Abstract
Fundo
Os microRNAs (miRNAs) surgiram como reguladores de genes importantes e são reconhecidos como jogadores-chave na tumorigênese. miR-145 é relatado para ser regulada em vários tipos de câncer, mas o conhecimento de suas metas no cancro do cólon permanece limitada.
Metodologia /Principais Achados
Para investigar o papel do miR-145 em cancro do cólon, nós empregamos uma abordagem baseada microarray para identificar miR-145 alvos. Com base no enriquecimento local de análise de sementes e analisa palavra imparcial, encontramos um enriquecimento significativo de sítios de ligação de miRNA nas regiões 3 ‘não traduzidas (UTRs) de transcrições regulada para baixo em cima miRNA superexpressão. Gene ontologia análise revelou uma sobre-representação de genes envolvidos na morte celular, crescimento e proliferação celular, do ciclo celular, e a expressão do gene do cancro. Um certo número de alvos de miRNA identificados tenham sido previamente implicado no cancro, incluindo
SIM
,
FSCN1
,
ADAM17
,
BIRC2
,
VANGL1
, bem como o fator de transcrição
STAT1
. Ambos
SIM
e
STAT1
foram verificados como alvos diretos miR-145.
Conclusões /Significado
Os identifica estudo e valida novo câncer relevantes direta alvos de miR-145 em células cancerígenas do cólon e declara acrescenta importante entendimento mecanicista das funções de tumor-supressora de miR-145
Citation:. Gregersen LH, Jacobsen AB, Frankel LB, Wen J, Krogh a, Lund AH (2010) microRNA-145 Metas
SIM e
STAT1
em células de cancro do cólon. PLoS ONE 5 (1): e8836. doi: 10.1371 /journal.pone.0008836
editor: Grzegorz Kudla, University of Edinburgh, Reino Unido
Recebido: 28 de outubro de 2009; Aceite: 31 de dezembro de 2009; Publicação: 21 de janeiro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Gregersen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Trabalho em dos autores laboratório é apoiado pela Comissão Europeia (CE) financiamento FP7 (ONCOMIRS, convenção de subvenção número 201102. Esta publicação reflecte apenas dos autores vistas. a comissão não é responsável por qualquer uso que possa ser feito das informações aqui), o Novo Nordisk Foundation, a Fundação Lundbeck, a Fundação Nacional de Pesquisa Dinamarquês, o Conselho de Investigação médica da Dinamarca, o dinamarquês Cancer Society e da Fundação Nacional Dinamarquês de Tecnologia avançada. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Nos últimos anos pequenos RNAs não-codificantes foram reconhecidos como reguladores de genes importantes [1] – [4]. miARNs são um grupo abundante de pequenos RNAs não-codificantes endógenos que funcionam como reguladores de genes que codificam proteínas através da repressão de translação e /ou degradação dos seus mRNAs alvo [1]. miARN pesquisa extensiva revelou que miARNs estão envolvidos na regulação de numerosas funções celulares essenciais, tais como o metabolismo, proliferação celular, a tumorigénese, a apoptose, o desenvolvimento e diferenciação [1], [3], [4]. Para regular mRNAs alvo miRNAs maduros estão ligados a proteínas atrás e orientar o RNA AGO-associado induzida silenciamento complexos (RISC) a alvos de mRNA através de emparelhamento de base imperfeita entre o miRNA e o alvo. Isto muitas vezes envolve emparelhamento base perfeita entre a extremidade 5 ‘da cadeia de miARN e o seu alvo, também denominado o local de sementes. Bioinformatics análises sugerem que cada um miARN pode controlar centenas de genes alvo em seres humanos e foi recentemente relatado que mais de 60% dos genes que codificam proteínas estão sob pressão selectiva para manter o emparelhamento com miARNs, indicando que miARNs têm o potencial para regular a maioria das proteínas genes que codificam [5].
