Abstract

E-caderina é frequentemente perdida durante a transição epitelial-mesenquimal e a progressão de desenvolvimento de neoplasias epitelial. Encontramos um marcador de transição epitelial-mesenquimal, CD44, regulada em resposta à perda funcional da E-caderina em linhas de células de esôfago e câncer. A perda da expressão de E-caderina está correlacionada com a expressão aumentada de CD44 isoforma padrão. Usando um modelo de reconstruir organot�ica, que mostram aumento da expressão de CD44 em áreas de invasão celular está associada a MMP-9 na vanguarda. Além disso, a activina A aumenta a invasão celular através de regulação positiva de CD44 após a perda de E-caderina. Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem evidências funcional do CD44 upregulation na invasão câncer de esôfago

Citation:. Le Bras GF, Allison GL, Richards NF, Ansari SS, Washington MK, ANDL CD (2011) CD44 regulação alta no E- caderina-negativas cânceres de esôfago resultados em celular Invasion. PLoS ONE 6 (11): e27063. doi: 10.1371 /journal.pone.0027063

Autor: Adam I. Marcus, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 29 Julho, 2011; Aceito: 10 de outubro de 2011; Publicação: 01 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Le Bras et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. CDA é o destinatário de uma Scholar Award Pesquisa da American Gastroenterological Association (AGA) /Fundação para a Saúde Digestiva e Nutrição (FDHN) e apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (DK075379). Queremos agradecer a Imuno Core e do Translational Núcleo da Universidade de Vanderbilt para corte e colorações IHC, e outras instalações do núcleo apoiadas pelo Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) ea concessão Vanderbilt Ingram Cancer Center Support (P30-CA068485). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

CD44, ou o grupo sanguíneo indiano, é uma glicoproteína transmembranar e um receptor para o ácido hialurónico (HA), um componente principal da matriz extracelular [1]. CD44 desempenha um papel importante na integridade dos tecidos e está envolvida em várias funções associadas com a progressão do cancro, tais como a migração celular [2], a resistência à apoptose [3] e a apresentação dos factores de crescimento e proteases [4], [5]. Além disso, o CD44 foi identificado como um marcador específico de cancro de células estaminais [6], [7] e de células de tumor submetidas a uma transição epitelial-mesenquimal (EMT) -like processo [8]. Diferentes isoformas são convertidos devido a processamento alternativo dos exões 6-15 [9]. A forma padrão de CD44 (CD44s) é pensado para ser expressa ubiquamente, enquanto algumas formas variantes, CD44v, têm sido associados com metástases [10].

Um passo importante da EMT é a perda de E-caderina. E-caderina é um componente-chave de junções aderentes e medeia a adesão celular ao interagir com as proteínas citoplasmáticas p-catenina [11] e p120 [12]. junções aderentes estão ligados ao citoesqueleto de actina citoplasmáticos através de ligantes tais como α-catenina [13]. E-caderina pode ser transcricionalmente reprimida através Snail1, Snail2, torção, Zeb1 e Zeb2, que pode ser regulada por TGF [14]. A estimulação de células de cancro da mama com TGFp resulta na co-localização da metaloproteinase da matriz MT1-MMP e CD44 na membrana celular e induz a clivagem de CD44, resultando em níveis elevados de CD44 solúvel [15]. Por outro lado, a interacção entre CD44 e hialuronano modula o tráfico de receptor de TGF-p, que pode regular a sinalização de TGF-p [16].

Durante EMT, células epiteliais, tais como marcadores de express de CD44, que se sabe ser expresso em células estaminais do cancro [ ,,,0],8]. Activina A foi demonstrado ser um regulador chave da stemness [17]. Activina A, um membro da superfamília de TGF-p, também foi descrita para afectar o desenvolvimento, a hematopoiese e a tumorigénese [18] – [24]. Por isso, queria determinar se Activina A induz EMT em células do esôfago e, assim, vincula a indução da invasão de células de Activina A e expressão de CD44.

Nós temos mostrado previamente a perda coordenada de E-caderina e TGF-receptor II (TGFβRII) no carcinoma de esôfago [25]. Outros relatórios indicam a importância de CD44 no carcinoma epidermóide de esôfago demonstrando uma maior expressão de CD44v6 [26], [27], mas o seu impacto sobre a invasão do tumor permanece controverso. Portanto, teve como objetivo estudar a expressão de CD44 no epitélio escamoso do esôfago

in vivo

e

in vitro

. No presente estudo mostra-se que a regulação positiva de CD44 está associada com a perda de E-caderina em tecidos tumorais esofágicas primários e linhas celulares de cancro. Funcionalmente, foi demonstrado que a activina A sinalização na ausência de E-caderina pode regular positivamente a CD44. Além disso, CD44 ancora MMP-9 para a frente invasiva traduzindo em aumento da invasão celular. Estes resultados têm implicações importantes para um novo papel de Activina A na indução de EMT através de regulação positiva de CD44.

