecidas e utilizadas para avaliar os efeitos anti-tumor in vivo dos agentes. No final do tratamento, 3-6 tumores por grupo de tratamento foram colhidas para análise biomarcador por metabolômica RMN.
Resultados
Everolimus e irinotecan /SN38 demonstrou efeitos anti-proliferativa sinérgicos em células múltiplas CRC linhas
in vitro
. foram determinados efeitos da combinação de everolimus e irinotecan em modelos de xenotransplante CRC utilizando protocolos de dosagem clinicamente relevantes. Everolimus demonstrada a inibição do crescimento tumoral significativa sozinhos e quando combinados com o irinotecano em HT29 e xenoenxertos tumorais HCT116. Análise metabolômica mostraram que os tumores HT29 foram metabolicamente mais ágil do que tumores HCT116. Everolimus causou uma diminuição na glicólise em ambos os tipos de tumor, enquanto o tratamento irinotecano resultou num profundo acumulação de lípidos nos tumores HT29 indicando um efeito citotóxico.
Conclusões
A análise quantitativa do crescimento do tumor e mostrou dados metabolômicos que a combinação de everolimus e irinotecano foi mais benéfico a
BRAF /PIK3CA
xenotransplantes mutantes tumor HT29, que tiveram um efeito aditivo, do que os
KRAS /PIK3CA
mutantes xenotransplantes tumorais HCT116, que tinha a menos de efeito aditivo
Citation:. Bradshaw-Pierce EL, Pitts TM, Kulikowski G, Selby H, Merz aL, Gustafson DL, et al. (2013) Utilização de Quantitative farmacologia in vivo Abordagens para avaliar os efeitos da combinação de everolimus e irinotecano em Rato xenoenxertos modelos de cancro colorectal. PLoS ONE 8 (3): e58089. doi: 10.1371 /journal.pone.0058089
editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América
Recebido: 04 de setembro de 2012; Aceito: 31 de janeiro de 2013; Publicação: 08 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Bradshaw-Pierce et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Novartis International AG e Universidade do Colorado Cancer Center Grant P30 CA046934. Novartis tiveram alguma entrada no desenho do estudo, mas não desempenham um papel na análise de coleta de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Eu li política da revista e têm os seguintes conflitos . Uma porção do custo dos estudos foi fornecido pela Novartis. Novartis também forneceu toda everolimus para os estudos. Isto não altera a nossa adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Há foco atualmente significativo no desenvolvimento de novos agentes destinados a perturbar vias de transdução de sinal de importantes progressão do câncer. A utilização clínica desses agentes orientadas molecularmente envolve frequentemente combinados com outras modalidades terapêuticas e vários estudos clínicos têm demonstrado a vantagem de adicionar moduladores da transdução do sinal (STM) a quimioterapia ou terapia de radiação [1] – [5]. O êxito do desenvolvimento de terapias com drogas e estratégias de tratamento requer a utilização cuidadosa de modelos pré-clínicos e interpretação cuidadosa dos dados.
O uso de métodos quantitativos, incluindo o uso de dados farmacocinéticos quantitativas e medidas de resposta, é fundamental para elucidar mecanismos de ação e melhorar a investigação translacional farmacologia [6]. Uma deficiência comum de
In vivo
estudos de farmacologia é o uso de doses e /ou horários que não são clinicamente viável que pode levar a resultados enganosos de eficácia e /ou desenvolvimento de biomarcadores que muitas vezes não conseguem traduzir para a clínica configuração. Aqui, apresentamos um estudo em que determinada quantitativamente o benefício da adição de uma pequena molécula STM, everolimus (Novartis, East Hanover, NJ), a quimioterapia padrão, irinotecano (Pfizer Inc, New York, NY), usando doses e horários em nossa pré-clínicos modelos previsto para se obter a exposição aos fármacos semelhantes àqueles observados em pacientes
o everolimus (40-
o
– (2-hidroxietil) -rapamicina, RAD001 /Afinitor®). é um inibidor oralmente biodisponível do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), que está actualmente aprovado para o tratamento de carcinoma de células renais e tumores neuroendócrinos progressivos de origem pancreática (PNET) [7], [8]. mTOR, uma serina /treonina quinase, é um regulador central de vias que sinalizam o crescimento, proliferação, sobrevivência, o metabolismo e a angiogénese [7], [9]. atividade de mTOR é mediada pelo fator de crescimento de sinalização, de nutrientes e estados de energia, bem como o estresse hipóxico. Além disso, a mTOR desempenha um papel chave no fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /AKT que é frequentemente desreguladas e implicado no crescimento e progressão em vários cancros, tornando-o um alvo terapêutico atractivo [10], [11]. Estudos recentes sugerem que mutações PIK3CA ou da actividade de AKT conferem sensibilidade à terapia de mTOR [12] – [15].
