Abstract

O crescente interesse em quantificar a base molecular da ativação da proteína quinase e regulação alostérica por mutações de câncer tem alimentado estudos computacionais de sinalização alostérico em proteínas quinases. No presente estudo, nós combinamos simulações em computador e a análise panorama energético de proteínas quinases para caracterizar a interação entre mutações oncogênicas e sites localmente frustrados como catalisadores importantes da activação da cinase allostetric. Enquanto o núcleo quinase estruturalmente rígida constitui um hub minimamente frustrado do domínio catalítico, frustrado localmente grupos de resíduos, cujas redes de interação não são energeticamente otimizado, são propensas a modulação dinâmica e poderia permitir transições conformacionais alostéricos. Os resultados deste estudo demonstraram que o efeito panorama energético de mutações oncogênicas pode ser alostéricos provocando mudanças globais na distribuição espacial dos resíduos altamente frustrados. Verificou-se que a sinalização induzida por mutação alostérico pode envolver um acoplamento dinâmico entre estruturalmente rígido (minimamente frustrado) e plástico (aglomerados localmente frustrados) de resíduos. O estudo apresentado demonstrou que mutações de cancro activação podem afectar o equilíbrio termodinâmico entre estados quinase por alostericamente alterar a distribuição dos sítios localmente frustrados e aumentando a frustração local, na forma inactiva, enquanto eliminando sítios localmente frustrados e restaurar a rigidez estrutural da forma activa. A análise Landsape energia de proteínas quinases eo papel proposto para locais localmente frustrados em mecanismos de activação pode ter implicações úteis para triagem bioinformática baseada e detecção de sítios funcionais críticos para a regulação alostérica em sistemas biomoleculares complexas

Citation:. Dixit A, Verkhivker GM (2011) A análise da paisagem Energia of Cancer Mutações em Proteínas Quinases. PLoS ONE 6 (10): e26071. doi: 10.1371 /journal.pone.0026071

editor: Jie Zheng, da Universidade de Akron, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de junho de 2011; Aceite: 19 de setembro de 2011; Publicação: 06 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Dixit, Verkhivker. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é parcialmente apoiado pelo financiamento da Universidade de Kansas. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

comunicação rápida e eficiente das mudanças conformacionais de longo alcance em proteínas desempenha um papel vital na regulação alostérica de sistemas biológicos [1], [2]. Recentes comentários seminais de allostery proteína têm enfatizado um papel central de cooperatividade ea noção de que a catálise e allostery podem surgir através de vias de comunicação comuns [3], [4]. Modelagem de transições alostéricas em moléculas biológicas foi avançado significativamente pelo desenvolvimento de modelos de redes elásticas e as abordagens normais de análise de modo [5] – [22]. modelos de redes elásticas da dinâmica de proteínas e teoria de propagação do sinal, têm permitido uma análise quantitativa de proteínas interacções alostéricas de longo alcance [13] – [16]. análise baseada na sequência evolutiva [23], [24] e abordagens baseadas na estrutura [19], [20], [25] – [27] demonstraram que as vias alostéricos em proteínas pode ser formado através de interacções de evolutiva conservada e escassamente ligado aglomerados de resíduos que são energeticamente acoplados para mediar a comunicação de longo alcance. Uma análise abrangente de mecanismos alostéricos levou a uma visão unificada de regulação alostérica que implica a existência de pré-existente estados conformacionais e múltiplas vias de comunicação na paisagem conformacional [28] – [32]. teorias paisagem Energia e modelos de energia simplificados forneceram um quadro teórico robusto para elucidar aspectos fundamentais da estrutura da proteína, a dinâmica e regulação alostérica [33] – [43]. De acordo com a teoria da paisagem de energia moderna, sequências aleatórias têm paisagens ásperas com muitos mínimos locais devido a interacções conflitantes graves (um fenômeno chamado de “frustração”) e, como resultado, a prevalência de conformações estruturalmente alternativas ainda energicamente semelhantes. Os modelos de paisagem de energia também têm sugerido que sequências proteicas-like pode ter evoluído para eliminar parcialmente as interações frustrados entre aminoácidos e ter suavizado ( “funil-like”) paisagens para garantir rápida dobrar às suas estruturas nativas termodinamicamente estáveis. Isto tornou-se conhecido como o “princípio da frustração mínima” [44], [45]. A natureza afunilada semelhante das paisagens de energia para proteínas naturais implica que as conformações que são estruturalmente semelhantes ao estado nativo, também são pobres em energia, e as interacções estado nativo são minimamente frustrado [33] – [45]. Uma visão generalizada de regulação alostérica com base na teoria da paisagem de energia (frequentemente denominado como um “modelo de selecção conformacional”) sugere que uma proteína pode funcionar num equilíbrio dinâmico de estruturalmente diferentes estados conformacionais, pelo que o efeito de se ligar ou a mutação pode ser propagada ao longo longas distâncias por cooperativamente deslocando o equilíbrio para uma conformação funcional relevante [46] – [52]. A vista “velho” (induzida mecanismo de ajuste) ea vista “novo” (mecanismo de seleção conformacional) de allostery proteína pareceu não ser mutuamente exclusivas, mas sim complementares na racionalização de mecanismos alostéricos no nível molecular [53] – [56]. abordagens de simulação baseados na física têm proporcionado uma evidência convincente de ligação entre movimentos coletivos e mudanças estruturais locais como um importante princípio subjacente de comunicação alostérico em biomoléculas [53] – [60]. abordagens baseadas em termodinâmica ter ainda mais ligada perturbações estruturais globais e locais com mudanças livres de energia de acoplamento alostérico em mecanismos de comutação conformacional [61] – [64]. Além disso, os modelos de paisagem de energia têm sugerido que de longo alcance cooperatividade de interações proteína-proteína durante as transições alostéricas podem favorecer uma combinação da população-shift e mecanismos induzir-ajuste, enquanto o de curto alcance, a ligação alostérica de proteínas com inibidores muitas vezes poderia prosseguir através do mecanismo de população-shift [65] – [72]