Métodos

cultura celular

células epiteliais do esôfago primárias (queratinócitos) do esófago humano normais foram estabelecidos como descrito anteriormente [25]. Em breve, foram utilizados sobrenadantes contendo pFB-neo retrovírus que codifica quer de comprimento completo de E-caderina ou um mutante dominante-negativa de E-caderina a que falta o cauda citoplasmática (designado como EC) para a transfecção de hTERT-imortalizadas, mas não transformada, células epiteliais do esôfago [28]. PFBneo vazio foi utilizado como um controlo. Além disso, um mutante negativo dominante de TGFβRII (uma oferta do Dr. H. Moses, Universidade de Vanderbilt, Nashville, TN), subclonado em pBABE puro, foi usado para gerar células ECdnT e pBABE puro vazio como um controlo. Full-length E-caderina em pFBneo também foi utilizado para restaurar a expressão de E-caderina em TE-8 e as células FLO-1. fibroblastos fetais esofágicas foram cultivadas em DMEM com 10% de soro fetal de bovino (FBS, Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). As linhas de esôfago carcinoma de células escamosas, células TE, foram um presente amável dos Drs. Rustgi e Nakagawa (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). linhas celulares de adenocarcinoma de esôfago OE33, FLO-1 e SK-GT-4 [29] – [31] e as linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço JHU-012 e JHU-013 foram desenvolvidos a partir da cabeça primária e carcinoma de células escamosas pescoço na Divisão de Cabeça e Pescoço Cancer Research na Universidade Johns Hopkins.

Para a inibição da caderina-e, as células foram semeadas a uma densidade de 2 x 10

5 células por poço em uma placa de 6. Após 24 horas, o meio foi mudado para DMEM isento de soro e as células foram transfectadas com uma concentração final de 10 nM de ARNsi utilizando transfecção com fosfato de cálcio (400 ul de água de RNAse-livre foi misturada com 50 uL de 2,5 M CaCl

2, 50 uL de 2 uM siARN com 500 mL de HBSP2x (NaCl 280 mM, 1,5 mM de nA

2 PO?

42H

2O, glicose 12 mM, 10 mM de KCl, 50 mM de HEPES pH7.05 em 500 mL de RNase água grátis)). siRNA foram obtidos de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), HS-CDH1_12 (SI1) e Hs_CDH1_13 (SI2) foram usadas contra a E-caderina e AllStars negativos, não-silenciamento de ARNsi sondas foram usadas para o controlo (Ctrl). Para a estimulação, 20 ng /ml de Activina A (R D, Minneapolis, MN) foi adicionado à cultura

Tissue microarrays

esofágicas tecidos de carcinoma escamoso foram adquiridos através de cirurgia no Okayama. Hospital universitário, Hospital Kitano eo Hospital da Universidade da Pensilvânia, através da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN). Todos foram patologicamente diagnosticado como carcinoma de células escamosas do esôfago (ESCC) [32]. Além disso, uma matriz de tecido comercial para ESCC, ACCUMAX Array (ISU ABXIS, Co., distribuído pela Accurate Chemical Scientific Corp., Westbury, NY) que contém 80 esôfago formalina câncer escamoso de parafina fixo incorporado (FFPE) tecidos de 40 pacientes e 4 controles normais foi utilizado para a coloração immunhistochemical. Juntos, os dados podem ser recolhidos para 166 amostras tumorais escamosas, 2 casos com a progressão do normal, carcinoma

in situ

a ESCC e controles adicionais de tecido normal.