PIK3CA
é o gene que codifica o p110 de PI3K da subunidade catalítica e mutações (exão 9 e o exão 20) pode ser encontrada em 10-30% de CRC [11], [16], [17].
CRC é o terceiro tipo de câncer mais comum, responsável por quase 10% de todas as mortes relacionadas ao câncer em os EUA [18]. Enquanto fase inicial CRC tem uma taxa de sobrevivência de 5 anos favoráveis, doença fase tardia com metástases à distância tem uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 10%, o que indica a necessidade de melhorar os regimes de tratamento para câncer colorretal metastático (mCRC). O irinotecano (Camptosar®) é um padrão de cuidados agente quimioterapêutico utilizado no tratamento de CCRm. Nossa hipótese é que everolimus aumentaria a terapia de irinotecan devido à modulação dos efectores em vias pró-sobrevivência e teve como objetivo avaliar a combinação em modelos de rato de xenotransplante de CRC abrigar o difíceis de tratar em simultâneo
PIK3CA
e
KRAS
ou
BRAF
mutações. Além disso, por causa dos efeitos metabólicos conhecidos dos inibidores da via mTOR, que avaliada quantitativamente os perfis metabólicos dos tumores tratados com doses clinicamente relevantes de espectroscopia de everolimus e irinotecano por ressonância magnética nuclear (RMN).
Materiais e Métodos
produtos químicos e reagentes
o irinotecano para
in vivo
estudos foi obtida a partir da Universidade do Colorado Farmácia Hospitalar (Aurora, CO) e SN38 para
in vitro
estudos foi adquirido a LKT Labs (St. Paul, MN). Everolimus foi fornecida como uma suspensão pela Novartis. soluções de SN38 para
in vitro
experiências foram feitas em DMSO (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Todos os outros materiais utilizados foram adquiridos a partir de qualquer Fisher Scientific ou Sigma (St Louis, MO) salvo indicação em contrário.
Cultura celular
linhas de células de tumor do cólon, HCT8, HT29, LS180 e HCT116, foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection, (Manassas, VA), e mantidas em placas de cultura de tecidos (BD Falcon, San Jose, CA) em meio RPMI (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) e penicilina (100 unidades /mL) -streptomycin (100 ug /mL; Life Technologies). As células foram rotineiramente para mycoplsma usando MycoAlert (Lonza). Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO
2. Todos
in vitro
tratamentos medicamentosos foram realizadas com o uso de meio de crescimento completo.
citotoxicidade e Combinação Efeitos
efeitos citotóxicos foram determinadas usando o ensaio sulforhodamina B (SRB). Resumidamente, 5000 células viáveis foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante a noite antes da exposição com diferentes concentrações de drogas. As células foram expostas a concentrações crescentes de everolimus (0-200 nM), SN38 (0-8 nM), e combinações de ambos. Após uma incubação de 72 horas, o meio foi removido e as células foram fixadas com ácido tricloroacético frio a 10% durante 30 minutos a 4 ° C. As células foram lavadas com água e coradas com 0,4% de SRB durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram novamente lavadas com ácido acético a 1% e corante foi solubilizado com Tris 10 mM à temperatura ambiente e lidas a uma DO de 565 nm. Os resultados do tratamento combinado foram analisados de acordo com o método isobolographic de Chou e Talalay, usando o programa de software CalcuSyn (Biosoft, Cambride, Reino Unido). O Índice de combinação resultante (CI) foi utilizada como uma medida quantitativa do grau de interacção entre as diferentes drogas. Um valor CI igual a 1 indica aditividade; CI maior do que 1, o antagonismo; CI inferior a 1, o sinergismo.
