Abstract

O mieloma múltiplo (MM) é uma doença clonal de células plasmáticas que permanece incurável apesar do advento de diversas novas terapias. Neste estudo, destinada a delimitar o impacto de veneno de cobra extraído de

Walterinnesia aegyptia

(WEV) sozinho ou em combinação com nanopartículas de sílica (WEV + NP) em culas do MM primários isolados de doentes diagnosticados com MM bem de em duas linhas celulares de MM, U266 e RPMI 8226. a IC

50 valores de WEV e WEV + NP que diminuiu significativamente a viabilidade celular MM sem afectar a viabilidade das células mononucleares periféricas normais (PBMC) foram determinados como sendo 25 ng /ml ml e 10 ng /, respectivamente. Embora ambos WEV (25 ng /ml) e WEV + NP (10 ng /ml) reduziu a expressão de superfície CD54, sem afectar a expressão de CXCR4 (receptor de CXCL12) em culas do MM, reduziram significativamente a capacidade de CXC ligando de quimiocina 12 (CXCL12 ) para induzir o rearranjo do citoesqueleto de actina e a subsequente redução da quimiotaxia. Tem sido demonstrado que a ligação de CXCL12 ao seu receptor CXCR4 activa múltiplas vias de transdução de sinal intracelulares que regulam a quimiotaxia de células MM, adesão e proliferação. Descobrimos que WEV e WEV + NP diminuiu claramente o CXCL12 activação /mediada por CXCR4 de AKT, ERK, NFkB e Rho-A por meio de análise western blot; revogada a proliferação mediada por CXCL12 de culas de MM com o ensaio CFSE; e induziu apoptose em células milímetros, conforme determinado por coloração dupla PI /anexina V seguido por análise de citometria de fluxo. Controlo da expressão de CCL-células B /linfoma 2 (BCL-2) membros da família e o seu papel na indução de apoptose após tratamento com WEV ou WEV + NP revelaram que a combinação de WEV com NP robustamente diminuiu a expressão dos efectores anti-apoptóticos Bcl-2, Bcl

XL e Mcl-1; Por outro lado um aumento da expressão dos efectores pró-apoptóticos Bak, Bax e Bim; e alterou o potencial de membrana mitocondrial nas culas do MM. Tomados em conjunto, os nossos dados revelam os efeitos biológicos da WEV e WEV + NP e os mecanismos subjacentes contra células cancerígenas de mieloma

Citation:. Badr G, Al-Sadoon MK, Abdel-Maksoud MA, Rabah DM, El- Toni AM (2012) celular e Mecanismos moleculares fundamentam as actividades antitumorais exercida pelo

Walterinnesia aegyptia

Venom Combinado com nanopartículas de sílica contra vários tipos de células do cancro do mieloma. PLoS ONE 7 (12): e51661. doi: 10.1371 /journal.pone.0051661

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Agosto, 2012; Aceito: 06 de novembro de 2012; Publicação: 10 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Badr et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Plano Nacional de Ciência e Tecnologia (https://npst.ksu.edu.sa/index.php?module=news page=details_en id=40) financiado pelo rei Abdulaziz Cidade da Ciência e Tecnologia (http : //www.kacst.edu.sa/en/Pages/default.aspx) através do número projeto de 10 BIO969-02. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Todos os autores leram e concordaram o conteúdo do manuscrito e aprovou a apresentação. Os autores declaram não haver conflitos de interesse, estado de que o manuscrito não foi publicado ou submetido em outro lugar.