One-hundred-e- trinta e três amostras de FFPE esofágicas adenocarcinoma (EAC) foram analisados ​​após coloração imuno-histoquímica. Estas amostras foram obtidas a partir dos arquivos dos departamentos de patologia da Universidade de Vanderbilt (Nashville, TN, EUA), Universidade Otto-von-Guericke (Magdeburg, Alemanha) e do CHTN [33]. O diagnóstico histopatológico de Barrett do esôfago, displasia e adenocarcinoma esofágico foi verificada com base em H E-seções manchadas de acordo com a classificação de Viena de neoplasia epiteliais gastrointestinais [34]. coloração imunohistoquímica foi efectuada utilizando anticorpo anti-Pan-CD44, clone F10-44-2, e anticorpo anti-E-caderina, o clone 36. Expressão pontuada numa escala de 0 a 3 sendo 0 ausentes, e 3 sendo a maior intensidade de sinal , localização e membranoso ou citoplasmática de coloração foi gravado. As amostras com contagens de 1 ou superior e com localização membranoso foram considerados positivos. Para sinais positivos de análise estatística, independentemente da intensidade foram considerados positivos e pontuações abaixo de 1 como negativo e estatisticamente analisados ​​utilizando 2 × 2 tabelas de contingência e teste exato de Fisher.

cultura organotípicas

culturas organotípicas foram cultivadas tal como descrito anteriormente [25]. Nas células do esôfago breves, humanas epiteliais (queratinócitos) foram semeadas em uma camada 03:01 colágeno I /matrigel com 7,5 × 10

4 fibroblastos esofágicas fetais humanos incorporados. O colagénio que foi adquirido da Organogenesis (Canton, MA) e Matrigel matriz a partir da BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ). No dia 11, as culturas foram aumentadas para uma interface ar-líquido para induzir a diferenciação do epitélio. As culturas foram colhidos no dia 15 e quer fixadas em formol a 10% (Fisher, Pittsburg, PA) para inclusão em parafina ou diretamente incorporado em Tissue-Tek O.C.T. composto (VWR, Batavia, IL) para cortes congelados.

Celulares Invasão Assays

ensaios de invasão foram realizados conforme descrito anteriormente [25] com 8 mm de tamanho de poro câmaras invasão Biocoat Matrigel FluoroBlok (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ). As células epiteliais (5 × 10

4 por câmara) foram semeadas em inserções Transwell as e as células invasoras coradas com calceína AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) depois de incubação durante a noite. Activina A foi adicionada com uma concentração de 20 ng /ml como um quimioatractor. Invasion foi quantificada usando o multimodo Leitor de placas Synergy HT (Bio-Tek, Winooski, VT). Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas duas vezes. Os dados são apresentados como média ± DP. Homem e Whitney foi realizado para análise estatística.

Os anticorpos

CD44 Hermes-III (a simpática oferta do Dr. Ellen Pure, Wistar Institute, Philadelphia, PA) foi utilizado para imunofluorescência em congelado Seções; clone anti-CD44 2C5 (R D systems, Minneapolis, MN) para Western Blot; CD44 e F10-44-2 α-tubulina (Abcam, Cambridge, MA) foram utilizados para imuno-histoquímica em FFPE e Western Blot, respectivamente; E-caderina adquiridos a BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ), β-actina e αSMA clone 1A4 foram ambos adquiridos a partir de Sigma (Saint Louis, MO), anti-MMP-9 a partir de Calbiochem (EMD Chemicals, Rockland, MA); S100A4 é da Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA) e vimentina clone V9 da Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

A imuno-histoquímica e imunofluorescência

A imuno-histoquímica foi realizada com o Vecta Elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) seguindo o protocolo do fabricante utilizando os reagentes. O anticorpo primário foi incubada durante a noite a 4 ° C e anticorpo secundário por 30 minutos a 37 ° C. Em seguida, o sinal foi desenvolvido usando o kit de substrato para a peroxidase DAB. Para a coloração de imunofluorescência, um anticorpo secundário biotinilado foi detectada utilizando Texas-Red-estreptavidina ou anticorpo secundário FITC-rótulo. secções coradas foram montadas com DAPI contendo meio de montagem.

zimografia in situ e zimografia

O meio condicionado de cultura organotípica cultivadas sob condições isentas de soro durante 48 horas, foram separados num gel de acrilamida a 10% contendo gelatina a 4 ° C. Os géis foram corados com azul de Coomassie R250, durante 2 horas e o excesso de coloração foi removido com tampão destain (ácido acético a 10% a 20% de metanol). As imagens foram tiradas utilizando Gel Doc ™ XR (Bio Rad, Hercules, CA).

Para A zimografia in situ, DQ-gelatina conjugada com fluoresceína (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA) foi ressuspenso em 1 ml de água desionizada a uma concentração de 1 mg /ml. 100 ug /ml de DQ-gelatina foi utilizada para sobrepor 5 micron de espessura de secções congeladas culturas organotípicas durante 18 horas a 37 ° C. O sinal de fluoresceína nos troços foi fotografada utilizando um microscópio de fluorescência (Zeiss, Thornwood, NY).