Ferreiro e Wolynes [69] avançaram recentemente, a teoria da paisagem de energia através da combinação de modelagem biofísico e bioinformática estrutural análises das interações proteína locais que são fundamentais para dobrar. , a regulamentação vinculativa e alostérico. De acordo com este modelo, paisagens minimamente frustrados de redes de proteínas pode ter evoluído para adquirir a capacidade para a regulação através de mudanças alostéricas cooperativas. O método proposto foi quantificado o grau de frustração locais espacial em proteínas usando uma versão local da formulação critério lacuna mundial do princípio da mínima frustração [33] – [45]. Este modelo introduzido um frustração locais métrica denominado “índice frustração configuracional” como uma medida da estabilização do local para um par nativa indivíduo com respeito a um conjunto de chamarizes estruturais gerado através da perturbação ambas as identidades e localização dos aminoácidos que interagem [69], [ ,,,0],70]. De acordo com este critério, se a energia de interacção de um par nativa de resíduos é suficientemente estabilização em relação ao conjunto de chamarizes estruturais, este par resíduo é designado como “minimamente frustrado ”, caso contrário as interacções podem ser classificados como” neutro ” ou “localmente frustrado”. Vale a pena notar que o princípio da frustração mínima não requer uma completa eliminação de estruturas alternativas localmente estáveis. Um certo grau de frustração local está sempre presente em uma estrutura de proteína de outra forma, em grande parte unfrustrated e pode ter surgido a partir de requisitos evolutivos para se adaptar dinâmica de proteínas para funções específicas [43].

A análise das regiões da proteína localmente frustrante que usa um não conjunto -redundant de 314 domínios de proteínas monoméricas e um conjunto com curadoria de complexos diméricos não redundantes mostrou que os sites localmente frustrados correspondem às regiões envolvidas na ligação com outras macromoléculas e ligantes e muitas vezes poderia colocar com os grupos funcionais propenso a grandes mudanças estruturais [69 ], [70]. Wolynes e colaboradores recentemente pesquisou uma base de dados curada de proteínas alostéricos com estruturas cristalinas inactivos e activos conhecidos e têm demonstrado que os domínios de proteína alostéricos estão ligados por uma rede de interacções minimamente frustrados, enquanto que os resíduos altamente frustrados poderia ser preferencialmente agrupado perto da superfície da proteína [71 ], [72]. De acordo com este estudo, regiões minimamente frustrados em proteínas alostéricos domínios constituem cerca de 40% do total de contactos, com cerca de 10% do total das interacções considerados “altamente frustrado”, e o restante de interacções atribuída à categoria “” neutra ” .