Introdução

malignidades hematológicas são um dos tipos mais prevalentes de câncer em humanos em todo o mundo e causar alta mortalidade taxas. À medida que o segundo cancro mais prevalente hematológica [1], mieloma múltiplo (MM) é uma doença maligna das células do plasma que aflige aproximadamente 20.000 e aproximadamente 10.000 mata pessoas nos Estados Unidos por ano [2]. As quimiocinas são uma grande família de baixo peso molecular (8-10 kDa) proteínas de citocinas do tipo que apresentam propriedades quimioatractivas para com os receptores de sete-transmembranares acoplados à proteína G em leucócitos [3]. Vários estudos revelaram a importância do papel de quimiocinas e seus receptores na patogénese de culas do MM [4]. Os receptores das quimiocinas foram demonstrados para ser expresso em células cancerosas e para agir durante todas as fases de progressão tumoral, incluindo a transformação neoplásica, a quimiotaxia e a invasão, angiogénese, crescimento e expansão clonal [5]. culas do MM expressar níveis variáveis ​​de receptores de quimiocina [6]. Dos numerosos receptores de quimiocinas expressas, CXCR4 é as outras células cancerosas mais altamente expresso em MM e muitas [7]. O ligando de CXCR4, CXCL12, é fortemente expresso no pulmão, fígado, medula óssea e gânglios linfáticos, que são todos os destinos metastáticos comuns para muitos tipos de cancro. Além disso, a regulação positiva de CXCR4 foi frequentemente observado em vários cancros, incluindo o carcinoma do cólon, do linfoma, do cancro da mama, glioblastoma, leucemia, cancro da próstata, cancro do pâncreas MM e [6]. Além disso, vários estudos têm demonstrado que a CXCR4 também é o mais abundante e funcional dos receptores de quimioquinas expressos por culas de MM, e, portanto, podem desempenhar um papel importante na patogénese da doença. Dados recentes sugerem o envolvimento de CXCL12 /CXCR4 na manutenção e na sobrevivência de células mm em ambos in vivo e modelos in vitro [8]. Todavia, após a estimulação dos receptores CXCR4 com CXCL12 em culas de MM, a activação de vias de sinalização a jusante permanece obscura e a compreensão de tais vias de sinalização representa um alvo molecular importante para o tratamento de MM [9]. factor nuclear kB (NF-kB) e AKT estão envolvidos em dois grandes percursos de sobrevivência celular, que são muitas vezes constitutivamente activadas em células cancerosas e contribuem substancialmente para a quimiorresistência de células de cancro [10]. No entanto, a inibição de fosforilação de ERK (um outro importante percurso de sobrevivência celular) contribui para a apoptose induzida por diidroartemisinina em cancro do fígado [11]. Os nossos dados recentes demonstraram que timoquinona (extracto vegetal natural) induz a paragem do crescimento celular mediante a anulação do MM sinalização e a quimiotaxia mediada por CXCL12, bem como aumentando os níveis de expressão de CD95 e a susceptibilidade destas células à apoptose mediada por Fas [12]. Vários relatórios têm elucidado que a incapacidade de sofrer apoptose tem sido implicada no desenvolvimento de tumores e resistência a terapia do cancro [13]. Por conseguinte, a indução de apoptose em culas de MM pode levar a sua regressão da doença e o prognóstico melhorado [14]. Assim, os agentes que são capazes de induzir a apoptose podem ser agentes quimioterapêuticos úteis contra MM. Na maioria das células tumorais, a apoptose ocorre através de duas vias de sinalização diferentes: a extrínsecas e intrínsecas vias de apoptose. A via intrínseca está relacionada com alterações no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) [15], e portanto, potenciais da membrana mitocondrial medições poderiam ser usados ​​para discriminar entre células que têm apoptosed e células sobreviventes. No entanto, a família de Bcl-2 de proteínas consiste de reguladores importantes de sinalização de apoptose, que muitas vezes são desviados em muitos cancros, incluindo o carcinoma do pulmão, linfoma, carcinoma da mama e MM [16]. Os membros desta família de proteínas podem ser divididas em antagonistas de morte, tais como Bcl-2, e agonistas de morte, tais como Bak, Bax e [17]. Da família Bcl-2, Bcl-2 é uma proteína anti-apoptótica prototípico que é frequentemente sobre-expressa em vários tipos de cancros humanos [18]. Bcl-2 sobre-expressão tem sido implicado no cancro quimiorresistência, enquanto altos níveis de proteínas pró-apoptóticas, tais como Bax, promovem a apoptose e sensibilizar as células tumorais a várias terapias anti-cancerosas.

Embora a paisagem de tratamento é MM mudando rapidamente, esta doença é em grande parte incurável [19]. Vários agentes quimioterapêuticos (por exemplo, vincristina, dexametasona e melfalano) são actualmente utilizados para o tratamento de MM. No entanto, estes fármacos têm a desvantagem de aumentar o risco de desenvolvimento de doenças malignas hematológicas secundários, tais como síndromas mielodisplásicas ligados às terapias [20]. Por conseguinte, existe uma necessidade crucial de identificar mais factores biológicos e mecanismos que são responsáveis ​​pela sobrevivência de células MM, tumorigénese e resistência às drogas [12].