imunotransferência
As células foram semeadas em placas de 6 poços de 24 horas antes do tratamento com cada fármaco isoladamente ou em combinação, durante 24 horas. As células foram raspadas em RIPA contendo inibidores de protease tampão, EDTA, NaF, e ortovanadato de sódio. A proteína total foi determinada utilizando o ensaio de Pierce 660 nm Protein (Pierce, Rockford, IL). Trinta microgramas de proteína total foi carregado num gel de gradiente de 4-12%, a electroforese e transferiu-se para nitrocelulose usando o sistema iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). As membranas foram bloqueadas durante uma hora à temperatura ambiente com Licor tampão de bloqueio (Licor, Lincoln, NE) antes da incubação durante a noite a 4 ° C com um dos seguintes anticorpos: pS6RP, tS6RP, pakt, TAKT, Perk, TERK, p21, PARP , actina e α-tubulina (Cell Signaling, Beverly, MA). Todos os anticorpos foram utilizados a uma diluição 1:1000 excepto para pERK, o qual foi utilizado no 1:2000. Após incubação do anticorpo primário, as manchas foram lavadas em TBS-Tween (0,1%), depois incubadas com o anticorpo secundário adequado em 1:15,000 (Licor, Lincoln, NE) durante uma hora à temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais, as manchas foram desenvolvidos usando o Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE).
Animais
ratinhos nus atímicos fêmeas, de 5 a 10 semanas de idade, foram adquiridos a partir do National Cancer Instituto. Os animais foram alojados 3-5 por gaiola em gaiolas de policarbonato e mantida em um 12 h ciclo de luz /escuridão. Alimentos e água foram dadas
ad libitum
. Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) e conduzida de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e os animais foram alojados em uma instalação credenciada pela Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care .
Para estudos de portadores de tumor, as células foram colhidas e ressuspensas numa mistura 01:01 de RPMI isento de soro e Matrigel (BD Bioscience). Um milhão de células foram injectadas subcutaneamente em cada flanco traseiro dos ratinhos. Os volumes tumorais, medida pelo calibrador digital, foram calculados pela
V
(mm
3) = comprimento x (largura)
2 x 0,5236.
estudo farmacocinético
Um estudo farmacocinético de everolimus foi conduzido em camundongos com tumores HT29 (volume médio de -300 mm
3). Os ratinhos foram tratados com 2,5 ou 10 mg /kg everolimus por dia durante 7 dias, por gavagem oral. Três ratos por nível de dose foram sacrificados por sangria vara cardíaca aos 30 minutos, 2, 4, 6 e 24 horas após a administração da droga no dia 7. tecido de plasma e tumor foram congeladas em N líquido
2 e armazenadas a -70 ° C até serem analisadas.
O everolimus foi medida no plasma e tumores por ensaio de LC /MS /MS. Padrões analíticos, de controlo de qualidade (QC) e desconhecidos foram todos preparados por adição de 200 ul de plasma em branco Desconhecido ou cravado ou homogeneizado tumoral (100 mg /ml em água) para as amostras de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. As amostras foram extraídas por meio da adição de 1 ml de éter metil-terc-butílico (MTBE) seguido por 10 min de mistura de vórtice. As amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm durante 10 min e o sobrenadante foi recolhido e 900 ul transferida para um tubo de ensaio de vidro limpo. As amostras foram evaporadas até à secura utilizando um evaporador rotativo, seguido por re-suspensão em 100 ul de 50% de acetonitrilo /50% de acetato de amónio 10 mM e transferidas para frascos de auto-amostragem para análise. Os espectros de massa para as amostras extraídas foram obtidos num MDS Sciex 3200 Q TRAP-espectrómetro de massa de quadrupolo triplo (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) com uma fonte Turbo ionspray em interface com um sistema de bomba de binário Série SL HPLC Agilent 1200 (Santa Clara , CA) .Os limites inferior e superior de quantificação para o ensaio foi de 1 e 5000 nM, respectivamente. Exatidão e precisão (RSD%) com base na análise dos padrões e amostras de CQ para este ensaio foram 90,7% e 5,5% para plasma e 93,0% e 4,2% para o tumor. Detalhes adicionais podem ser encontrados no Suplemento S1 (seção SA.1.).