As proteína-quinases são interruptores de sinalização com um domínio catalítico conservado que fosforilam substratos proteicos e desempenham um papel fundamental em vias de sinalização celular [73] – [82]. genes de proteína-quinase constituem ~ 2% de todos os genes no genoma humano e desta família de proteínas é constituída por mais de 500 membros diferentes. As estruturas cristalinas da proteína-quinases incluem humanos 167 domínios únicos humanos proteína quinase quinases e 170, considerando ortólogos estreitamente relacionados (https://www.sgc.ox.ac.uk/research/kinases/). Estudos estruturais de estruturas de domínio catalítico de proteína cinase e complexos de proteínas reguladoras revelaram cenários distintos pelos quais quinases pode controlar um equilíbrio dinâmico entre os estados inactiva para cinase activas e altamente específicos estruturalmente semelhantes – uma característica estrutural do domínio quinase crítico para a sua função normal [83] – [89]. A regulação alostérica pode ser conseguida através de diferentes mecanismos, incluindo a estabilização inibidor-induzida da conformação inactiva específica em ABL [90] – [95], BRAF [96], KIT [97], PDGFR, p38 [98], PI3K cinases [99] e vinculativa para o bolso alostérico de ligação miristoilo na ABL [100] – [103]. a activação da proteína-quinase pode também ser regulada através da formação de estruturalmente diversos complexos reguladores mais notavelmente exemplificados para ABL [104], [105] e EGFR cinases [106] – [109], ainda por um mecanismo estrutural unificador associado com disposições da tirosina quinase assimétricos na regulação complexos podem estar subjacentes o mecanismo de activação de toda a família de proteínas EGF [110] – [113]. Um progresso constante na compreensão dos mecanismos de proteína quinase tem alimentado um esforço considerável para descobrir e inibidores da ATP-competitivas e alostéricos seletivos projeto visando formas específicas de câncer, mutantes câncer quinase e caminhos direcionados associados [114] – [116].

ativação anormal de regulação em proteínas quinases é uma fonte dominante de mutações somáticas associadas ao tumor. investigações estruturais e mutagénese de ABL [93] – [95] e do EGFR cinases [117] – [119] revelaram divergência estrutural das cinases em resposta a mutações de activação. estudos de bioinformática ampla-kinome ter contribuído para a identificação de motivos de sequência conservados com mutações associados a doenças e cancerosas, sugerindo que um número significativo de mutações cancerosas oncogénicos podem formar pontos quentes mutacionais estruturalmente conservadas dentro do núcleo quinase catalítico [120] – [123]. estudos de simulação de computador têm investigado mecanismos moleculares da ativação da proteína quinase em c-Src [124] – [127], adenilatoquinase [128], a ABL [129], CDK5 [130], KIT [131], RET, MET [132] e cinase de EGFR [133] – [135]. estudos de simulação multi-escala de transições conformacionais nas formas normais e oncogénicas de ABL e cinases de EGFR indicaram que o impacto dos mutantes oncogénicos podem espalhar-se para além do local de mutação imediato que conduz a alterações alostéricas globais [134]. Mais recentemente, a modelação computacional de regulação alostérica revelou princípios da activação induzida por mutação no ABL e EGFR quinases, o que pode ser determinado por um acoplamento dinâmico entre estruturalmente rígido αF-hélice e conformacionalmente adaptativa αI-hélice e aC-hélices [136] organizar . Estes elementos estruturais formar uma rede dinâmica de forma eficiente interagindo regiões funcionais que podem universalmente controlam a comunicação entre domínios de longo alcance e activação alostérico em proteínas quinases. Os estudos de paisagem de energia têm sugerido previamente que a frustração localizado pode ser conectado com mudanças de conformação alostéricos em proteínas [69] – [72].

Em conjunto, estudos computacionais sugerem que mecanismos moleculares de regulação alostérica em proteínas quinases pode ser descrita utilizando modelos de modulação induzida por mutação da paisagem conformacional e princípios de seleção de conformação dos estados termodinamicamente relevantes. Neste trabalho, a análise bioinformática estrutural à base de kinome e modelagem biofísico de estruturas de proteínas quinase foram empregadas para caracterizar e quantificar a interação entre mutações oncogênicas quinase e sites localmente frustrados como potenciais catalisadores e mediadores de activação da quinase. Os resultados deste estudo sugerem que o efeito panorama energético de mutações oncogênicas pode ser alostérico na natureza, provocando mudanças globais na distribuição espacial dos resíduos altamente frustrados. Mostramos que as mutações de câncer poderia agir perturbando simultaneamente a rede de interações minimamente frustrados no estado quinase inactiva, reduzindo a frustração local e restaurar interacções alostéricas na forma quinase activa. Por isso, os sites localmente frustrados no núcleo catalítico pode servir um papel funcional importante, permitindo transições de conformação induzida por mutação em direção à conformação quinase constitutivamente ativa.