expressão inadequada dos miRNAs, que regulam genes que funcionam como qualquer tumor-supressores ou oncogenes pode levar à aquisição das marcas do câncer, especificando assim miRNAs como ambos tumor-supressores e oncogenes [ ,,,0],3], [6], [7]. As alterações específicas nos níveis de expressão de miARN têm sido associadas com vários tipos de cancro [8] e um grande número de miARNs estão localizados em regiões genómicas associadas a cancro, assim chamados, que são frequentemente expostos a alterações nas células cancerosas [9]. No entanto, em contraste com o grande número de miARNs que foi identificado nos últimos anos, só relativamente poucos têm sido alvos de miARN validada experimentalmente. Dada a evidência de que miRNAs são importantes reguladores da tumorigênese [3], [6], identificação de alvos de miRNA é necessário para compreender o mecanismo de base para o envolvimento de miRNAs em câncer.
miR-145 tem frequentemente foi classificado como sub-regulada em cancros, incluindo o cancro da próstata [10], [11], o cancro da bexiga [12], o cancro do cólon [13] – [18], câncer de ovário [19], [20], bem como B malignidades -cell [21], [22], e foi relatado que a região genómica que codifica o miR-145 está localizado num sítio frágil frequentemente suprimida em cancro [23]. Por conseguinte, o miR-145 sobre-expressão foi demonstrada para ter um efeito inibidor do crescimento [16], [17], [24], [25] e para suprimir o crescimento independente de ancoragem [16]. Verificou-se, além disso, demonstraram que a expressão de miR-145 é induzida por p53 [16]. Aqui, foi relatado que o miR-145 alvos de c-myc através de emparelhamento imperfeito base de sementes [16] e foi sugerido que a regulação negativa mediada por p53 de c-Myc é, pelo menos parcialmente, devido a sobre-regulação mediada por p53 de miR-145 . Um outro estudo revelou também um aumento do nível de miR-145 induzida por doxorrubicina [26]. No entanto, em vez de uma activação da transcrição de miR-145, verificou-se que a p53 activa o processamento de primários de miR-145 em transcritos de miR-145 precursores [26]. Este fenómeno não se restringe apenas a miR-145, mas também aplicado a vários outros miARNs com funções supressoras crescimento conhecidos, indicando regulação mediada por p53 de processamento de miARN como uma forma de exercer a sua função supressora de tumores [26]. Além de c-Myc, o miR-145, também tem sido sugerida para alvejar o receptor da insulina humana substrato-1 (IRS-1) e receptor de tipo I do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF-IR) em cancro do cólon [25], [ ,,,0],27]. No entanto, a especificidade da interacção alvo não foi confirmada por análise mutacional dos locais de semente em qualquer destes casos.
O nível de miR-145 expressão é induzida durante a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas e miR-145 superexpressão foi demonstrado de prejudicar a pluripotência em células-tronco embrionárias humanas, visando de
OCT4
,
SOX2
e
KLF4
que estão envolvidos na manutenção da capacidade de auto-renovação da células estaminais embrionárias humanas [28]. Este papel de miR-145 como um indutor de diferenciação de células estaminais embrionárias está de acordo com o papel de miR-145 como um repressor de crescimento em células de cancro. Um modelo de rato desenhado para investigar o padrão de expressão de miR-145 revelou expressão de miR-145 em progenitores multipotentes cardíacas e de células musculares lisas [29] e sugeriu que o miR-145 promove a diferenciação em células do músculo liso [29]. No entanto, outro estudo mostrou que os ratos que faltam miR-145 eram viáveis sem anormalidades evidentes na diferenciação de células do músculo liso [30], o que demonstra a existência de promotores adicionais de diferenciação.
Tomados em conjunto, o miR-145 parece ter funções supressoras de tumor, quando sobre-expresso em células cancerosas e podem normalmente desempenham um papel nos processos de diferenciação. Aqui, temos focado na identificação de alvos de miR-145 em câncer de cólon, com base em perfis de células que superexpressam miR-145 expressão microarray. Gene ontologia análises de genes responsivos miR-145 confirmar a regulação de genes envolvidos na morte da célula, regulação do ciclo celular e cancro. Nós identificamos uma série de miR-145 alvos que poderia ser interessante no contexto do câncer e verificou que os objectivos miR-145 YES e STAT1 em células cancerígenas do cólon.