Western blotting

Western Blot foi realizada como descrito anteriormente [35]. As experiências foram repetidas pelo menos duas vezes.

Resultados

tumores de esôfago humanos preliminares mostram expressão inverso da E-caderina e CD44

Para determinar o papel do CD44 na invasão de células do esôfago e EMT, foi realizada a coloração imuno-histoquímica de e-caderina e CD44 em microarrays de tecido de 166 carcinoma de células escamosas (SCC) e 131 adenocarcinomas. Por dois pacientes SCC esôfago, amostras representando a progressão de normal a carcinoma

em

situ (CIS) e, posteriormente, ESCC (Fig. 1A a 1C), observou-se um aumento gradual da expressão de CD44. Em geral, a E-caderina foi largamente restrito a áreas com a expressão de CD44 de baixa ou ausente no epitélio normal (Fig. 1D, E) e 20 dos 166 tumores. Para SCC esofágico, observou-se a regulação positiva de CD44, na ausência de E-caderina em 54% dos tumores (90 de 166 tumores). Juntos, 110 de 166 (66%, p 0,02) de nossas amostras clínicas exibida esta relação inversa da E-caderina e CD44. amostras de adenocarcinoma de esôfago mostrou uma correlação inversa da E-caderina e expressão de CD44 em 63 de 131 amostras (48%), com 41 amostras com substancial E-caderina, mas nenhuma expressão de CD44. Vinte e duas amostras tinha um aumento da expressão de CD44 e são negativos para a E-caderina. Tomados em conjunto, que mostram uma estatística significativa (p 0,05) correlação inversa para a expressão de E-caderina e CD44. Imagens de colorações imunohistoquímicas representativas dos tecidos de tumor demonstraram associação de E-caderina e CD44 são mostrados na Fig. 1 F-I.

IHC com programas de anticorpos anti-CD44 aumentou a expressão de CD44 durante a progressão do normal (A) para o carcinoma

in situ,

CIS (B), e de tumor (C). O anticorpo contra a E-caderina e CD44 mostram a expressão de E-caderina (D) e na ausência de CD44 (E) no epitélio normal. Em tecidos de EAC com expressão de E-caderina retido (F, linha tracejada preta) o sinal de CD44 é baixo (L). (H) perda de E-caderina está associada com um sinal intenso para CD44 (I). barra de escala é de 50 micron.

linhas celulares de cancro esofágico-E-caderina negativo mostram aumento da expressão de CD44

Para investigar a correlação inversa da caderina-E com CD44 em linhas de células de câncer de esôfago , foram analisadas as linhas de esôfago carcinoma de células escamosas celulares, linhas celulares de cancro escamosas de cabeça e pescoço (-12 TE-1, -7, -8, -11 e) (JHU-012, JHU-013), bem como adenocarcinoma linhas celulares (FLO-1, OE33 e SK-GT-4) por Western Blot para e-caderina e a expressão de CD44, assim como TGFβRII e vimentina. Embora a forma padrão do CD44 (CD44s) é expresso em células mesenquimais, algumas formas variantes, CD44v, são expressos em células epiteliais [36]. Verificou-se que as células de retenção de expressão de E-caderina tinham níveis mais baixos de padrão (85 kDa, devido à falta do exão 6-15) e a forma variante (150 kDa) do CD44. A perda de E-caderina está correlacionada com a expressão aumentada de CD44s e um aumento na expressão da vimentina EMT marcador (Fig. 2A). Para determinar se a restauração da E-caderina pode afetar a expressão de CD44s e CD44v, nós transfectadas TE-8 e FLO-1 linhas celulares, ambos expressam baixos níveis de E-caderina, com full-length E-caderina. Após o restabelecimento da expressão de E-caderina, o nível global de expressão de CD44 foi reduzida, mas a forma variante (epitelial) (125 kDa) aumentado (Fig. 2B).