Resultados

As paisagens de energia e frustração local em Protein quinases

no presente estudo, nós combinamos dinâmica molecular (MD) simulações de proteínas quinases com a análise da paisagem energia para caracterizar o papel da frustração local como um importante fator associado com a ativação da quinase allostetric. Do ponto de vista da paisagem de energia, as características mecânicas das transições de activação deve ser determinada pela topologia estrutural da prega domínio de cinase e, por conseguinte, poderia capturar aspectos salientes do mecanismo de activação. Para investigar o papel da frustração local em transições conformacionais entre estruturalmente diferentes estados funcionais, pesquisamos os perfis frustração locais em estruturas de proteínas quinase e caracterizada a rede de interações minimamente frustrados responsáveis ​​pela estabilidade estrutural do núcleo catalítico da quinase. Também localizado e conjuntos de sites localmente frustrados onde o princípio mínimo de frustração poderia ser violados caracterizado. A mudança no índice frustração configuracional sobre mutação podem proporcionar uma medida quantitativa de uma tendência para provocar uma mudança conformacional na proteína. O efeito de mutações cancerígenas quinase em perfis frustração locais nos permitiu quantificar como a redistribuição induzida pela mutação de resíduos localmente frustrados pode promover transições alostéricas entre estados funcionais estruturalmente distintas. O índice de frustração configuração pode medir a estabilidade relativa de um contato específico em relação nativo para o conjunto de todos os contatos possíveis nesse local, permitindo assim classificar os contatos nativas individuais na estrutura da proteína de acordo com seu nível de frustração. Um exame de todo o kinome do índice frustração configuracional calculado para um grande número de estruturas de cristal da proteína quinase (Tabela S1 no ficheiro S1) revelou que os valores típicos podem variar entre -4 a +4. A distribuição global baseado no resíduo de um índice de frustração para as quinases do tipo selvagem (WT) foi inclinado para resíduos minimamente frustrados com os valores positivos do índice de frustração (Figura 1A). A distribuição também exibiu um pico superficial menor correspondente aos resíduos localmente frustrados com o índice frustração na gama de -0,6 a -0,7 unidades. O impacto das mutações resultou em uma mudança sutil, mas perceptível na distribuição local de frustração no núcleo catalítico, revelando um segundo pico igualmente importante em torno de -1.0 valor. Assim, a distribuição global foi quase uniformemente dividida entre os resíduos minimamente frustrados e frustrados, deixando menos resíduos no estado neutro (Figura 1B).

de tipo selvagem quinases (a) e (B) cinases mutantes.

Estamos focados em seguida, na análise frustração local, realizada por um subconjunto de genes da proteína quinase (ABL, EGFR, BTK, Kit, BRAF, reuniu-se, e RET), que representam a grande maioria das mutações altamente oncogênicos no domínio catalítico (Tabela S2 no ficheiro S1). Estes genes de proteínas quinase foram escolhidos para uma análise mais detalhada por causa da riqueza de informações estruturais e funcionais que forneceu dados experimentais complementares para a validação dos nossos modelos. Mais importante, no entanto, um repertório diverso de activação e de drogas mutações nestes genes resistentes quinases representam culpados cancerosas críticos que poderiam frequentemente contribuem para um estado de dependência oncogene em uma variedade de cancros. A distribuição da frustração local nestes genes de quinase, tal como medido pelo índice de frustração configuracional, revelou um padrão distinto onde os picos foram visivelmente deslocado para resíduos mais frustrado, tanto para a WT e cinases mutantes (Figura 2). A percentagem de interações frustrados minimamente no núcleo catalítico responsável por mais de 40% do total de contactos, com cerca de 15-20% das interações frustrados ser considerado como sendo o restante neutro. Esta análise geral concordaram com a distribuição relatado de regiões frustrado e partição de minimamente e resíduos altamente frustrados em proteínas [69], [70]. No entanto, a fracção média de resíduos localmente frustrados foi maior em proteína-quinases do que a relatada para as pequenas proteínas monoméricas. Por isso, os nossos dados sugerem que as paisagens conformacionais de oncogenes quinase pode ser caracterizada por um aumento do nível de frustração local e a mobilidade da proteína.