Resultados
Alertado pelas numerosas relatos de miR-145 regulação baixa de câncer buscou-se identificar miR-145 alvos que poderiam explicar o papel de miR-145 em câncer. Para obter conhecimento sobre os níveis de expressão de miR-145 em linhas celulares estabelecidas, que o perfil dos níveis de expressão de um número de linhas de células de cancro, bem como em linhas de células não tumorigénicas (Figura S1). Os perfis de miR-145 de expressão mostraram que, excepto para MCF10A todas testadas linhas de células não tumorigénicas expressa miR-145, ao passo que os níveis de miR-145 de expressão foi muito baixa em todas as linhas celulares tumorais testadas, suportando as conclusões anteriores, em que o miR-145 é regulada para baixo ou perdido no câncer. Devido às suas implicações em cancro do cólon [13] – [18], decidimos investigar o papel de miR-145 na linha celular de cancro do cólon DLD-1. A co-transfecção de miR-145 duplex com um repórter de luciferase contendo um local complementar perfeita para os miARNs maduros resultou numa regulação negativa acentuada da actividade da luciferase, o que demonstra uma sobre-expressão (FIGURA S2A) altamente eficaz. Como demonstrado por ambos os ensaios de crescimento de cristal violeta e MTT, a sobre-expressão de miR-145 resultou numa diminuição da proliferação das células (Figura 1 e Figura S3).
células transfectadas com 50 nM de miR-145 exibem um dúplex DLD-1 proliferação celular reduzida como medido pelo ensaio de crescimento de cristal de violeta. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de quatro repetições.
Identificação de miR-145 Metas
Tendo em conta as indicações de que o miR-145 desempenha um papel no câncer, juntamente com o conhecimento limitado dos seus alvos no cancro do cólon, o objetivo era identificar alvos funcionalmente relevantes que podem ajudar a explicar o papel do miR-145 em câncer. Para alcançar este objectivo, utilizou-se uma estratégia baseada microarray semelhante ao anteriormente utilizado para identificar alvos de miR-21 [31]. células DLD-1 foram transfectadas com 50 nM miR-145 duplex ou falsamente transfectadas. O ARN total foi colhido 24 horas após a transfecção e analisadas em 2,0 matrizes humanos Affymetrix HG-U133 Plus. Analisou-se um total de oito arranjos. Para filtração, os genes não informativos com o mesmo nível de expressão em todas as matrizes (incluindo genes que não são expressos) foram removidos e os genes diferencialmente expressos, os seus valores de p e taxas de detecção falsos correspondentes foram calculados tal como descrito na secção Materiais e Métodos.
para determinar se os genes regulados mediante o miR-145 sobre-expressão estavam relacionados com as funções celulares específicas, uma pesquisa dentro as anotações funcionais na base de dados Engenho (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) foi realizada para todos miR-145 genes responsivos. Os cinco principais categorias funcionais enriquecidos da análise Gene Ontology estão listadas na Tabela 1. Dentre estas categorias são a morte celular, crescimento e proliferação celular, regulação do ciclo celular e câncer. Correspondente análises usando conjuntos de genes aleatórios gerados a partir Affymetrix HG-U133 mais 2,0 anotações, em alguns casos resultaram em enriquecimento das mesmas categorias que encontramos enriquecido no conjunto de dados miR-145, mas com valores de p 10 ordens de magnitude maior do que no miR-145 do conjunto de dados (dados não mostrados).