Estudo Terapêutico
Quando HT29 e HCT116 tumores atingiram um volume médio de ~325 mm
3 animais foram randomizados em quatro grupos de tratamento (n = 9-10 ratinhos por grupo): (i) veículos, (ii) 5 mg /kg de everolimus (RAD) por sonda oral (PO) por dia, (III) 10 mg /kg de irinotecano (IRI) uma vez por semana por (iv) injecção intravenosa na veia da cauda, e (iv) uma combinação de RAD e IRI. O everolimus, diluiu-se em água esterilizada, e irinotecano, diluída em solução salina estéril a 0,9%, foram administrados a 4 ml /kg. Os animais foram tratados durante 28 dias. Os volumes tumorais e os pesos corporais foram medidos 2-3 vezes por semana. No dia 28 do tratamento de 3-6 animais por grupo foram sacrificados, em aproximadamente 24 horas após o tratamento everolimus e tumores colhidos para análise metabolômica.
NMR-Based Metabolomics
Para a análise metabolômica, os animais foram em jejum durante 4 horas, em seguida, receberam 250 mg /kg de glicose [1-
13C] (Cambridge Isotopes, Cambridge, MA), por injecção IV de 60 minutos antes da colheita do tumor. espécimes tumorais congelados instantaneamente foram submetidos a procedimento de extracção do ácido em duas fases (utilizando 8% de ácido perclórico), previamente estabelecido e amplamente publicados [19] – [22]. Mais detalhes também podem ser encontradas no Suplemento S1 (seção SA.2.).
Análise de Dados
parâmetros farmacocinéticos tumorais Plasma e foram calculados por análise não compartimentada com WinNonlin. dados Everolimus plasma estava apto para um modelo de dois compartimentos com a absorção de primeira ordem e simulações de concentrações plasmáticas a uma dose de 5 mg /kg de everolimus foram realizadas por SAAM II versão 2.1 (The Epsilon Group, Charlottesville, VA /Universidade de Washington) .
One-way análises ANOVA com pós-teste de Tukey foi utilizado para determinar a significância estatística entre os vários grupos. As análises foram realizadas com Prism versão 4.02.
valores P Restaurant 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todos os conjuntos de dados metabolômica quantitativos foram incluídas nos mapas de calor metabólico custom-built metabólica fluxos analisadores e interfaces de dados e apresentado como [23].
Dados do estudo in vivo foi modelado para avaliar o benefício terapêutico de adicionar everolimus para irinotecan. O modelo utilizado era semelhante a um modelo previamente publicada para avaliar a terapia de combinação [24]. Algumas modificações foram feitas e detalhes do modelo pode ser encontrado no Suplemento S1 (seção SA.3.) E completar S2. Todos modelagem foi realizada em dados de volume de tumor de origem animal individual e modelado com SAAM II versão 2.1.
Resultados
In Vitro Atividade
Os efeitos sinérgicos de everolimus (RAD) e SN38 foram avaliados em linhas celulares de CRC, HT29 (
BRAF
mt;
PIK3CA
mt; p53 mt), HCT116 (
KRAS
mt,
PIK3CA
mt ), HCT8 (
KRAS
mt) e LS180 (
KRAS
mt;
PIK3CA
mt). Para todos os
in vitro
experimentos SN38 foi usado no lugar de irinotecano uma vez SN38 é o metabolito activo do irinotecano. células HT29 foram os mais sensíveis a SN38 e everolimus e a adição de everolimus a SN38, genericamente, um efeito sinérgico fortemente em HT29, HCT8 e células HCT-116 com valores de CI que variam de 0,1 e 0,7 (Figura 1). A adição de everolimus ao tratamento SN38 em células LS180 foi menos claro como valores IC variou amplamente 0,3-1,4. análises de Western blot mostram que a baixas concentrações, everolimus (20 nM) é capaz de inibir a ribossomal fosfo-S6 quinase (pS6RP) em todas as linhas celulares e SN38 (4 nM) provoca um aumento na proteína p21 em células HCT116 e HCT8 (Figura 2) . Sem p21 era mensurável em células HT29 em doses de usados everolimus e irinotecano. Uma pequena quantidade de PARP clivada (MW 89) foi observada em células SN38 HCT8 tratados, mas não em HT29 ou HCT116.