de tipo selvagem quinases (a) e (B) cinases mutantes. Um conjunto de oncogenes quinase utilizados incluíram ABL, EGFR, BTK, KIT, MET, BRAF, e quinases RET. A análise incluiu os mutantes desses genes quinase com alto potencial oncogênico de acordo com os perfis de freqüência nas amostras de mutações ( 5). Obtido a partir do repositório COSMIC [153]

Com base nesta análise, proposto que a distribuição espacial da frustração local na proteína-quinases pode ser regulada e facilmente alterados por mutações oncogénicas. De acordo com a nossa conjectura, mutações ativadoras quinase poderia ampliar a frustração local no estado inativo, eliminando (ou parcialmente remover) locais localmente frustrados no estado ativo. Como resultado, a redistribuição induzida por mutação da frustração local em estruturas de proteínas cinase podem contribuir para os mecanismos moleculares que controlam a actividade de quinase através da alteração do equilíbrio dinâmico entre formas quinase funcionais. Para verificar esta hipótese, analisamos as mudanças nos perfis de frustração locais para um conjunto representativo de ABL altamente oncogênico (Figura 3) e mutantes quinase EGFR (Figura 4) em ambos os estados inativos e ativos. Observou-se que as mutações altamente oncogénicos podem de facto causar um aumento da frustração local dos resíduos mutados no estado autoinhibitory inactivo do ABL (PDB ID 1IEP) [90] e EGFR (PDB ID 1XKK) [117] (Figuras 3, 4). Assim, mutações quinase com um alto potencial oncogênico pode desestabilizar a forma quinase autoinhibited. Importante, mutações oncogênicas poderia, em parte, aliviar a frustração local no estado quinase activa (Figuras 3, 4). A mais extensa rede minimamente frustrado de interações rigidifies a forma ativa do domínio catalítico de ABL (PDB ID 1M52) [91], [92] e EGFR (PDB ID 2J6M) [118]. Embora as estruturas de cristal utilizados no nosso estudo (Tabela S1 no ficheiro S1) foram na maior parte resolvido na forma não ligada, houve algumas estruturas do conjunto estudada (particularmente ABL e EGFR quinases) que foram originalmente cristalizado em complexos com ATP ou inibidores de moléculas pequenas . Desde ATP vinculativo poderia potencialmente aumentar a rigidez estrutural do domínio catalítico, a análise frustração local que incluiu estruturas com um ATP removido podem produzir mudanças artificiais no índice de frustração para a ligação de resíduos no local. Foi avaliada a distribuição estatística global do índice de frustração configuracionalmente usando estruturas cristalinas com moléculas ligadas. O efeito verificou-se ser negligenciável e a distribuição resultante foi virtualmente indistinguível do que é mostrado na Figura 1. De facto, uma fracção significativa dos resíduos de proteína quinase interacções envolvidas na ligação do sítio pertencem à região de charneira estruturalmente rígido que é um minimamente frustrado elemento do núcleo catalítico e, como tal, robusta para pequenas perturbações de interacções. No entanto, encontramos algumas pequenas variações interessantes nos perfis frustração locais de ABL (Figura S1) e quinases EGFR (Figura S2), que foram observados para mutações oncogênicas do P-laço rico em glicina (ABL-G250E, ABL-Q252H, ABL-E255K, EGFR-G719S, G719A-EGFR, o EGFR-G719C). Sabe-se que a ansa P na quinase Abl pode ser estabilizado na estrutura inactiva ligada a imatinib, o que pode explicar o aumento da frustração local, aquando mutações P-loop no estado inactivo (dados S1, S2). Interessantemente, estas mutações pontuais são conhecidos para afectar a ligação de imatinib (Gleevec) para ABL, deslocando o equilíbrio termodinâmico para a forma activa incompatível com o inibidor de ligação [114] – [116]. Nossos dados sugerem que a induzida por mutação frustração local no estado quinase inactiva-bound inibidor pode contribuir parcialmente para iniciar uma mudança da população entre as formas funcionais. Analisamos também a distribuição e partição estrutural das regiões minimamente frustrados e localmente frustrados na ABL quinase (Figura S3). Uma rede densa de resíduos minimamente frustrados foi encontrado no núcleo estruturalmente rígida do domínio catalítico (ligados por linhas verdes). Este web minimamente frustrado foi formada por estruturalmente conservada αF-hélice e αE-hélice. Em contraste, os conjuntos de resíduos localmente frustrados (ligados por linhas vermelhas) montados na periferia de proteína, incluindo o aC-hélice, ansa de activação, a P + 1 loop no lóbulo terminal-C. Como as interações autoinhibiting liberados na forma ativa, proteínas quinases poderia tornar-se mais flexível, com um considerável grau de frustração locais residual. Isto reflectiu-se no aumento da presença de resíduos localmente frustrados ligados por linhas vermelhas no aC-hélice, e o lóbulo C-terminal da ABL ativa (Figura S3B).