análise do local da semente enriquecimento das ocorrências de miR-145 sítios de semente nas 3’UTRs demonstrado um enriquecimento altamente significativa entre os transcritos regulada para baixo (FIGURA 2A). Os valores p para o enriquecimento de miR-145 locais de sementes (incluindo 7mer, 7mer-1A e locais 8MER) foram de 1,4 · 10
-21 e 7,6 · 10
-8 quando se considera as transcrições regulada para baixo vs . transcrições-regulada e transcrições vs. há transcrições de mudança regulada para baixo, respectivamente. Dois métodos alternativos de cálculo do enriquecimento local de sementes, quer como ocorrências do site descendência depois de corrigir a cima, para baixo e nenhuma alteração define para o mesmo tamanho ou como ocorrências do site de semente por kb, mostrou um enriquecimento semelhante nos 3’UTRs regulada para baixo ( FIGURA S4). Tomados em conjunto, este verifica se a abordagem baseada microarray pode ser utilizado para identificar alvos de miARN. Quando a sequência de ADNc inteira dos transcritos foi utilizado para a análise do local de sementes de enriquecimento (referida como a percentagem dos transcritos com os locais de sementes), encontramos ainda um enriquecimento significativo de sítios de sementes, mesmo que o enriquecimento é menos pronunciado em comparação com apenas considerando a três ‘sequências UTR (S5A figura). Uma análise similar das sequências de codificação e sequências 5’UTR não revelaram qualquer enriquecimento local significativo de sementes (S5B figura e S5C).
A, As porcentagens de genes em cima, para baixo (DN) e ausência de mudanças (nc ) define com sites de sementes em suas 3’UTRs. Apenas aqueles 6mers que não fazem parte de um ou 7mer 8MER são relatados como 6mers e apenas os 7mers que não estão contidos dentro de um 8MER são contadas como 7mers. A média de log dobra-as variações foram de 0,36, 0,02 e -0,40 para o para cima, para baixo e ausência de mudanças conjuntos, respectivamente. Os valores de p são calculados testar a hipótese nula de que a proporção de genes com os locais de sementes são as mesmas para o regulado por baixo e os genes regulados positivamente (DN vs. up) ou os genes regulados por baixo em comparação com a ausência de mudanças genes (DN vs. nc). Os valores P para instalação de enriquecimento de sementes 7mer foram de 1,7 · 10
-33 (dn vs. up) e 2,9 · 10
-11 (dn vs. nc). Os valores P para 7mer-1A site de semente de enriquecimento foram de 3,7 · 10
-18 (dn vs. up) e 7,8 · 10
-7 (dn vs. nc). B, análise de palavras imparcial mostrando a soma parcial da pontuação sobre-representação para o 7mer site de semente de miR-145 na lista ordenada de sequências 3’UTR (linha preta) em comparação com permutações de uma lista gene classificado (linhas vermelhas). Jusante e os genes regulados positivamente (definidos como genes com FC -1,1 ou FC 1,1) na lista de genes classificados são indicados no gráfico. C, validação de RT-PCR quantitativa dos dados de microarray. As células foram transfectadas com 50 nM de miR-145 duplex ou falsamente transfectadas e o ARN total colhido 24 horas após a transfecção. Os 3’UTRs de
IQGAP1
e
STAT1
não contêm quaisquer partidas de sementes miR-145, mas ambos os genes contêm uma partida de sementes 7mer na sua região de codificação. Todos os outros miR-145 genes responsivos a conter pelo menos um local de semente 7mer na sua 3’UTR. O nível de expressão de cada transcrito é mostrado em relação ao nível em células transfectadas em falso. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de três réplicas.
palavra imparcial análises das sequências 3’UTR identificou o local de sementes 7mer de miR-145 como a palavra 7mer mais significativamente enriquecido nos 3’UTRs de transcrições regulada para baixo (TABELA 2). Várias das outras palavras altamente enriquecido foram variações de site de semente do miR-145 e a quarta palavra mais enriquecida foi o jogo semente 7mer-1A (Tabela 2). Uma análise palavra 6mer correspondente também identificou miR-145 partidas descendência como as palavras mais significativamente enriquecida (FDR 0,005) (Figura S6). Conspirando a soma parcial das pontuações sobre-representação do local de sementes 7mer em transcrições classificados de acordo com sua logFC mostrou claramente que os 3’UTRs de transcrições regulada para baixo teve uma alta de enriquecimento de miR-145 sementes 7mer (linha preta) que não foi observado para permutações de uma lista gene classificado (linhas vermelhas) (Figura 2B).