Os compostos naturais têm sido usadas como adjuvantes em combinação com quimioterapia para reduzir o os efeitos secundários e aumentar a eficácia de tratamentos contra o cancro [21]. Nos últimos anos, numerosos produtos naturais foram avaliados quanto à sua utilização no tratamento do cancro [22], [23]. O veneno de cobra é uma mistura complexa de muitos substâncias com um amplo espectro de actividades biológicas, incluindo toxinas, enzimas, factores de crescimento, activadores e inibidores. toxinas naturais, especialmente as doses sub-letais de veneno de cobra, têm o potencial para reduzir o tamanho de tumores sólidos e de bloquear a angiogénese [24]. Os nossos estudos recentes demonstraram o potencial antitumoral de veneno de cobra de

Walterinnesia aegyptia

(WEV) na linha celular de carcinoma da mama humano MDA-MB-231, bem como o seu efeito sobre as células de murganho normal mononucleares de sangue periférico (PBMC) [25], [26]. Para além disso, outros dados indicaram que o

Vipera lebetina turanica

de veneno de cobra na gama de concentração nanograma inibe o crescimento de células de cancro humano da próstata refractário a hormonas, e o efeito está relacionado com a indução mediada por NFkB sinal de apoptose [27] . As nanopartículas que transportam terapias químicas têm mostrado uma grande promessa no tratamento de pacientes com câncer. Quando carregada com agentes anti-cancro, as nanopartículas podem aumentar com sucesso concentrações de droga nos tecidos e no acto de cancro a nível celular para aumentar a eficácia anti-tumoral. As nanopartículas podem ser sujeita a endocitose e /ou fagocitadas por células, resultando na internalização da droga encapsulada [28]. Não existem dados disponíveis para os efeitos do veneno de cobra em combinação com nanopartículas nas células cancerosas MM. Portanto, neste estudo, que investigou os efeitos da

Walterinnesia aegyptia

veneno (WEV), isoladamente e em combinação com nanopartículas de sílica (WEV + NP). Nós focada atenção especial sobre os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao anti-tumoral actividades exercidas sobre a migração, invasão, proliferação e apoptose de culas de MM primárias isoladas a partir de pacientes de MM, assim como 2 linhas celulares de MM humano (U266 e RPMI 8226).

Materiais e Métodos

Preparação de Walterinnesia aegyptia Venom

Walterinnesia aegyptia

cobras foram coletados a partir da região central da Arábia Saudita (Não foi necessário nenhum licenças específicas para foram necessários estudos de campo descritos, bem como não há permissões específicas para estes lugares /atividades porque a localização não é de propriedade privada ou protegida de qualquer forma e os estudos de campo não envolvem risco ou protegidas espécie). As cobras foram mantidos em um serpentário no Departamento da Faculdade de Ciências Zoologia da Universidade King Saud. As cobras foram aquecidos por dia durante nove horas, utilizando uma lâmpada de 100 watts, e a água estava sempre disponível. As cobras foram alimentados com camundongos criados de propósito a cada 10 a 14 dias. Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com as normas estabelecidas nas orientações para o cuidado e uso de animais de laboratório pela Comissão de efeitos de supervisão de experiências com animais (CPCSEA) e os Institutos Nacionais de protocolo de Saúde (NIH). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética animal do Departamento de Zoologia, Faculdade de Ciências, Universidade King Saud. O veneno foi ordenhadas de cobras adultos, liofilizadas e reconstituídas em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da utilização.