Os efeitos anti-proliferativos combinatórias foram avaliados em HT29, HCT116, HCT8 e células LS180 para avaliar potencial aditivo ou interacções sinérgicas. A inibição do crescimento foi medida pelo ensaio de sulforhodmine B (SRB) após uma incubação de 72 horas com SN38 (0, 2, 4 ou 8 nM) e RAD (0, 2, 20 ou 200 nM – indicado pelas triangels sob os gráficos). Os dados nos gráficos representa a média ± desvio padrão de pelo menos 3 experiências em separado. O índice de combinação valores (IC) foram calculados para todas as combinações e os valores ± desvio padrão são apresentados nas tabelas abaixo coloridas cada gráfico .. O CV% de repetições variou 5-40% e ~ 20% em média, portanto, nós determinado que os valores de CI 1,2 são considerados antagonistas, 1,2 CI 0,8 são aditivos e CI 0,8 são sinérgicos. Note-se que SN38 é usado no
in vitro
ensaios em vez de irinotecano uma vez que é o metabolito activo.
Akt, P-Akt, PARP, PARP clivada total de ribossomal S6 quinase ( S6), ribossomal fosfo-S6 quinase (PS6), ERK, p-ERK, p21 e α-tubulina foram medidos em todas as linhas após 24 horas de tratamento com o RAD (20 nM), SN38 (4 nM) ou a combinação do dois. pesos moleculares são apresentados ao lado do nome de proteína entre parênteses. Note-se que SN38 é usado em
in vitro
ensaios em vez de irinotecano uma vez que é o metabolito activo.
farmacocinéticas-Directed Dosagem de Everolimus e
irinotecano
Para
in vivo
estudos, estabelecemos doses de everolimus e irinotecano para administrar a ratos que produzem exposições ou abaixo dos níveis clinicamente praticáveis. humano informação farmacocinética em everolimus [25], [26] e irinotecan /SN38 [27] – [30]. foi recolhida a partir da literatura e é apresentado nas Tabelas 1 e 2, respectivamente
para determinar a dose apropriada de everolimus em camundongos, foi realizado um estudo farmacocinético de everolimus em camundongos portadores de tumor HT29. perfis de plasma e tumor concentração em tempo de estado estacionário são apresentados no Suplemento S3 Figuras SC.2. A B e os parâmetros farmacocinéticos não compartimentais apresentados na Tabela 1 e na Tabela C.1 S3 suplemento. Os dados mostraram que uma dose de 10 mg /kg em ratos resulta na exposição de plasma livre de estado estacionário (AUC
SS, livre = 116 ng * hr /mL) que está no intervalo de observado em seres humanos com a clinicamente doses utilizadas de 5 a 10 mg /kg por dia (AUC
ss, livre = 60-178 ng * h /mL). Os valores de ligação às proteínas no plasma de 99% e 75% foram utilizados para calcular as concentrações plasmáticas livres em ratos e humanos, respectivamente [31], [32]. No entanto, para os estudos in vivo de eficácia, optamos por usar uma dose de 5 mg /kg (AUC
ss, livre = 37 ng * h /mL) sendo cauteloso de alcançar muita atividade como agente único, o que poderia torná-lo difícil avaliar os efeitos da combinação. Estudos anteriores de everolimus em ratinhos portadores de xenoenxertos tumorais HCT116 demonstrou atividade do agente único (inibição do crescimento do tumor 45-55%) de everolimus a 10-12 mg /kg [33], [34].