potenciais miR-145 Metas
Uma vez que miR-145 é regulada para baixo ou perdido no câncer, re -introdução de miR-145 que seria esperado para causar uma regulação negativa directa de alvos de oncogenes. Com efeito, um certo número de genes com função oncogénica foram sub-regulada sobre a superexpressão de miR-145, incluindo o membro da família Src
proteína de reticulação
SIM e a actina
FSCN1
, que é encontrado em células projecções de superfície implicadas na motilidade celular [32]. A metaloproteinase
ADAM17
e membro do inibidor de apoptose (IAP) família
BIRC2
(também conhecido como
cIAP1
), que ambos contêm 8MER miR-145 locais de sementes em suas 3’UTRs, também foram observados como regulada para baixo em cima de miR-145 superexpressão. Além disso,
VANGL1
que está envolvida na resposta da ferida de linhas celulares epiteliais intestinais, através da promoção da migração das células de cicatrização foi também identificado como um alvo de miR-145 putativa [33].
Alguns dos genes regulados negativamente não têm um local de semente de miR-145 em sua 3’UTR, mas em vez teve um ou mais locais de uma semente na região codificadora. STAT1, um factor conhecido transcrição [34], [35] e IQGAP1 um regulador negativo de adesões célula-célula e estimulador de motilidade celular e invasão [36], ambos tinham miR-145 sítios de sementes nas regiões codificantes dos seus transcritos. No caso de
STAT1
, o local de semente de miR-145 está localizado no segundo exão do último transcrição. Desde
STAT1
estava entre as mais transcritos regulados negativamente na análise microarray, foi também considerado como um alvo potencial e incluídos nas investigações subsequentes. As previamente identificados miR-145 alvos
OCT4
,
SOX2
e
KLF4
em células estaminais embrionárias humanas não foram expressos em células DLD-1 (dados não mostrados).
MYC
,
ISR-1 | e
IGF-1R
, sugerido por outros como miR-145 alvos [16], [25], [27], não mostrou alteração no nível de expressão após a sobre-expressão de miR-145 no nosso conjunto de dados (dados não mostrados). A lista completa de potenciais alvos de miR-145 identificados contendo locais de lançamento no seu 3’UTR é apresentado na Tabela S1.
Alvo Validação
A seguir, confirmou os dados de microarranjos por RT-PCR quantitativo para sete transcritos seleccionados que foram encontrados sub-regulada na análise de microarray (Figura 2C). Notavelmente,
STAT1
e
SIM
, que tem miR-145 locais de sementes na região codificadora e 3’UTR, respectivamente, mostraram uma clara diminuição da regulação no nível transcrição mediante miR-145 superexpressão. Para determinar se miR-145 regula diretamente
SIM e
STAT1
, construções repórter luciferase foram clonados. O emparelhamento de bases entre os locais de sementes de miRNA e os potenciais alvos de mRNA estão representados na figura 3A. Em ambos os casos, a sobre-expressão de miR-145 resultou numa diminuição da actividade de luciferase, indicando que a miARN pode ligar tanto o
SIM
3’UTR e o
ADNc
STAT1 e directamente mediar a repressão (FIGURA 3B ). Este não foi o caso com as construções repórter em que os locais de sementes tenham sido mutados (Figura 3B). Para confirmar ainda mais a miARN mediada por sub-regulação de STAT1 e SIM no nível da proteína, análises de Western blot foram realizadas em ambas as células DLD-1 e células cancerígenas do cólon HCT116. A eficiência superexpressão de miR-145 em HCT116 medido por construções repórter luciferase foi semelhante à observada em células DLD-1 (Figura S2B). Uma diminuição acentuada do nível de proteína SIM mediada por miR-145 foi observado 48 horas após a transfecção em ambas as células DLD-1 e HCT-116 (Figura 3C). Uma regulação negativa mais subtil, mas ainda clara de STAT1 mediada por miR-145 foi também observado (Figura 3D). Notavelmente, o grau de repressão STAT1 variou entre as células DLD-1 e HCT-116, com a repressão forte de STAT1 observada em células DLD-1.
A, Alinhamento de sequências de região semente do miR-145 e alvos de ARNm. As coordenadas de posição são indicados para as isoformas de transcritos listados abaixo.