Combinação de veneno de cobra com Nanopartículas de Sílica

nanopartículas de sílica e a sua combinação com serpente veneno foram preparadas no Instituto Abdullah Rei de Nanotecnologia na Universidade king Saud. Duplos mesoporosos conchas de nanoesferas núcleo-sílica foram formadas em torno de núcleos de sílica, utilizando um agente tensioactivo aniónico num processo em que um núcleo de sílica sólido foi transformado para um mesoporoso. Em primeiro lugar, para a síntese de núcleos de sílica sólidos, 0,875 ml de amoníaco aquoso foi adicionado a uma solução contendo 18 ml de etanol e 2,6 ml de água desionizada, seguida pela adição de 1,5 ml de ortossilicato de tetraetilo (TEOS) à solução, com vigorosa agitação. A mistura resultante foi aquecida a 30 ° C durante 60 min, e o precipitado de sílica foi então recolhido por centrifugação e lavado três vezes com água. A composição molar da suspensão foi a seguinte: TEOS: EtOH: NH

3: H

= 2O 1:46.9:3.2:20.5

Em segundo lugar, para a síntese de mesoporoso com núcleo e camadas. nanoesferas usando um tensioactivo aniónico, de sílica SiO

2 partículas foram dispersos em 15 ml de H

2O por ultra-sons durante 10 min. Para suprimir de sílica núcleo aglomeração, 1 g /L de polivinilpirrolidona foi adicionado com agitação contínua durante 60 min. Em seguida, 0,1 ml, 0,2933 g (1 mmol) e 1,5 ml de 3-aminopropiltrimetoxissilano (STDA), foram adicionados N-lauroilsarcosina de sódio (Sar-Na) e TEOS, respectivamente, à mistura reaccional com agitação subsequente a 50 ° C durante 2 h. O sólido final foi recuperado por centrifugação, lavou-se com água desionizada e secou-se num forno a 60 ° C para a remoção de molde 12 h foi conseguida por tratamento térmico numa corrente de ar a 550 ° C durante 6 horas. A razão molar resultante era TEOS: H

2O: APMS: Sar-Na: HCl: PVP = 1:331.6:0.08:0.14:0.06:5 × 10

-3. Então, um total de 25 mg de nanopartículas de sílica mesoporosa foi adicionado a uma solução de 50 mg /mL de veneno em água. A suspensão foi agitada durante 2 horas; a evaporação de água foi impedida. nanopartículas de sílica mesoporosa carregados com veneno foram recuperados utilizando a centrifugação de alta velocidade e secou-se num forno de vácuo a 60 ° C. microscopia electrónica de transmissão análise (MET) foi efectuada utilizando um microscópio electrónico JEOL JSM-2100F (Japão) operado a 200 kV. isotermas de sorção de nitrogênio foram medidos a 77 K com uma Quantachrome NOVA 4200 analisador (EUA). Antes da medição, as amostras foram desgaseif içada sob vácuo a 200 ° C durante pelo menos 18 horas. O método de Brunauer-Emmett-Teller (BET), foi utilizada para calcular a área de superfície específica (

S

BET) usando dados de adsorção a uma gama de pressão relativa de 0,05 a 0,35. Utilizando o modelo de Barrett-Joyner-Halenda (BJH), as distribuições de tamanho de poros e volumes de poros foram derivados a partir dos ramos das isotérmicas de adsorção, e os volumes de poro total (

V t

) foram estimados a partir da quantidade adsorvida em uma pressão relativa

P

/

P

0 de 0,992.

no que diz respeito ao efeito do tempo de reação sobre a interacção entre as nanopartículas de sílica e veneno de cobra, a variação na síntese tempo de reacção de núcleos sólidos de sílica resultou na formação de duplas esferas de sílica de núcleo-revestimento mesoporoso, como mostrado na Figura 1. em ambos os S 1 e 6 h tempos de reacção foram observados, homogéneas conchas de sílica mesoporosa. No entanto, em um tempo de reacção de 1 h, os núcleos de sílica pareceu ser bastante densa. Estendendo o tempo de reacção até 6 h resultou em mesoporos e radialmente orientadas e pronunciáveis ​​claras que foram ancorados no interior do núcleo e se estendia desde o centro do núcleo para cima para a concha, como se mostra na Figura 1B S. A deterioração do contraste do núcleo com o aumento do tempo de reacção de 1 a 6 h sugeriu a ancoragem de mais mesoporos e a perda de densidade do núcleo, o qual também foi indicado pelo grande volume de poro. No entanto, a espessura do invólucro de cerca de 50 nm, não se alterou significativamente por meio do ajuste do tempo de reacção. A análise da distribuição do tamanho das partículas demonstraram que ambas as amostras exibida tamanhos de partícula de aproximadamente 300 nm. No entanto, a amostra de reacção de 6 h possuía uma distribuição mais estreita do que a amostra 1 h, como mostrado na Figura 2. A partir do S N