(A) análise de Western Blot de escamoso esofágico linhas de células de carcinoma (TE-1 -7, -8, -11 e -12), linhas celulares de adenocarcinoma esofágico (FLO-1, OE33, SK-GT-4) e linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço (JHU-012, JHU-013) mostram que a expressão de e-caderina e TGFβRII está associado com níveis baixos de CD44, enquanto que a perda de e-caderina e TGFβRII correlaciona-se com a regulação positiva de CD44 e a vimentina EMT marcador. (B) Restauração da E-caderina, Ecad, expressão por transfecção retroviral de TE-8 e FLO-1 células em comparação com o controle de vetores (neo) demonstra uma diminuição global na expressão de CD44, juntamente com um interruptor ao aumento CD44v sobre CD44s (CD44v: CD44variant, CD44s:. padrão CD44)

expressão de CD44 é regulada nas células epiteliais do esôfago submetidos a EMT

Nós previamente estabelecido um modelo para analisar os efeitos da perda de E-caderina nos queratinócitos esofágicas por expressão retroviral de e-caderina dominante negativo (CE) ou dominante negativo e-caderina em combinação com TGFβRII dominante negativo (ECdnT) [25]. Foram realizadas colorações imuno-histoquímica com anticorpos contra a E-caderina e CD44 e os marcadores de EMT para elucidar o papel do CD44 nas EMT esofágica e invasão celular. células CE e ECdnT ter regulado positivamente a expressão de CD44, CD44 e o sinal positivo se localiza em grande parte às zonas de invasão das células epiteliais para a matriz subjacente (Fig. 3). Ambas as células CE e ECdnT têm níveis aumentados de S100A4, vimentina e αSMA indicando que estas células estão a sofrer EMT em culturas organotípicas (Fig. 3D-F).

A imuno-histoquímica de secções de parafina com anticorpo anti-E-caderina ( a), anti-TGFβRII (B) e anti-CD44 (C) mostra células CD44-positivas e em células CE ECdnT invadindo a matriz de colagénio /Matrigel subjacente (setas) que são negativas para a e-caderina e TGFβRII. coloração imuno-histoquímica para os marcadores EMT S100A4 (D), vimentina (E) e αSMA (F) mostram um aumento de sinal positivo em células invasoras. barra de escala é de 50 micron.

CD44 co-localiza com MMP-9 na vanguarda de áreas invasivas e é regulada pela Activina A

Para analisar o mecanismo pelo que medeia CD44 invasão de células que incidiu sobre a activação das metaloproteinases da matriz, proteases proeminentes digestão da matriz extracelular. Para visualizar a atividade MMP em áreas de invasão que usamos em zimografia in situ. áreas fluoresceína positivo detectar a actividade de MMP foram restringidos ao bordo de ataque em células CE e ECdnT e invasão celular dentro da matriz subjacente (Fig. 4A). Os meios condicionados a partir de culturas organotípicas mostrou um aumento gradual da secreção de MMP-9 e MMP-2 e actividade de MMP-9 nas células invasoras (Fig. 4B). MMP-9 foi descrito como um parceiro de ligação de CD44 [37], [38]. Utilizando coloração de imunofluorescência dupla com anticorpos contra CD44 e MMP-9, que ilustram a sua co-localização na superfície da célula na extremidade principal de áreas invasivas (Fig. 4C). Para demonstrar um aumento do potencial invasivo em resposta a Activina A, um membro da família TGF-p, a secreção dos quais está aumentada nas culturas organotípicas invasivos (dados não mostrados), que estimulou células ECdnT e a linha celular de cancro esofágico TE-11 e mostram celular aumentada invasão

in vitro

(Fig. 4D).

(a) Para

in situ

zimografia, áreas de actividade MMP são destacadas por um sinal de fluoresceína positivo sobre cortes congelados de ECAD, CE e ECdnT culturas organotípicas. (B) zimografia utilizando meio condicionado de cultura organotípica recolhidos a partir de células Ecad, CE e ECdnT ilustra aumento da secreção de MMP-2 e MMP-9. (C) imunofluorescência dupla de Ecad, CE e ECdnT mostra MMP-9 (vermelho) co-localização com CD44 (verde) em células invasoras. barra de escala é de 50 micron. (D) A estimulação com Activina A induz a invasão de ECdnT e células TE-11 reforçada em ensaios de invasão. A comparação entre grupos foi realizada pelo teste paramétrico de Man e Whitney não, * p 0,05, ** p 0,001. (E) Western Blot de lisados ​​celulares de TE-11 transfectadas com AllStars células negativas não-silenciando siRNA (Ctrl) e TE-11 transfectadas com siRNA contra a E-caderina (SI1, SI2) demonstra regulação positiva de CD44 após estimulação com Activina A.