Os valores do índice de frustração baseada em resíduos são mostrado por um conjunto de mutantes oncogénicos Abl na inactivo (a) e formas activo (b). Os valores de índice frustração são mostrados em barras amarelas cheias para a forma cinase de tipo selvagem e em barras vermelhas preenchido para as formas mutantes. A análise foi realizada na forma não ligada das estruturas cristalinas de ABL na forma inactiva (PDB ID 1IEP) [90] e a forma activa (PDB ID 1M52) [91], [92].

os valores de índice frustração baseado em resíduos são mostradas para um conjunto de mutantes de cinase de EGFR oncogénicos no inactivo (a) e formas activo (b). Os valores de índice frustração são mostrados em barras amarelas cheias para a forma cinase de tipo selvagem e em barras vermelhas preenchido para as formas mutantes. A análise foi realizada no formulário independente das estruturas cristalinas de EGFR na forma inativa (PDB ID 1XKK) [117] e forma ativa (PDB ID 2J6M) [118].

Frustração Local e proteína flexibilidade

Nós também investigou a relação entre a frustração local e flexibilidade da proteína de estruturas quinase. Em nossos estudos anteriores, que têm caracterizado as paisagens de conformação de ABL, EGFR, RET e quinases MET, bem como vários mutantes de câncer usando simulações de DM da quinase Apo e complexos com ATP e inibidores de pequenas moléculas [132], [134], [ ,,,0],136]. Aqui, nós comparamos os resultados da análise frustração local com os perfis de flexibilidade quinase, que foram inferidos a partir de simulações MD e avaliadas por meio do root mean flutuações quadrados (RMSF) dos resíduos domínio catalítico. Em particular, estudos MD de cinases de EGFR e ABL nos estados normais e oncogénicas exibido uma elevada flexibilidade local na porção inferior da ansa de activação [134], [136]. Da mesma forma, o feixe de hélices no C-terminal, o que representou o aglomerado mais densa de minimamente frustrados resíduos (Figuras S4, S5), também demonstrou a menor variação nos valores RMSF – uma característica do núcleo da proteína estruturalmente rígido [134] . Os perfis de frustração locais também correspondeu-se muito bem com os B-fatores dos resíduos da proteína quinase. Um exemplo de tal análise comparativa foi detalhado para o EGFR-WT na forma activa (Figura S5). Uma forte correlação foi encontrada entre o índice de frustração local com base em resíduos e os valores de fator B (Figura S5 D). Também foi observado que os resíduos de EGFR altamente frustrados correspondeu às regiões conformacionalmente móveis com os valores de fator B mais elevados. Para ilustrar ainda mais estes resultados, realizamos o mapeamento estrutural dos B-fatores médios para um conjunto de estruturas inativos (Figura S5 A) e ativos (Figura S5 B) de ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, e cinases RET . Além disso, localmente resíduos frustrados também foram mapeados para o núcleo catalítico. Os locais localmente frustrados correspondeu a regiões da proteína com a mobilidade térmica aumentada e sobreposto com os resíduos da proteína de B-factores mais elevadas.