Sim1
3’UTR: ENSG00000176105: ENST0000035983
STAT1
cDNA: ENSG00000115415: ENST00000361099. B, o ensaio de luciferase Firefly com pGL3 + construções segurando um fragmento 3 ‘UTR de
SIM
ou um fragmento de cDNA do
STAT1
, a jusante do gene da luciferase de vaga-lume. As células foram co-transfectadas com os repórteres de luciferase de pirilampo, juntamente com um
Renilla
plasmídeo de controlo da transfecção de luciferase por si só ou com 50 nM de miR-145 duplex e 50 nM AllStar dúplex como um controlo negativo. Em vetores PGL3 + mut dois pares de bases de local de sementes do miR-145 foram mutado. A luminescência foi medida 24 horas pós-transfecção e a razão entre o pirilampo para o
Renilla
actividade é mostrado em relação à transfecção sem ARN duplex e o vector vazio. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de quatro repetições. *, P 0,05 usando um teste t de duas caudas, ***, P 0,01 usando um teste t de duas caudas. C e D, a análise de transferência de Western de células DLD-1 e HCT-116 transfectadas com o miR-145 duplexes ou células falsamente transfectadas riscados para SIM (C) e STAT1 (D). Vinculina ou tubulina foram utilizados como controlos de carga. As bandas foram quantificadas em relação aos controlos de carga apropriados utilizando o software TotalLab e são apresentadas em relação ao nível da proteína em células transfectadas em falso. Os dados mostrados são representativos de duas experiências.
Efeitos secundária devido à STAT1 desregulamentação
STAT1 é um fator de transcrição bem caracterizado melhor reconhecido como um activador da transcrição, mas exemplos de regulação transcricional negativo também têm sido descritos [34]. O motivo de ligação de STAT1 como definido pela base de dados Jaspar NÚCLEO [37] é mostrado na FIGURA S7A. Para determinar se o miR-145 downregulation mediada de STAT1 também causou uma alteração do nível de expressão de genes alvo STAT1 na análise de microarray, uma busca de sítios nos promotores de ligação STAT1 a, sobre-regulada e transcritos sem regulada para baixo alteração no nível de expressão foi conduzida. Fora de todos os fatores de transcrição núcleo Jaspar, STAT1 foi o sítio de ligação mais significativamente enriquecida tanto quando o (valor-p = 4,18 · 10
-4) regulada para baixo e os genes regulados positivamente (p = 1,34 · 10
-4) foram comparados com os genes sem nenhuma alteração na expressão (Tabela 3). Este não era o caso de uma matriz de ligação STAT1 permutada ao comparar genes para os genes regulados positivamente com nenhuma mudança no nível de expressão (FIGURA S7B). No entanto, quando se analisam os genes regulados por baixo em comparação com genes de ausência de mudanças, também houve um ligeiro enriquecimento de STAT1 permutada sítios de ligação, indicando que alguns dos efeitos observados podem ser não-específica (FIGURA S7C).
Discussão
miRNAs estão surgindo genes reguladores como importantes e pesquisa intensiva das suas funções e metas têm revelado um papel de miRNAs em várias funções celulares essenciais. Mesmo que a nossa compreensão dos papéis funcionais de miRNAs em cancros é cada vez maior, o conhecimento sobre miR-145 e os seus objectivos em câncer de cólon ainda é praticamente inexistente. Nós, portanto, centrou-se na identificação de alvos de miR-145 em células de câncer de cólon. Apoiando descobertas anteriores de que o miR-145 é regulada para baixo em tumores [10] – [13], [15], [16], [18] – [21], [38] – [42], um perfil de miR- 145 a expressão em linhas celulares estabelecidas, demonstraram que os níveis de expressão de miR-145 foram drasticamente reduzidos em linhas de células de cancro em relação a linhas de células não tumorigénicas. De acordo com relatórios que mostram um efeito inibidor do crescimento de miR-145 [16], [17], [41], observa-se também uma redução do crescimento de DLD-1 células sobre transiente transfecção de miR-145, o que implica que o miR-145 possui uma função de supressor de tumor
in vitro
.