In dados in vivo foi avaliada
SN38 para definir a dose de irinotecano a ser utilizado, uma vez que é o metabolito activo de conversão irinotecano e carboxilesterase de irinotecano a SN38 varia entre ratos e humanos. Com base nos dados farmacocinéticos e do rato humanos recolhidos a partir de dados da literatura [27] – [30], [35] – [40], que seleccionada uma dose de 10 mg /kg de irinotecano a ser administrada por via intravenosa uma vez por semana (Tabela 2). Uma dose /kg iv de 10 mg foi estimada para produzir uma exposição de SN38 livre na gama de que a observada em humanos (ratos: ASC
livre = 7,5-25,8 ng * h /mL; seres humanos: ASC
livre = 4,4-18,6 ng * h /mL para doses entre 125-350 mg /m
2). valores de ligação SN38 proteínas plasmáticas de 96,6-98,6% para os ratos e 98% para os seres humanos foram utilizados para calcular fracção livre da concentração total [37].
Tumor Xenoenxerto Response to Everolimus e Terapia irinotecano
a eficácia do everolimus, irinotecano e combinação dos dois foi determinada em HT29 e tumorais HCT116 xenoenxertos. A Figura 3A mostra os perfis de crescimento do tumor de todos os grupos de tratamento para ambos os tipos de tumores. Everolimus causada semelhante e estatisticamente significativa (p 0,05 vs. controlo) de inibição de crescimento em ambos HT29 (inibição média de crescimento do tumor, TGI = 40%) e HCT116 (média TGI = 44%) tumores enquanto que o irinotecano causou inibição significativa do crescimento apenas em HT29 tumores (média TGI = 39%; p 0,05). A adição de everolimus de irinotecano reduzida significativamente o volume de HT29 (média TGI = 64%) e HCT116 (média TGI = 61%) xenoenxertos de tumor (P 0,05 versus controlo).
(A) HT29 e HCT116 As curvas de crescimento de tumor de xenoenxerto. Os animais foram tratados durante 28 dias com veículos, RAD, IRI, ou a combinação de RAD + IRI. Os dados representam a média ± SEM de 9-12 tumores por grupo.
* P 0,05 comparativamente ao veículo. (B) modelos farmacocinéticos-farmacodinâmicos foi realizada para avaliar quantitativamente a intensidade da combinação RAD + IRI no HT29 e tumorais HCT116 xenoenxertos. Esta é uma representação gráfica do termo de interacção (ψ) para a combinação RAD + IRI. Cada barra representa o valor ψ para um tumor individual. ip valores 1.3 são sinérgicos, 1,3 ψ 0,7 são aditivos, 0,7 ψ 0 estão a menos de aditivo, e ψ 0 são antagônicos
Modelagem dos perfis de crescimento do tumor e efeito do tratamento revelaram que a combinação de everolimus e irinotecano estava no aditivo média (ψ média =. 0,9) em tumores HT29 (Figura 3B). Cada tumor foi modelado individualmente e dos 10 tumores HT29, 1 mostrou uma resposta sinérgica, 8 mostraram uma resposta e um aditivo era menos do que aditivo, mas não antagonista. ψ representa o termo usado no modelo matemático para descrever o efeito combinatório, onde ψ 1,3 é sinérgico; 1,3 ψ 0,7 representa uma interacção aditiva, 0,7 ψ 0 é um menos de efeito aditivo e ψ 0 é antagônica. Os detalhes sobre a modelagem e dados de tumores individuais e as convulsões podem ser encontrados no suplemento S1, seção SA.3., E Suplemento S2. Os perfis de crescimento dos xenoenxertos HCT-116 foram muito mais variável do que os tumores HT29. Portanto, embora a inibição média de crescimento do tumor do tratamento de combinação é semelhante nos dois tipos de tumor (TGI = 64% vs 61%), em tumores HCT116 o benefício foi, em média menos do que aditivo (ψ média = 0,5). Mais uma vez, cada perfil de crescimento do tumor foi modelado individualmente e 3 tumores apresentaram um efeito aditivo, 5 eram menos do que aditivo e 2 foram antagonistas.