A análise de flexibilidade da proteína quinase tem também demonstrado que as alterações conformacionais nas regiões funcionalmente importantes quinase podem ser alostericamente acoplados e altamente correlacionadas. Mais especificamente, encontramos evidências de movimentos de proteínas altamente correlacionadas e acoplamento alostérico da aC-hélice e alça de ativação com todas as outras regiões quinase (Tabela S3 em S1 Arquivo). Curiosamente, o aC-hélice e a ansa de activação representado duas regiões da proteína cinase mais fortemente acopladas. Outros segmentos altamente correlacionados do domínio catalítico incluiu (a) a região charneira e o laço catalítico, e (b) o circuito de ansa P e a activação. Estes achados consistentes com a nossa recente análise de movimentos coletivos na ABL e EGFR complexos regulatórios que manifestam em “respirar” os movimentos de corpo rígido do núcleo catalítico juntamente com as flutuações do P-loop, ativação, aC-hélice eo αG-hélice do C-terminal [136]. Numerosos estudos de biologia estrutural também indicaram um envolvimento central do circuito aC-hélice e activação de acoplamento alostérico que controlam regulação da atividade da proteína quinase [110] -. [113]

Alostérica Efeito da Oncogênicos Mutações no Frustração local

investigamos se a distribuição espacial da frustração local pode apresentar pontos de iniciação para modificações conformacionais globais e se o efeito de mutações oncogénicas em a frustração local seria local ou alostérico. Se o efeito de mutações oncogénicas foi locais, que iria causar apenas perturbações locais e resultar em valores negativos da frustração índice para os resíduos na proximidade imediata do local de mutação. No entanto, se o efeito de mutações oncogénicas foi global, a distribuição espacial dos resíduos altamente frustrados alostericamente pode ser afectada e resultar em alterações notáveis ​​na unidade remota a partir das regiões do sítio de mutação. Uma comparação dos resíduos de mapeamento localmente frustrado no mutante ABL-WT e ABL-T315I revelou alterações subtis ainda relevantes, onde a maioria dos resíduos foram efectuadas à distância a partir do local de mutação (Figura 5). Observou-se que a mutação porteiro sob a forma de cinase inactiva pode perturbar alostericamente a rigidez estrutural do núcleo catalítico e aumentar a frustração local do αF-hélice, αE-hélice, e regiões aC-hélice. Os nossos resultados corroboraram com uma espectrometria de massa de troca de hidrogénio (HX MS) estudo de quinase Abl [100], indicando que o efeito da mutação ABL-T315I pode resultar não apenas em perturbações conformacionais locais próximos a aC-hélice, mas também alterar alostericamente proteínas flexibilidade no distante a partir de regiões de proteína de mutação. As alterações na frustração local, induzida por mutação ABL-T315I na cinase inactiva pode ser ilustrada nos exemplos apresentados nas Figuras S6, S7. Enquanto parcelas frustração de ABL-WT e ABL-T315I foram geralmente similares, houve algumas mudanças nos agrupamentos linha vermelha que ligam Asp-381 do motivo DFG para Glu-286, que faz uma importante ligação de hidrogênio com Lys-271 (Figura S6) . Outra modificação pode ser observado na folha β-anti-paralelo a partir da parte inferior da ansa de activação (Figura S7). Nesta região alguns dos resíduos tornam-se altamente frustrado após mutação, como é evidente por linhas vermelhas resíduos de ligação Tyr-393, Ala-395 e Pro-402.

A distribuição espacial de frustração local nas formas inativas de ABL WT (A) e ABL-T315I (B). O esquema de cores de deslizamento de frustração locais varia de minimamente frustrado (em azul) para altamente frustrado (mostrado vermelho). As regiões funcionais da proteína quinase juntamente com a respectiva faixa de resíduos de proteínas são referidas por setas. mapeamento estrutural da frustração local no núcleo catalítico cinase ABL é mostrado para a estrutura inactiva ABL-WT (PDB ID 1IEP) [90]. O efeito de T315I na estrutura inactiva ABL foi avaliada através de modelação estrutural descrito na secção Materiais e Métodos. O programa PyMOL foi usado para visualização de estruturas de proteínas quinase e o mapeamento frustração local (The Graphics System PyMOL Molecular, Versão 1.2r3pre, Schrödinger e LLC).

É importante ressaltar que parcial desdobramento da anti- paralelo β folhas na extremidade inferior da ansa de activação foi previamente determinado como um pré-requisito para a estabilização da estrutura de Src como intermediário e uma característica comum dos mecanicista ABL e vias de activação de EGFR [134]. Na conformação Src-like, aC-hélice foi rodado e movido para fora do local activo (posição aC-hélice-Glu-out), o motivo DFG capotou no intermediário posição DFG-in, o anti-paralela β-folha de