Aqui, usamos microarray profiling sobre miR-145 superexpressão como um método de identificação de alvos potenciais. perfis de expressão de Microarray combinados com análise do local de sementes de enriquecimento é uma abordagem bem estabelecida utilizada para identificar alvos potenciais de miARN [31], [43], [44]. Tem a vantagem sobre a previsão alvo estritamente computacional que não se baseia apenas na presença de um sítio de sementes e características da sequência do alvo potencial, mas leva em conta o facto de o alvo é expressa na linha celular considerada e se o alvo é regulada sobre o nível de transcrição. Uma vez que esta abordagem é exclusivamente com base nas alterações observadas no nível de transcrição, os alvos regulados exclusivamente pela repressão translacional não será identificado.
Análise de Sementes instalação de enriquecimento e análise palavra imparcial mostrou um enriquecimento clara de miR-145 locais de sementes na 3’UTRs de transcrições regulada para baixo, confirmando a nossa abordagem para identificar miR-145 alvos. Nós não observamos qualquer enriquecimento de miR-145 locais de sementes na região codificadora dos transcritos regulados para baixo. No entanto, uma vez que alguns dos genes contendo locais de semente dentro da região de codificação anteriormente tinha sido implicado no cancro, especulamos que estes candidatos alvo pode também desempenhar um papel funcional jusante de miR-145. A análise imparcial palavra, utilizado aqui para avaliar o enriquecimento de palavras em 3’UTRs de acordo com a logFC da transcrição sobre o miR-145 sobre-expressão, apresenta um método extremamente útil para a visualização dos efeitos da sobre-expressão de miARN sem fazer qualquer pressuposto prejudicados em relação de corte valores. A forma da curva de soma parcial mostra um pico agudo dos miR-145 7mer locais de semente para a maioria dos genes regulada para baixo, sugerindo que transcrito alvo a infra-regulação, em grande parte é devido aos efeitos diretos de miR-145 alvos. A análise palavra imparcial confirmou relatos anteriores que mostram que um A na posição 1 do site da semente é benéfico independentemente do seu potencial de pares de bases com o miRNA [2], [45].
Muitos dos alvos identificados aqui ter sido previamente implicado no cancro. As categorias funcionais enriquecidos de todos os alvos sensíveis miRNA apoiado ainda mais a implicação do miR-145 no cancro e implicam que os efeitos directos de miR-145, bem como efeitos secundários podem explicar o papel do miR-145 em câncer. Um certo número de genes com função oncogénica, muitos dos quais também têm sido associadas com o cancro do cólon, foram identificados como potenciais alvos de miR-145 com base na análise de microarray. Estes incluem
ADAM17
,
BIRC2
e
VANGL1
. ADAM17 tem sido relatada sobre-regulada em carcinomas do cólon e tem sido demonstrado para promover a libertação de receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) os ligandos da membrana celular, activando assim o EGFR [46]. BIRC2 tem sido demonstrado ser essencial para manter a sobrevivência de células endoteliais e a integridade vascular no peixe-zebra, activando a formação do complexo receptor de TNF I, assim como promover a degradação de IkB, em que NF-kB é libertado e transloca-se para o núcleo onde ativa genes pró-sobrevivência nas células endoteliais [47]. A fracção de membrana celular associada de VANGL1 aumenta com a diferenciação e foi demonstrado para co-localizar com E-caderina nas células de cólon humano [33]. Além disso, demonstrou-se que a sobre-expressão de
VANGL1
estimulada fecho da ferida de linhas celulares epiteliais intestinais, ao passo que ARNsi dirigido contra Vangl1 inibiu a resposta migratória [33]. Relatado anteriormente miR-145 alvos, incluindo
OCT4
,
SOX2
e
KLF4
envolvidos na promoção da proliferação de células estaminais não foram expressos em células DLD-1, o que implica que o efeito inibidor do crescimento de miR-145 sobre-expressão em células DLD-1 não é devida à baixa regulação destes genes. Outro regulador chave da proliferação celular,
MYC
, relatado previamente como um alvo miR-145 não mostrou nenhuma mudança no nível de expressão em cima miR-145 superexpressão em nosso meio.