2 isotérmica de adsorção-dessorção mostrado na Figura S 3, as isotérmicas a diferentes tempos de reacção exibiu o surfactante tipo característico IV isotérmica de materiais mesoporosos com volumes de poros totais de 0,342 e 0,416 cc.g

-1 nos momentos h reacção 1 e 6, respectivamente. A observação de um ciclo de histerese triangular entre os ramos de adsorção e dessorção pode ser atribuída à coexistência de fases hexagonais e lamelar. As áreas de superfície BET foram 304,08 e 440,73 m

2 /g nos momentos h de reacção 1 e 6, respectivamente. É evidente que as características texturais de as estruturas de núcleo-revestimento mesoporosos foram reforçadas com o aumento do tempo de reacção.

Células e Reagentes

O RPMI8226 linhas celulares de MM humano e U266 foram obtidas a partir da American Type cultura Colecção (ATCC) (Rockville, MD). Estas culas de MM foram mantidas rotineiramente em P-10 meios de cultura (RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de vitela e 1% de L-glutamato), e as culturas foram estabelecidas a 5 × 10

5 células viáveis ​​/ml. densidade celular máxima foi estabelecida em 1-2 × 10

6 células /ml. As culturas celulares foram livre de

Mycoplasma

, tal como avaliado usando uma enzima-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Boehringer, Mannheim, Alemanha).

de medula óssea (BM) amostras de aspirado de 70 pacientes com MM foram obtidos do Instituto do Câncer do Sul Egito e do Hospital Universitário da Universidade de Assiut Assiut, no Egito. Células mononucleares da medula óssea foram isoladas por Ficoll-Hypaque de gradiente de densidade de centrifugação (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suécia) a partir de aspirado de heparinizado BM desenhada de pacientes de MM. As células plasmáticas foram ainda purificados a partir de células mononucleares de BM por selecção positiva com anticorpos anti-CD138 esferas imunomagnéticas revestidas com anticorpo de acordo com as instruções do fabricante (MACS, Miltenyi Biotech). purificação MACS consistentemente resultou em 95% de pureza na população de células MM primária (por monitorização da expressão da superfície da célula de CD38 e CD45) e uma viabilidade de . 90% (pelo método de exclusão de azul de tripano)

PBMC de dadores saudáveis, foram purificados utilizando um método de gradiente de Ficoll-Paque centrifugação padrão de acordo com as instruções do fabricante (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suécia). Resumidamente, sangue heparinizado foi diluído 1:01 em solução salina tamponada com fosfato (PBS), cuidadosamente em camadas sobre o gradiente de Ficoll-Paque e centrifugada durante 20 min a 1.020 x

g

. A camada de interface celular foi cuidadosamente colhido e as células foram lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em meio RPMI 1640.

O efeito anti-proliferativo de WEV, WEV + NP ou NP sozinho na U266 e linhas de células RPMI 8226 e as CMSPs normais isoladas foi determinada utilizando o 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) método de absorção. As células foram plaqueadas a 1 x 10

6 células /ml em 2 ml de meio de cultura de seis poços em placas Costar (Corning, Corning, NY). As células foram tratadas com diferentes concentrações de WEV ou WEV + NP por 1, 2, 6, 12, 24, 36 ou 48 h, e a citotoxicidade foi expressa como a percentagem relativa dos valores de densidade óptica medida no controlo não tratado (0), NP, WEV- e WEV + células NP-tratada. As alterações morfológicas foram observadas após a exposição ao NP, WEV e WEV + NP usando um microscópio de contraste de fase inversa (Olympus, Japão).