foram medidos os efeitos de everolimus, irinotecano e a combinação dos dois sobre o metabolismo do tumor num subconjunto de animais no final do estudo. perfis metabólicos foram determinadas por
1 H-,
13C e
31P- NMR. A Figura 4 mostra metabólicas térmicos de mapas para descrever alterações metabólicas entre os grupos de tratamento em relação ao grupo controle em HT29 e HCT116 xenotransplantes. Os efeitos de everolimus no metabolismo da glucose, lactato e diminuir na glicólise, foram semelhantes em HT29 e tumores HCT116, consistente com a resposta de crescimento do tumor observada em dois tipos de tumores. HT29 tumores mostraram uma resposta mais profundo para o tratamento de irinotecano, o que está principalmente relacionado com a acumulação de lípidos, especialmente poli-insaturado e fosfolípidos, que pode estar relacionado com o aumento da degradação celular e necrose. Mais uma vez, isto é consistente com os perfis de crescimento tumoral de tumores HCT116 e HT29 que mostraram que HT29 tumores responderam ao tratamento irinotecano enquanto os tumores HCT116 não o fez. A combinação de everolimus com irinotecano foi associado com o aumento da acumulação de lípidos, degradação da membrana (GPC aumento e diminuição da PC /GPC) e em algum grau diminuiu a glicólise em tumores HT29. A mesma resposta não foi observado em tumores HCT116, apesar da inibição média de crescimento do tumor da combinação de tratamento produzindo aproximadamente o mesmo resultado. No geral, HT29 tumores eram metabolicamente mais sensível a todos os tratamentos de tumores HCT116.
1 H-,
13C, e os dados
RMN de 31P são representados como média ± SEM de 3- 6 medições. Os metabólitos, suas relações e fluxos metabólicos foram agrupados de acordo com sua relevância bioquímica. Para o grupo controle, todos os níveis de metabólitos intracelulares são dadas como umol por peso molhado de células gramas e índices metabólicos não têm unidades. As vias metabólicas que foram não perturbadas pelo tratamento são apresentados como mapas amarelo. Uma diminuição no ponto final metabólica é indicado pela cor vermelha, enquanto um aumento de manchas verdes. significância estatística para alterações de metabolitos são baseadas na análise multivariada de fluxos metabólicos com p 0,02. O banco de dados matriz perfil metabólico interativo foi personalizada baseada em [23].
Discussão
O desenvolvimento de novas terapias e estratégias terapêuticas requer o uso de modelos pré-clínicos. Frequentemente, a atividade pré-clínico impressionante de novos agentes promissores e combinações de agentes não se traduz em tratamentos clínicos viáveis. desenho racional de estudo com endpoints quantitativos é fundamental para a tradução eficaz de estratégias de combinação e biomarcadores de eficácia [6], [41]. O objetivo geral do estudo aqui descrito foi estabelecer quantitativamente o efeito combinatório da terapia everolimus e irinotecan em modelos murinos de CRC, abrigando difícil de tratar genótipos, utilizando regimes de dosagem guiada por farmacocinéticos. Com base humana e de ratinho informação farmacocinética, estabelecemos doses de everolimus e irinotecano a ser utilizado na pré-clínicos in
in vivo
estudos que produzem exposições no intervalo dos observados em humanos. É importante notar que nós corrigido concentrações totais para as frações livres ou não ligados ao fazer comparações de dados farmacocinéticos entre ratos e seres humanos. Isto é crítico desde que a ligação frequentemente proteínas plasmáticas varia entre espécies e, em teoria, somente a fracção livre da droga está disponível para a interação com o alvo de interesse.