Validação experimental de
SIM
e
STAT1
como miR-145 alvos demonstrou um marcado para baixo-regulado em mRNA e nível de proteína, comprovando o efeito biológico de miR-145 sobre os alvos endógenos. A infra-regulação em ensaios /cDNA luciferase 3’UTR confirma ainda mais que este é o resultado de interações diretas, uma vez que mutações dos locais de semente de miR-145 abolir esta infra-regulação. A razão dos diferentes efeitos de miR-145 em diferentes ensaios é provavelmente devido a uma falta de comparabilidade directa entre estes ensaios. Esta diferença também pode ser devido a outros factores de ligação envolvidos na regulação da transcrição endógena, uma vez que estes locais de ligação não estão presentes nos fragmentos 3’UTR ou de ADNc utilizadas nas construções repórter luciferase clonados.
Um número de estudos têm relacionado o aumento da expressão de SIM em câncer com o aumento da motilidade celular e invasão tumoral [48], [49]. SIM é parte da família Scr-quinase [50] e a sua actividade de tirosina-quinase tem sido mostrado para ser elevada em adenomas do cólon em comparação com a sua actividade na mucosa normal adjacente [51]. Além disso SIM actividade foi encontrada uma correlação com o risco de cancro prevista com base no tamanho, histologia, e o grau de displasia [51]. Tomados em conjunto, os presentes dados sugerem que a supra-regulação de SIM é importante para o crescimento e transformação das células intestinais.
proteínas STAT funcionar a jusante de JAK e MAPK, que induzem a dimerização de proteínas STAT, permitindo, assim, a translocação de STAT proteínas para o núcleo [34], [35]. STAT1 é mais conhecida pelo seu papel pro-apoptótico em resposta a interferões, mas também STAT1 foi reportado ter um papel pro-sobrevivência em alguns tipos de cancro [35]. Foi observada uma regulação negativa da
STAT1
no nível de transcrição e nível de proteína em cima de miR-145 superexpressão. Além disso, mostramos que a regulação negativa de STAT1 traduz-se um efeito sobre o nível de expressão alvos potenciais STAT1. Este é o caso para os genes, tanto positiva como negativamente regulados por STAT1, mas o efeito é o maior em genes regulados negativamente pela STAT1. Embora STAT1 foi relatado tanto como um activador de transcrição e do repressor, o principal mecanismo de regulação da transcrição de STAT1 é a activação dos seus genes-alvo [34]. Nossos resultados sugerem que a repressão da transcrição é mais difundida do que reconhecido previamente. Para resumir, fator de transcrição análises dos promotores de genes desregulados fornece um meio para caracterizar efeitos secundários como anteriormente publicados para o miR-34a [52]. O enriquecimento identificados sítios de ligação de STAT1 em promotores de genes regulados demonstra que os efeitos secundários de miARN superexpressão são pronunciadas já 24 horas após a transfecção. Por isso, é importante considerar os efeitos secundários ao analisar conjuntos de dados superexpressão de miRNA.
Em conclusão, utilizando uma abordagem baseada microarray nós identificamos alvos adicionais para o associado ao câncer miRNA miR-145 em células cancerígenas do cólon. Os alvos miRNA identificados neste estudo pode servir para esclarecer o papel do miR-145 em cancros do cólon, bem como outros tipos de câncer.
Materiais e Métodos
Cell Cultures
As células DLD-1 foram cultivadas em DMEM GlutaMAX ™ -I meio de glucose elevada (31966, Gibco Invitrogen) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS, CH30160.03, Hyclone), 50 U /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina (P /S, Gibco Invitrogen 15140) e incubadas em 5% de CO
2 mais de 20% de oxigénio. As células HCT116 foram cultivadas em meio de McCoy 5A L-glutamina (22330, Gibco Invitrogen) suplementado com 10% (v /v) de FBS e P /S. A sobre-expressão de miR-145 foi obtida por transfecção com um duplex de miR-145 que imita o miR-145 maduro (PM11480; Ambion). Transfecção com
Caenorhabditis elegans
lin-4 duplex (PM10768, Ambion) ou AllStar siRNA controle negativo (1.027.281, Qiagen) foi utilizado como controle. Todas as transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 ™ Transfection Reagent (11668-019, Invitrogen) de acordo com o protocolo dos fabricantes.