Ética Declaração

Para a coleta de cobra da região central da Arábia Saudita não permite específicas foram necessários para os estudos de campo descritos, bem como não há permissões específicas foram necessários para esses locais /atividades porque a localização não é de propriedade privada ou protegida de qualquer forma e os estudos de campo não envolvem risco ou protegidas espécies. Porque cobras foram alimentados com camundongos criados de propósito a cada 10 a 14 dias, Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com as normas estabelecidas nas orientações para o cuidado e uso de animais de laboratório pela Comissão de efeitos de supervisão de experiências com animais (CPCSEA) e os Institutos nacionais de protocolo de Saúde (NIH). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética animal do Departamento de Zoologia, Faculdade de Ciências, Universidade King Saud. amostras de aspirado BM foram obtidos de pacientes identificados com MM no Hospital Universitário de Assiut. Todos os aspectos deste estudo foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Assiut, e todos os pacientes forneceram um consentimento informado por escrito em conformidade com a Declaração de Helsinki.

Citometria de Fluxo

expressão do antígeno de superfície celular foi determinada pela única -parameter análise de separação de células activada por fluorescência (FACS) utilizando os seguintes anticorpos monoclonais (mAbs): (i) conjugado com PE anti-CCR1, anti-CCR3, anti-CCR5 (clone 45531,111), anti-CCR7 (clone 150503), anti-CCR6 (clone 53103,111), anti-CXCR3, CXCR4 anti-(clone 44717,111) e anti-CXCR5, todos adquiridos a partir de R D Systems; e (ii) conjugado com PE anti-CD38, anti-CD44 e anti-CD138 (IgG1), conjugado com FITC anti-CD62L, anti-CD49d, anti-VLA4, anti-α4β1, anti-α4β7 e anti-CD54, e FITC e de ratinho mAb de controlo do mesmo isotipo conjugado com PE, todos comprado a partir de BD Biosciences. Um instrumento de citometria de fluxo FACSCalibur (BD-Pharmingen) foi usado para a aquisição e análise de dados. Depois de gating células viáveis, foram analisados ​​15.000 eventos por amostra. Para cada marcador, o limiar de positividade foi definida para além da ligação não específica observada na presença de um mAb de controlo de isotipo correspondente.

F-actina polimerização Ensaio

MM células foram cultivadas durante 12 horas em meio de cultura suplementado com ou sem NP, ou WEV WEV + NP antes do teste de polimerização de F-actina. Intracelular polimerização F-actina foi avaliada como previamente descrito [29]. Resumidamente, as células foram colhidas e ressuspensas (4 × 10

6 /mL) em HEPES-tamponado com meio RPMI 1640 a 37 ° C com ou sem CXCL12 (250 ng /ml). Nos tempos indicados, adicionou-se suspensões de células (100 ul) a 400 ul de tampão de ensaio contendo 4 × 10

-7 M marcado com FITC-faloidina, 0,5 mg /ml de L-α-lisofosfatidilcolina (ambos da Sigma-Aldrich) e 4,5% de formaldeído em PBS. As células fixadas foram analisadas utilizando citometria de fluxo, e a intensidade de fluorescência média (IFM) foi determinada para cada amostra. A alteração percentual em IMF foi calculada para cada amostra em cada ponto de tempo, utilizando a fórmula seguinte: (1- (MFI antes da adição de CXCL12 /IMF após a adição de CXCL12) × 100.

In Vitro Os ensaios de quimiotaxia

A migração dependente de quimiocina de culas do MM foi medida utilizando um ensaio in vitro de migração de 2 câmaras em (usando placas Transwell comprados a partir de Costar, Cambridge, MA) seguido de análise de citometria de fluxo. Todos os ensaios de quimiotaxia foram realizados em pré tampão de migração -warmed (RPMI 1640 contendo 1% de FCS) Um total de 600 ul de tampão de migração sozinho ou suplementado com CXCL12 (a 250 ng /mL) (R D Systems). foi adicionado à câmara inferior, e 10

5 células em tampão de migração foram adicionadas à câmara superior. as placas foram então incubadas durante 3 h a 37 ° C, e as células de entrada e células transmigrou foram centrifugadas, fixada em 300 ul de 1 x PBS + 1% de formaldeído e contadas para 60 segundos por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD-Pharmingen). a percentagem de migração foi calculada como a percentagem de células de entrada, que migraram para a câmara inferior. Para calcular a percentagem de migração específica induzida por quimiocinas, a percentagem de células que migram para o meio sozinho foi subtraída da percentagem de células que migram para meio de quimiocinas