Testamos o everolimus e combinação de irinotecano
In vivo
em dois modelos linhagem de células de xenotransplante de CRC, HT29 e HCT116. A combinação foi bem tolerado como alterações de peso corporal significativas não foram observadas (Suplemento S3 Figura SC.2.). Avaliação da extremidade dos dados do tumor estudo a partir de cada tipo de tumor mostra que o tratamento com everolimus chumbo e de irinotecano a uma inibição estatisticamente significativa do crescimento do tumor e o grau de resposta é semelhante nos dois tipos. No entanto, aqui mostram que através da avaliação de perfil de crescimento de cada tumor, o volume como uma função do tempo, que são capazes de explicar as diferenças no crescimento e na resposta entre os dois tipos de tumor. Através da modelagem matemática do controle, único agente e combinação braços do estudo, fomos capazes de avaliar quantitativamente a interação dos dois compostos e constatou que nos tumores HT29,
BRAF
e
PIK3CA
mutante, a combinação foi tumores HCT116 aditivos e em,
KRAS Comprar e
PIK3CA
mutante, a combinação foi bastante variável, mas menos do que aditivo, em média. Além de avaliar o crescimento do tumor nos avaliada quantitativamente os efeitos dos tratamentos sobre o metabolismo do tumor usando metabolômica com base em RMN.
metabolicamente, HT29 xenoenxertos foram mais ágil do que xenotransplantes HCT116. tumores HT29, mas não tumores HCT116, no grupo irinotecan exibida uma assinatura metabólica típico para terapia citotóxica, o acúmulo de lipídios e fosfolipídios, uma indicação de citotoxicidade /necrose [42]. Este resultado é consistente com os perfis de crescimento do tumor, o que mostra HT29 tumores que respondem ao tratamento com irinotecano (TGI = 39%, p 0,05), mas não tumores HCT116 (TGI = 17%). Estes resultados também concordam com as
in vitro
de dados, que mostram HT29 células (IC50 = 3 nm), sendo mais sensíveis do que as células HCT116 (IC50 300 nm) para o tratamento SN38. De acordo com as nossas simulações (Suplemento S2), as concentrações de SN38 livre no plasma variou de 1,300 a 7.25e-4 nM num período de 24 horas com uma concentração média de 4-18 nm, o que é bem abaixo do IC50 estimado para HCT116 células. Apesar da similaridade de perfis de inibição de crescimento de tumor de everolimus tratada HT29 tumores e tumores HCT116 (TGI = 41% vs 44%, respectivamente), HT29 tumores apareceu ligeiramente mais sensível do que metabolicamente tumores HCT116. Alguma redução da glicólise foi medido em ambos os tumores HCT116 e HT29, mas um aumento da GPC e alguma acumulação de lípidos foi também observada em tumores HT29. In vitro, as células HT29 foram mais sensíveis ao tratamento everolimus de células HCT116, tal como a IC50 para a proliferação foi inferior (1,2 nM contra 25 nM) e uma maior inibição de p-S6RP foi observada a 20 nM.
In vivo,
respostas semelhantes na inibição de p-S6RP e ciclina D1 foram observados em HT29 e tumores HCT116 (Suplemento S3 Figura SC3 e SC4); No entanto, medidas de p-S6RP pode não ser uma medida útil para avaliar a eficácia. Um estudo publicado anteriormente mostraram que o tratamento com everolimus em ambas as linhas resistentes e sensíveis pode resultar na desfosforilação total de S6K1 e S6 [33].
Especula-se que alguns dos a eficácia do everolimus observada em tumores HCT116 pode estar relacionada com efeitos anti-angiogénicos de everolimus. efeitos anti-angiogénicos de everolimus foram previamente relatada [33], [43] e os efeitos anti-angiogénicos seria muito mais difícil de detectar pelo metabolômicas tumorais inteiras, como aqui realizada, uma vez que a fracção de células endoteliais comparado com o tecido tumoral total é bastante pequena. Evidência adicional para apoiar esta pode ser derivada a partir dos dados farmacocinéticos everolimus. As concentrações plasmáticas livres produzidos na dose de 5 mg /kg nos animais variou 0,2-6 nM (C
min para C
max) com uma concentração livre média (C
SS, avg) de cerca de 1,5 nM, o que seria suficiente para inibir o crescimento HT29, mas não HCT116 e, comunicar os dados anteriores a actividade anti-proliferativa de everolimus potente contra o VEGF e bFGF estimuladas células endoteliais (HUVEC) com valores de IC 50 0,1-0,8 nM [33].