Activina a também tem sido descrito para regular stemness [17] e a hipótese de que CD44 como um marcador de células-tronco pode estar sob a regulação da Activina A. para identificar uma via de sinalização potencial responsável por a regulação positiva de CD44, analisamos a linha de células de câncer de esôfago, TE-11, depois de knockdown da caderina-E usando siRNA. Nós estimulado TE-11 transfectadas com siRNA contra células E-caderina com Activina A e analisou a expressão de CD44. Activina Um tratamento de aumento da expressão de CD44 variante em TE-11 na ausência de E-caderina (Fig. 4E).

Tomados em conjunto, estes dados demonstram a regulação da expressão de CD44 por E-caderina através de Activina A e fornecer prova funcional para um papel causal na indução da invasão celular.

Discussão

Nós mostramos a perda gradual de E-caderina está associada a um aumento progressivo da CD44

in vitro

e

in vivo

. Na ausência de E-caderina, Activina A pode induzir a expressão de CD44. Activina A foi demonstrado ser um regulador chave para stemness [17] e, como outros membros da superfamília TGF-p, também foi relatado de afectar o desenvolvimento e a tumorigénese [20], [22] – [24]. A sobre-expressão de Activina A foi descrito em carcinoma de células escamosas do esôfago e está associado com prognóstico pobre. Activina A promove a agressividade de células tumorais pelo aumento da expressão de MMP-7 e N-caderina [22] – [24]. Aqui, mostramos que a Activina A pode regular positivamente a CD44, que por sua vez ancora MMP-9 ao bordo de ataque e induz a invasão celular. A associação de E-caderina, CD44 e MMPs com EMT sugere um papel importante para a Activina A em EMT.

Nós descobrimos que a perda de E-caderina é acompanhada por uma mudança de expressão isoforma CD44. Embora os estudos anteriores demonstraram que a splicing alternativo do CD44 pode ser controlada por meio de sinalização de Ras para promover a expressão de formas variantes [39], Warzecha et ai. fatores foram recentemente identificados epiteliais splicing (ESRP1 e ESRP2) que promovem a expressão de CD44v para manter o fenótipo epitelial [40]. Esses fatores são perdidas durante a EMT [41] – [43]. Concebivelmente, a expressão do CD44 padrão é dependente de perda de ESRP1 e 2 no carcinoma do esófago. ESRP1 2 e expressão foi ainda reconhecido a ser implicado em programas de splicing EMT-associados no cancro da mama [44]. Curiosamente, o silenciamento de ESPR1 /2 em células epiteliais induzidos expressão da caderina mesenquimal, N-caderina, sem alterações na expressão de E-caderina. Por outro lado, a expressão de ESPR1 pode inverter EMT induzida por torção em células epiteliais mamarias. Além disso, o factor de transcrição Twist2 contribui para a expansão das populações de células estaminais através da regulação negativa do tipo de E-caderina e aumento da expressão de marcadores de células estaminais tal como CD44 [45].

Tomados em conjunto, existem vários mecanismos pelo que isoformas de CD44, todos partilham o mesmo domínio citoplasmático, pode induzir EMT, muitos dos quais envolvem a interacção do domínio extracelular com o microambiente. CD44 pode actuar como um co-receptor de c-Met e o receptor é fidedigno para o ácido hialurónico, o que pode promover EMT [9]. E-caderina regula negativamente a interacção de CD44 com ácido hialurónico resultando numa supressão de invasão de tumores e células de ramificação morfogénese [46]. Mostramos aqui que a perda de expressão de E-caderina está correlacionada com a forma e CD44s indução de um fenótipo invasivo.

Demonstrámos anteriormente que a invasão de queratinócitos esofágicas falta funcional E-caderina e TGFβRII foi mediada pela catepsina B [35]. Catepsina B pode ser activada num ambiente ácido iniciada pela interacção de CD44 com um Na + -H + permutador [37]. Embora o aumento da actividade da catepsina B resulta em activação TGF [35], a MMP-9 pode também activar TGF-p [47] que liga os dados aqui apresentados com nosso estudo anterior. sinalização parácrina TGFp activa fibroblastos, e também induz formação capilar [48]. Estas observações destacam a importância do crosstalk epitelial-mesenquimal na tumorigênese.

Em conclusão, mostramos que CD44 regulação positiva está associada com a perda de E-caderina no carcinoma de esôfago e que CD44 promove a MMP-9 invasão tumoral mediada .

Reconhecimentos

também gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório de Beauchamp, Drs. Deane e Beauchamp, e Dr. Anil K. Rustgi e do Departamento de Bioestatística Vanderbilt para discussões úteis.