Análise Western Blot

Se não for tratada (0. ) ou NP, WEV-, e as células de mieloma tratados com NP WEV + (5 × 106 células /ml em pré-aquecido R-10 meio sem FCS) foram estimuladas durante 2 min a 37 ° C com ou sem 250 ng /mL CXCL12. Os lisados ​​foram preparados como anteriormente descrito [29]. Quantidades iguais (50 ug) de proteína celular total foram resolvidos utilizando electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e analisado por transferência de Western. Os anticorpos que reconhecem fosfo-PKB /AKT (S473), fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204), fosfo-IκBα (S32 /36), IκBα, fosfo-PLCβ3 (S537) e PLCβ3 (todos da New England Biolabs, Beverly, MA) e anti-Bcl-2, Bcl

XL, Mcl-1, Bax, Bak, Bim e anticorpos de p-actina (todos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foram usadas em combinação com peroxidase de rábano conjugada anticorpos secundários. As bandas de proteína foram detectadas utilizando reagentes de quimioluminescência amplificada (ECL, Supersignal Westpico substrato quimioluminescente, Perbio, Bezons, França), e o sinal de ECL foi gravado em Hyperfilm ECL. Para quantificar intensidades das bandas, filmes foram digitalizados, salvos como arquivos TIFF e analisados ​​utilizando software NIH Imagem J.

Para avaliar Rho-A activação, as células (5 × 10

6 por condição) foram fome de 2 h em pré-aquecido R-10 meio sem FCS, foram incubadas durante 2 min a 37 ° C com ou sem 250 ng /ml de CXCL12, e lisadas, como descrito acima (usando 200 ul de tampão de lise). Após a centrifugação, um alíquota de 15 ul do sobrenadante foi mantido como o total da amostra de lisado. O sobrenadante restante (185 ul) foi incubada durante 16 h a 4 ° C com GST-C21

38 pré-acoplados a esférulas de glutationa-agarose (Sigma, França). As esferas foram lavadas usando um excesso de tampão de lise, e a Rho-activa A (Rho-A

GTP puxado para baixo a partir do lisado e ligada à proteína de fusão /esferas) foi eluída utilizando tampão de amostra Laemli. Análise por SDS-PAGE e Western blotting utilizando um anticorpo anti-Rho-mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi subsequentemente realizada em ambos os lisados ​​de células totais e as amostras eluídas em tampão de Laemli para detectar total de Rho-A e Rho -A

GTP.

CFSE Ensaio de Proliferação

células MM foram colhidas, lavadas duas vezes em PBS e coradas com 0,63 mM carboxifluoresce�a éster diacetato succinimidil (CFSE) (Molecular Probes, Eugene, OR ) durante 8 minutos à temperatura ambiente. CFSE residual foi removido por lavagem três vezes em PBS, e as células CFSE-marcadas foram semeadas em placas de 6 poços, estimuladas ou não com a CXCL12, tratadas sem (0) ou com a NP, WEV e WEV + NP e cultivadas durante 4 dias em meio de cultura de células. A intensidade de fluorescência CFSE foi medida por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD-PharMingen).

apoptose Ensaios

Após o tratamento com NP, WEV e WEV + NP, células de mieloma foram recolhidos. As células foram lavadas e incubadas em PBS contendo 30% de soro AB humano a 4 ° C durante 30 min antes da coloração com anexina V-FITC e PI durante 15 min a 25 ° C, utilizando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (Abcam, Canadá ). As células foram analisadas por um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD-Pharmingen) dentro de 1 hora de coloração, e foi determinada a percentagem de células em apoptose.

mitocondrial potencial de membrana Medições

energização mitocondrial foi determinada pela a retenção de JC-1dye (Molecular Probes). Resumidamente, as células mm (5 × 10

5) foram carregadas com JC-1dye (1 ug /ml) durante os últimos 30 min de incubação a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. As células foram lavadas duas vezes em PBS. As células foram então lavadas com tampão FACS, ressuspensas e armazenada em 500 ul de solução de paraformaldeído a 2%. Aproximadamente 10

5 as células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD-Pharmingen). A fluorescência foi monitorizada num fluorómetro usando 570 nm de emissão de excitação 595 /nm para a J-agregados de JC-1. potencial de membrana mitocondrial (Δψ

M) foi calculada como a razão entre a fluorescência do (fase aquosa) JC-agregado e monómero (ligado à membrana) formas de JC-1. Portanto, o uso de JC-1 coloração nos kitallowed para discriminar entre as células em apoptose (cor verde) e células sobreviventes (cor vermelha).

Análise Estatística

Os dados foram testados para normalidade (usando o teste de Anderson-Darling) e para a homogeneidade da variância antes de qualquer análise estatística ulterior. Os dados eram normalmente distribuídos e são expressos como a média ± erro padrão da média (SEM). diferenças significativas entre os grupos foram analisados ​​utilizando uma análise de variância de uma ou duas vias, seguida de testes de comparações múltiplas de Bonferroni, utilizando software PRISM análise estatística (GraphPad Software). Os dados foram reanalisados ​​usando um de um ou dois way ANOVA seguido do pós-teste de Tukey usando SPSS (Statistical Package for Social Sciences) software, versão 17. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P 0,05. * P 0,05, WEV-tratados vs. controlo; # P 0,05, WEV + NP-tratados vs. controlo; + P 0,05, WEV + NP-tratados vs. WEV tratados

Resultados

WEV e WEV + NP inibir o crescimento de células do MM

Electron imagens de microscópio de. duplos nanoesferas core-shell de sílica mesoporosa (DMCSSs) antes (a) e depois (B) a carga de veneno são mostrados. Estas duas imagens demonstraram uma evidência para o carregamento de veneno de cobra em mesoporos de DMCSSs. -Venom livre DMCSSs (A) demonstraram mesoporos claras ou mesochannels. No entanto, como mostrado na Figura 1B mesoporos de DMCSSs foram entupidas pelas moléculas de veneno e, portanto, de mesoporos DMCSS carregadas com o veneno pode ser claramente visto, devido à existência de veneno dentro seus canais. Além disso, as moléculas de veneno pode ser também observada em torno da superfície exterior de DMCSSs. Zhao

et ai.

, Relataram que o tamanho de partícula para nanocarriers utilizados em sistemas de entrega de droga deve variar entre 50 e 300 nm [30]. Os autores descreveram que o tamanho de partícula acima de 300 nm, uma proporção significativa de partículas será retido nos pulmões e no fígado, enquanto que o tamanho de partícula muito pequeno não será eficaz para a carga de fármaco ou de administração de fármaco. Com base nestes critérios, a amostra DMCSSs-6h foi escolhido para veneno de carregamento de cobra, porque ele possuía propriedades de textura superior, área de superfície de 440 m

2 /g e volume total de poros de 0,416 cm

3 /g, silica mais grosso shell (40 nm) e tamanho de partícula aceitável. Além disso, nós recentemente caracterizado as propriedades ideais de modelo de nanopartículas de sílica que usamos para entregar os produtos naturais em linha de células MM, bem como em células normais [31].

imagens de microscopia eletrônica de duplas nanoesferas de sílica core-shell mesoporosos (DMCSSs) antes (a) e após (B) o carregamento de veneno. A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT. As células RPMI 8226 (C), as células U266 (D) e PBMC normais (E) foram tratadas durante a noite com diferentes concentrações (0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 e 1000 ng /ml) de NP (círculos abertos) , WEV (triângulos cinza) ou WEV + NP (fechado quadrados pretos). As células RPMI 8226 (F), as células U266 (G) e as CMSPs normais (H) foram tratadas com 25 ng /ml de NP (círculos abertos), 25 ng /mL de WEV (triângulos cinzento) ou 10 ng /ml de WEV + NP (fechado quadrados pretos) para diferentes tempos de incubação (0, 1, 2, 6, 12, 24, 36 e 48 h). Os dados recolhidos a partir de experimentos independentes (n = 5) são mostrados, e os resultados são expressos como a percentagem média de células viáveis ​​± SEM.

Usando estas nanopartículas modelo, primeiro investigaram a capacidade de WEV e WEV + NP para induzir a paragem do crescimento em culas do MM. Foram examinados os efeitos de WEV e WEV + NP em RPMI8226 (Figura 1C) e culas do MM (Figura 1D) U266 e em PBMCs humanas normais (Figura 1E), a concentrações de 0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 e